半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3在亞洲帶絳蟲(chóng)實(shí)驗(yàn)感染乳豬肝組織的表達(dá)

許士剛，牟 榮，張 科，楊 林，郎書(shū)源，包懷恩

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半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3在亞洲帶絳蟲(chóng)實(shí)驗(yàn)感染乳豬肝組織的表達(dá)

許士剛1,2，牟 榮1,2，張 科1,2，楊 林1,2，郎書(shū)源1,2，包懷恩1,2

目的 分析亞洲帶絳蟲(chóng)實(shí)驗(yàn)感染乳豬后囊尾蚴寄生處肝臟組織半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3(Cysteine aspartyl proteinase 3，Caspase-3)的表達(dá)變化情況，為探討Caspase-3在亞洲帶絳蟲(chóng)感染致乳豬肝損傷中的作用提供基礎(chǔ)資料。方法 將采自貴州省都勻市良畝鄉(xiāng)的亞洲帶絳蟲(chóng)孕節(jié)解剖后，以生理鹽水反復(fù)清洗并離心收集蟲(chóng)卵。20 d齡約克施格雜交乳豬12 頭隨機(jī)分為實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組各6 頭，實(shí)驗(yàn)組以定量蟲(chóng)卵15萬(wàn)個(gè)/頭灌胃感染，于感染后第15 d 和第75 d 解剖乳豬，取實(shí)驗(yàn)組囊尾蚴寄生處肝組織和對(duì)照組對(duì)應(yīng)部位肝組織，運(yùn)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR和免疫印跡方法分別定性定量分析Caspase-3在實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組中mRNA水平、蛋白水平的表達(dá)，并進(jìn)一步運(yùn)用免疫組織化學(xué)方法對(duì)Caspase-3在實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組中的蛋白表達(dá)水平和蛋白表達(dá)部位進(jìn)行分析和定位。結(jié)果 感染后第15 d，實(shí)時(shí)熒光定量PCR結(jié)果顯示實(shí)驗(yàn)組Caspase-3 mRNA水平低于對(duì)照組(P=0.011)，免疫印跡結(jié)果和免疫組化結(jié)果均顯示實(shí)驗(yàn)組Caspase-3蛋白表達(dá)量低于對(duì)照組(P=0.008，P=0.004)；此外，實(shí)驗(yàn)組感染后第75 d的Caspase-3 mRNA水平、蛋白表達(dá)量均高于實(shí)驗(yàn)組感染后第15 d 的樣本(P=0.018，P=0.003，P=0.002)；免疫組織化學(xué)結(jié)果顯示Caspase-3陽(yáng)性染色主要定位在肝細(xì)胞胞質(zhì)中，呈黃色或棕黃色。感染后第75 d 實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組各項(xiàng)結(jié)果差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)論 Caspase-3在亞洲帶絳蟲(chóng)感染早期的乳豬肝組織中低表達(dá)，而感染晚期正常表達(dá)，提示Caspase-3可能參與了亞洲帶絳蟲(chóng)致乳豬早期肝損傷的調(diào)節(jié)。

