酶法水解乳糖與熱處理偶聯(lián)對(duì)牛乳Maillard反應(yīng)的影響

李思寧，唐善虎,*，胡 洋，毛濛蘭，劉 媛

（1.西南民族大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，四川 成都 610041；2.新希望乳業(yè)控股有限公司技術(shù)中心，四川 成都 610040）

酶法水解乳糖與熱處理偶聯(lián)對(duì)牛乳Maillard反應(yīng)的影響

李思寧1，唐善虎1,*，胡 洋1，毛濛蘭1，劉 媛2

（1.西南民族大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，四川 成都 610041；2.新希望乳業(yè)控股有限公司技術