亞洲帶絳蟲(chóng)；半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3；乳豬；肝臟

近40年來(lái)，我國(guó)臺(tái)灣學(xué)者范秉真[1]及國(guó)外學(xué)者Eom[2]、Zarlenga[3]、Bowles[4]及Ito[5]等發(fā)現(xiàn)并證實(shí)在亞太地區(qū)流行一種外形極似牛帶絳蟲(chóng)的新蟲(chóng)種，稱為亞洲帶絳蟲(chóng)(Taeniaasiatica)。近年來(lái)，本課題組對(duì)采自中國(guó)大陸流行區(qū)的亞洲帶絳蟲(chóng)進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)動(dòng)物感染等方面的研究[6-8]，發(fā)現(xiàn)其實(shí)驗(yàn)感染乳豬后可致乳豬肝損傷和肝細(xì)胞凋亡。正常的肝細(xì)胞凋亡在肝臟代謝中扮演重要角色，不受調(diào)控的持續(xù)性的病理性肝細(xì)胞凋亡在肝損傷的發(fā)生、發(fā)展中起了較為重要的作用[9]。半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶(Caspase)家族是一類與細(xì)胞凋亡相關(guān)的蛋白酶家族，Caspase家族是細(xì)胞凋亡過(guò)程中的關(guān)鍵元件，其激活與超常表達(dá)均引起細(xì)胞凋亡，因此又稱死亡蛋白酶，可通過(guò)與眾多蛋白因子的相互作用調(diào)控細(xì)胞凋亡[10]，其中Caspase-3是Caspase家族中最重要的凋亡執(zhí)行者[11]，是細(xì)胞凋亡過(guò)程中的主要效應(yīng)因子，是多種凋亡刺激信號(hào)傳遞的匯聚點(diǎn)，負(fù)責(zé)對(duì)全部或部分關(guān)鍵性蛋白的酶切，使胞質(zhì)、胞核及細(xì)胞骨架的重要蛋白酶失活，引發(fā)細(xì)胞凋亡。目前，國(guó)內(nèi)外學(xué)者對(duì)寄生蟲(chóng)感染宿主引起組織細(xì)胞Caspase-3表達(dá)變化進(jìn)行了廣泛的研究，主要涉及衛(wèi)氏并殖吸蟲(chóng)[12]、豬帶絳蟲(chóng)[13]、曼氏血吸蟲(chóng)[14]、廣州管圓線蟲(chóng)[15]、剛地弓形蟲(chóng)[16]、細(xì)粒棘球絳蟲(chóng)[17]和旋毛蟲(chóng)[18]等，但尚無(wú)亞洲帶絳蟲(chóng)感染對(duì)宿主組織細(xì)胞Caspase-3表達(dá)變化的研究。因此，本研究在已建立的亞洲帶絳蟲(chóng)實(shí)驗(yàn)感染乳豬動(dòng)物模型基礎(chǔ)上，分別采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR、免疫印跡和免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)感染后第15 d和第75 d乳豬肝組織中Caspase-3的表達(dá)，為進(jìn)一步深入研究亞洲帶絳蟲(chóng)感染致乳豬肝損傷的分子病理機(jī)制提供基礎(chǔ)資料。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 蟲(chóng)體來(lái)源 蟲(chóng)體采自貴州省都勻市良畝鄉(xiāng)絳蟲(chóng)癥患者，經(jīng)口服檳榔煎劑-生南瓜籽-硫酸鎂驅(qū)蟲(chóng)，經(jīng)形態(tài)學(xué)觀察和分子生物學(xué)鑒定，確定采集蟲(chóng)體為亞洲帶絳蟲(chóng)。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 12頭20 日齡約克施格雜交乳豬購(gòu)自貴州省龍里縣種豬養(yǎng)殖場(chǎng)，體重3.0～4.6 kg，體健，經(jīng)糞檢和間接凝集實(shí)驗(yàn)證實(shí)無(wú)寄生蟲(chóng)感染。

1.1.3 主要試劑和儀器 主要試劑Trizol、熒光定量PCR試劑盒和cDNA合成試劑盒分別購(gòu)自美國(guó)Sigma公司、日本Takara公司和北京康為世紀(jì)公司，PCR引物由上海生工生物工程有限公司合成，動(dòng)物全蛋白提取試劑盒、BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒、聚偏二氟乙烯(polyvinylidene fluoride, PVDF)膜、3，3-二氨基聯(lián)苯胺(Diaminobenzidine, DAB)顯色試劑盒、BCA蛋白濃度定量試劑盒均購(gòu)自美國(guó)Life Sciences公司，Caspase-3(SC-98785，兔抗豬)、β-actin(SC-47778，鼠抗豬)、IgG-HRP(SC-2005，羊抗鼠)和IgG-HRP(SC-2004，羊抗兔)均購(gòu)自美國(guó)Santa-Cruz公司。主要儀器實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀、凝膠成像系統(tǒng)均為美國(guó)Bio-Rad公司產(chǎn)品, 型號(hào)分別為CFX-96和ChemiDoc TMXRS+，Nikon科研級(jí)成像系統(tǒng)為日本Nikon公司產(chǎn)品，型號(hào)為Nikon DS-RI2。

1.2 方法

1.2.1 蟲(chóng)卵收集和計(jì)數(shù) 取每條亞洲帶絳蟲(chóng)的末段孕節(jié)，在生理鹽水中以注射器針頭沿縱軸劃破孕節(jié)使蟲(chóng)卵溢出，并用生理鹽水反復(fù)淘洗，2 000 r/min，離心20 min，收集蟲(chóng)卵備用。光學(xué)顯微鏡下觀察收集的蟲(chóng)卵并分別反復(fù)計(jì)數(shù)5 次，取平均值，將1 mL生理鹽水中蟲(chóng)卵數(shù)定量為15萬(wàn)個(gè)，4 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物感染和標(biāo)本采集 乳豬隨機(jī)分為實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組各6頭，實(shí)驗(yàn)組乳豬以定量蟲(chóng)卵15萬(wàn)個(gè)/頭通過(guò)胃管灌胃感染。感染之初2組乳豬分開(kāi)飼養(yǎng)，7 d后混養(yǎng)，整個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程中嚴(yán)格實(shí)行封閉飼養(yǎng)。于感染后第15 d和第75 d分別隨機(jī)處死實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組乳豬各3 頭，采集實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組肝組織。將剝除囊尾蚴的實(shí)驗(yàn)組肝組織和對(duì)照組肝組織放入有或無(wú)1 mL Trizol的EP管內(nèi)再置于-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆茫⑽磩兂椅豺实膶?shí)驗(yàn)組和對(duì)照組肝組織置于4%多聚甲醛固定后室溫保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 根據(jù)GenBank相關(guān)序列，使用Primer Express 5.0軟件設(shè)計(jì)Caspase-3和內(nèi)參基因(β-actin)實(shí)時(shí)熒光定量PCR引物，并由上海生工生物公司合成(表1)。采用Trizol一步法提取各組乳豬肝組織總RNA，按試劑盒說(shuō)明操作獲得cDNA。PCR反應(yīng)條件:95 ℃預(yù)變性30 s，95 ℃變性5 s，59.4 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共40 個(gè)循環(huán)。記錄熒光定量PCR儀得出的各組Caspase-3和內(nèi)參基因β-actin的CT值，重復(fù)3 次取平均值。計(jì)算目的基因Caspase-3的△△CT值，△△CT=(CT目的基因-CTβ-actin)-(CT對(duì)照組-CTβ-actin)，采用2-△△CT法計(jì)算出各組目的基因的相對(duì)表達(dá)量。

表1 實(shí)時(shí)熒光定量PCR引物

Tab.1 Primers of quantitative real-time PCR

GenePrimersequence(5′?3′)Fragmentlength(bp)Caspase?3F：AAGCCTGGAAGA?TGATGTGGR：CCTGAAACAATG?CCTGAGC140β?actinF：TCTGGCACCACACCT?TCTR：TGATCTGGGTCA?TCTTCTCAC114

1.2.4 免疫印跡法 取-80 ℃冰箱保存的肝臟組織約90 mg，用動(dòng)物蛋白提取試劑盒提取總蛋白，并用BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒測(cè)定蛋白濃度，各組樣品等量上樣，經(jīng)SDS-PAGE電泳分離(積成膠電壓40 V, 分離膠電壓100 V)后將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜并封閉過(guò)夜，室溫下分別加入一抗Caspase-3(1∶200)和內(nèi)參β-actin(1∶500)，孵育2 h 后加入辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的二抗(1∶8 000)作用1 h，凝膠成像系統(tǒng)曝光，用IMAGEL3.0軟件(Bio-Rad公司)測(cè)定各條帶的光密度值，經(jīng)內(nèi)參β-actin校正后，取Caspase-3/β-Actin比值為蛋白的表達(dá)量。

1.2.5 免疫組織化學(xué)法 將保存于4%多聚甲醛中的肝組織進(jìn)行石蠟包埋、切片、脫蠟、脫水、過(guò)氧化氫阻斷內(nèi)源性過(guò)氧化物酶、蛋白酶K修復(fù)，然后加入一抗Caspase-3(1∶100) 4 ℃孵育過(guò)夜，辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的二抗(1∶500)37 ℃孵育30 min、DAB顯色60 s、蘇木素復(fù)染30 s、脫色30 s、中性樹(shù)膠封片后顯微鏡下觀察，PBS代替一抗作為陰性對(duì)照。結(jié)果判定：顯微鏡下觀察，Caspase-3陽(yáng)性染色主要定位在肝細(xì)胞胞質(zhì)中，呈黃色至棕黃色。感染后第15 d和75 d實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組各取10個(gè)樣本，每個(gè)樣本取10個(gè)視野，觀察免疫組化陽(yáng)性物的分布，使用Image Pro plus 6.0軟件測(cè)定每個(gè)樣品平均光密度值，即每個(gè)視野陽(yáng)性物光密度值和陽(yáng)性物區(qū)域面積的比值，平均光密度值和蛋白表達(dá)量呈正相關(guān)。

2 結(jié) 果

2.1 亞洲帶絳蟲(chóng)蟲(chóng)卵感染情況 亞洲帶絳蟲(chóng)蟲(chóng)卵能感染約克施格雜交乳豬，感染后第15 d，實(shí)驗(yàn)組肝臟可見(jiàn)白色細(xì)小點(diǎn)狀結(jié)構(gòu)，未見(jiàn)清晰囊尾蚴結(jié)構(gòu)，見(jiàn)圖1A；感染后第75 d，實(shí)驗(yàn)組大多數(shù)囊尾蚴鈣化，見(jiàn)圖1B。

A:亞洲帶絳蟲(chóng)囊尾蚴感染后第15 d乳豬肝臟，↑示未成熟的囊尾蚴；B：亞洲帶絳蟲(chóng)囊尾蚴感染后第75 d的乳豬肝臟，↑示鈣化的囊尾蚴。A：Liver of porket at day 15 post-infection after oral challenge by T. asiatica，↑ indicated immature cysticercus; B：Liver of porket at day 75 post-infection after oral challenge by T. asiatica,↑ indicated calcified cysticercus.圖1 亞洲帶絳蟲(chóng)囊尾蚴感染不同時(shí)間的約克施格雜交乳豬肝臟Fig.1 Liver of Yorkshire and Seghers hybrid porkets at day 15 and day 75 post-infection after oral challenge by T. asiatica

2.2 實(shí)時(shí)熒光定量PCR結(jié)果 感染后第15 d，實(shí)驗(yàn)組Caspase-3 mRNA水平低于對(duì)照組，而實(shí)驗(yàn)組感染后第75 d的Caspase-3 mRNA水平高于感染后第15 d，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.011，P=0.018)；感染后第75 d，實(shí)驗(yàn)組Caspase-3 mRNA水平相對(duì)正常組無(wú)明顯變化，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.221)，見(jiàn)圖2。

圖2 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)亞洲帶絳蟲(chóng)感染后第15 d和第75 d乳豬肝組織Caspase-3的mRNA水平Fig.2 mRNA level of Caspase-3 of liver tissues from porkets of experimental and control groups by quantitative real time PCR at day 15 and day 75 post-infection after oral challenge by T. asiatica

2.3 免疫印跡法檢測(cè)肝組織Caspase-3蛋白表達(dá)結(jié)果 免疫印跡實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組內(nèi)參β-actin表達(dá)量一致(見(jiàn)圖3A)，即該實(shí)驗(yàn)各組蛋白上樣量一致，在此基礎(chǔ)上，感染后第15 d實(shí)驗(yàn)組Caspase-3表達(dá)量低于對(duì)照組，而感染后第75 d實(shí)驗(yàn)組Caspase-3表達(dá)量高于感染后第15 d實(shí)驗(yàn)組Caspase-3表達(dá)量；感染后第75 d，實(shí)驗(yàn)組Caspase-3的亮度和對(duì)照組基本一致(見(jiàn)圖3A)。經(jīng)IMAGEL3.0及SPSS19.0軟件統(tǒng)計(jì)處理及內(nèi)參β-actin校正后，如圖3B所示，感染后第15 d，實(shí)驗(yàn)組Caspase-3蛋白表達(dá)量低于對(duì)照組，而感染后75 d，Caspase-3蛋白表達(dá)量高于感染后第15 d，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.008，P=0.003)，感染后第75 d，實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組Caspase-3蛋白表達(dá)無(wú)明顯差異 (P=0.599)。

2.4 免疫組織化學(xué)法檢測(cè)肝組織Caspase-3蛋白表達(dá)結(jié)果 顯微鏡下觀察肝組織切片免疫組化結(jié)果顯示實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組均可見(jiàn)肝細(xì)胞胞質(zhì)被染成黃色至棕黃色(圖4A—D)。感染后第15 d，實(shí)驗(yàn)組肝組織Caspase-3平均光密度值低于對(duì)照組，而感染后第75 d，實(shí)驗(yàn)組肝組織Caspase-3平均光密度值高于感染后第15 d，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.004，P=0.002)，感染后第75 d，實(shí)驗(yàn)組肝組織Caspase-3平均光密度值較對(duì)照組無(wú)明顯變化，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.531，P=0.231)(見(jiàn)圖5)。

A：免疫印跡法檢測(cè)感染后第15 d和第75 d乳豬肝組織Caspase-3蛋白表達(dá)結(jié)果；B：感染后第15 d和第75 d乳豬肝組織Caspase-3蛋白表達(dá)量的統(tǒng)計(jì)圖。A：The result of western blot for Caspase-3 and β-actin of experimental and control groups at indicated time points; B：The histogram for the expression level of Caspase-3 of experimental and control groups at indicated time points.圖3 免疫印跡法檢測(cè)亞洲帶絳蟲(chóng)感染后第15 d和第75 d乳豬肝組織Caspase-3蛋白的表達(dá)Fig.3 Expression level of Caspase-3 from liver tissue of porkets by western blot assay at day 15 and day 75 post-infection after oral challenge by T. asiatica

A： 感染后第15 d對(duì)照組乳豬肝組織Caspase-3蛋白免疫組化結(jié)果；B：感染后第15 d實(shí)驗(yàn)組乳豬肝組織Caspase-3免疫組化結(jié)果；C： 感染后第75 d對(duì)照組乳豬肝組織Caspase-3蛋白免疫組化結(jié)果；D：感染后第75 d實(shí)驗(yàn)組乳豬肝組織Caspase-3免疫組化結(jié)果。(A-D放大倍數(shù)=400倍)A：The representative section of liver tissue from control group porkets at day 15 post-inoculated by immunohistochemistry; B：The representative section of liver tissue from experimental group porkets at day 15 post-infection by immunohistochemistry; C：The representative section of liver tissue from control group porkets at day 75 post-inoculated by immunohistochemistry; D：The representative section of liver tissue from experimental group porkets at day 75 post-infection by immunohistochemistry.(A-D：Original magnification 400×)圖4 免疫組織化學(xué)法檢測(cè)亞洲帶絳蟲(chóng)感染后第15 d和第75 d乳豬肝組織Caspase-3蛋白表達(dá)Fig.4 Expression of Caspase-3 of liver tissue from T. asiatica oral challenged porkets by immunohistochemistry assay at day 15 and day 75 post-infection

圖5 感染后第15 d和第75 d乳豬肝組織Caspase-3平均光密度值Fig.5 Average optical density of Caspase-3 in liver tissues of porkets from experimental and control groups at day 15 and day 75 post-infection

3 討 論

1972年Kerr[19]首次提出了細(xì)胞凋亡概念,細(xì)胞凋亡也稱程序性細(xì)胞死亡(programmed cell death，PCD)，是一個(gè)生理性的細(xì)胞自我毀滅的過(guò)程，也是機(jī)體清除感染、變異及衰老細(xì)胞而維持自身生理狀態(tài)的主要調(diào)節(jié)方式之一。有研究表明[20]，凋亡主要由以下幾個(gè)步驟完成：接受凋亡信號(hào)后啟動(dòng)細(xì)胞凋亡程序；促凋亡蛋白的激活；引發(fā)Caspase級(jí)聯(lián)反應(yīng)裂解靶蛋白；細(xì)胞器的降解；細(xì)胞凋亡小體的破碎。細(xì)胞凋亡主要由凋亡受體途徑、線粒體途徑、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)途徑、細(xì)胞核凋亡途徑、高爾基體和溶酶體凋亡途徑以及凋亡基因控制，各途徑互相聯(lián)系，共同調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡，其中Caspase在細(xì)胞凋亡的各個(gè)途徑中發(fā)揮重要的作用。Caspase家族是哺乳動(dòng)物細(xì)胞中程序性死亡的介導(dǎo)者和執(zhí)行者，目前，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)Caspase包括Caspase1～13，它們可分別在炎癥和細(xì)胞凋亡中起到不同的作用。目前認(rèn)為[11]Caspase-3處于細(xì)胞凋亡的執(zhí)行者中的核心地位，Caspase-3是Caspase家族中最重要的凋亡執(zhí)行者。

肝細(xì)胞的凋亡具有兩面性,一方面肝細(xì)胞凋亡是機(jī)體對(duì)抗感染、腫瘤及防止自身免疫反應(yīng)的自衛(wèi)措施,另一方面大量的肝細(xì)胞凋亡常伴有肝細(xì)胞壞死,可引起肝臟結(jié)構(gòu)和功能的損傷。本課題組既往研究發(fā)現(xiàn)亞洲帶絳蟲(chóng)感染乳豬后不同時(shí)期可引起家豬肝臟的急性、慢性炎癥反應(yīng)和纖維化等病理性損傷，并且感染中期和晚期均存在肝細(xì)胞凋亡[8,21]。呂鵬[22]等研究發(fā)現(xiàn)雖然肝細(xì)胞凋亡與肝細(xì)胞壞死貫穿于肝纖維化的整個(gè)病變過(guò)程,但二者在肝纖維化的不同時(shí)期所處的主導(dǎo)地位不同。本研究結(jié)果顯示感染后第15 d實(shí)驗(yàn)組Caspase-3 mRNA水平和Caspase-3蛋白的表達(dá)量均低于對(duì)照組，但感染后第75 d實(shí)驗(yàn)組較正常對(duì)照組無(wú)明顯變化，但實(shí)驗(yàn)組感染后第75 d的Caspase-3 mRNA水平和蛋白表達(dá)量均高于實(shí)驗(yàn)組感染后第15 d的樣本。結(jié)合既往研究結(jié)果，說(shuō)明Caspase-3可能參與了亞洲帶絳蟲(chóng)感染致乳豬早期肝損傷的調(diào)節(jié)。研究已發(fā)現(xiàn)感染早期乳豬肝細(xì)胞有點(diǎn)片狀壞死而無(wú)明顯凋亡，可能因早期入侵的亞洲帶絳蟲(chóng)幼蟲(chóng)主要導(dǎo)致乳豬肝細(xì)胞壞死，抑制了肝細(xì)胞的凋亡，這與本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)感染早期Caspase-3在實(shí)驗(yàn)組乳豬肝組織中低表達(dá)的結(jié)果正好吻合，據(jù)此推測(cè)早期入侵的亞洲帶絳蟲(chóng)幼蟲(chóng)可能對(duì)肝細(xì)胞凋亡相關(guān)Caspase-3的表達(dá)有抑制作用。此外，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明亞洲帶絳蟲(chóng)感染晚期乳豬肝細(xì)胞凋亡與Caspase-3無(wú)關(guān)，可能有其它的凋亡蛋白以及凋亡途徑發(fā)揮作用，有待進(jìn)一步研究。

目前有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)Caspase-3的表達(dá)量與寄生蟲(chóng)感染致宿主組織細(xì)胞凋亡的程度呈正相關(guān)。李江輝[15]等發(fā)現(xiàn)廣州管圓線蟲(chóng)幼蟲(chóng)致小鼠腦組織細(xì)胞凋亡程度和Caspase-3的表達(dá)量呈正相關(guān)。周永華[16]等發(fā)現(xiàn)慢性剛地弓形蟲(chóng)感染致大鼠海馬神經(jīng)細(xì)胞凋亡的程度和Caspase-3的表達(dá)量呈正相關(guān)。Chen[14]等發(fā)現(xiàn)感染血吸蟲(chóng)的小鼠通過(guò)降低Caspase-3的表達(dá)抑制肝細(xì)胞凋亡，從而起到保護(hù)肝臟的作用。此外，有學(xué)者發(fā)現(xiàn)肝臟疾病中Caspase-3的低表達(dá)與細(xì)胞凋亡的抑制有關(guān)。金雷[23]等發(fā)現(xiàn)原發(fā)性肝細(xì)胞癌患者的肝組織中Caspase-3的低表達(dá)可能與肝癌細(xì)胞的凋亡障礙有關(guān)。黃慧[24]等在內(nèi)毒素對(duì)肝細(xì)胞凋亡變化的研究中發(fā)現(xiàn)通過(guò)下調(diào)Caspase-3在肝臟的表達(dá)能抑制肝細(xì)胞凋亡，從而發(fā)揮保護(hù)肝臟的作用。結(jié)合本研究結(jié)果，我們推測(cè)：亞洲帶絳蟲(chóng)感染致乳豬早期肝損傷的過(guò)程中通過(guò)Caspase-3的低表達(dá)，抑制肝細(xì)胞凋亡，可能對(duì)肝臟有保護(hù)作用。亞洲帶絳蟲(chóng)幼蟲(chóng)致中間宿主乳豬肝細(xì)胞凋亡的分子機(jī)制是一個(gè)復(fù)雜的過(guò)程，Caspase-3是通過(guò)哪些信號(hào)通路及凋亡途徑來(lái)調(diào)節(jié)肝細(xì)胞的凋亡尚有待進(jìn)一步研究。還有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)寄生蟲(chóng)感染可通過(guò)Caspase-3介導(dǎo)宿主炎性細(xì)胞凋亡而發(fā)揮免疫逃避作用。Ernatus[13]等用免疫組織化學(xué)方法研究含有囊尾蚴的豬腦組織中Caspase-3的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)Caspase-3可能通過(guò)以介導(dǎo)炎癥細(xì)胞凋亡方式而在囊尾蚴對(duì)宿主的免疫逃避中發(fā)揮作用。Min[12]等研究表明在衛(wèi)氏并殖吸蟲(chóng)感染人體的過(guò)程中，通過(guò)Caspase-3介導(dǎo)嗜酸性粒細(xì)胞凋亡，從而逃避宿主的免疫反應(yīng)。楊宏強(qiáng)[17]等在棘球蚴感染小鼠過(guò)程中，Caspase-3誘導(dǎo)宿主單核細(xì)胞發(fā)生凋亡，從而逃避宿主的免疫反應(yīng)。亞洲帶絳蟲(chóng)感染乳豬的過(guò)程中，是否通過(guò)Caspase-3介導(dǎo)乳豬炎性細(xì)胞凋亡而使幼蟲(chóng)逃避宿主的免疫反應(yīng)值得進(jìn)一步深入研究。

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Mou Rong, Email：mourong@gmc.edu.cn

Expression of cysteine aspartyl proteinase 3 from liver tissues of the porkets experimentally infected byTaeniaasiatica

XU Shi-gang1,2, MOU Rong1,2, ZHANG Ke1,2, YANG Lin1,2, LANG Shu-yuan1,2, BAO Huai-en1,2

(1.DepartmentofParasitology,GuizhouMedicalUniversity,Guiyang550025,China; 2.LaboratoryofPathogenBiology,GuizhouMedicalUniversity,Guiyang550025,China)

In order to provide substantial scientific information for exploring the mechanism of porcine liver injury caused byTaeniaasiatica(T.asiatica), the expression of Cysteine aspartyl proteinase 3 (Caspase-3) from liver tissues of porkets that were experimentally infected byT.asiaticawas examined. TheT.asiaticaadults were collected from the taeniasis patients in Duyun, Guizhou Province and identified biologically. The eggs were harvested from gravid proglottids and prepared by repeated washing and centrifugation. Twelve 20-days old Yorkshire and Seghers hybrid porkets were randomly divided into experimental and control groups as six pigs per group. The experimental group was orally administrated with 1.5×106eggs per porket at day 0 post-infection. The porkets of both groups were sacrificed on the day 15 and day 75 post-infection (three pigs per time point) respectively, and liver samples were collected for further experiments. Quantitative real-time polymerase chain reaction method was employed to detect the mRNA levels of Caspase-3, and western blotting and immunohistochemistry methods were performed to detect the level of Caspase-3 expression in both groups. At the day 15 post-infection, the mRNA level and expression level of Caspase-3 of the experimental group were significantly decreased, comparison with the control group (P=0.011,P=0.008 andP=0.004 respectively). It was positive with Caspase-3 when yellow or brown signal appeared in the cytoplasm of liver cells by immunohistochemistry. However, at the day 75 post-infection, the mRNA level and expression level of Caspase-3 of the experimental group were dramatically similar to the control group. Furthermore, in the experimental group, the mRNA level and expression level of Caspase-3 were significantly increased at day 75 post-infection than day 15 post-infection (P=0.018,P=0.003 andP=0.002 respectively). These results suggested that Caspase-3 might be involved into the regulation of the damage of porcine liver induced byT.asiaticachallenge at the early infection stage and have on effect to the hepatic injury because of the dramatic recovery of Caspase-3 at the consequent infection stage.

Taeniaasiatica; cysteine aspartyl proteinase 3; porket; liver

10.3969/j.issn.1002-2694.2017.04.007

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(No.81160205)、貴州省優(yōu)秀科技教育人才省長(zhǎng)資金項(xiàng)目(黔省專合字[2008]55號(hào))和貴州省留學(xué)人員科技創(chuàng)新項(xiàng)目(黔人項(xiàng)目資助合同[2015]1號(hào))聯(lián)合資助

牟 榮,Email:mourong@gmc.edu.cn

1.貴州醫(yī)科大學(xué)寄生蟲(chóng)學(xué)教研室，貴陽(yáng) 550025； 2.貴州醫(yī)科大學(xué)病原生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室，貴陽(yáng) 550025

Supported by the National Natural Science Foundation of China (No. 81160205), the Specific Fund of Provincial Government in Guizhou Province (No.[2008]55), and the Science and Innovation Foundation of Guizhou Province for Returned Chinese Scholars (No. [2015]1)

R383.3

A

1002-2694(2017)04-0326-06

2016-11-14 編輯：劉岱偉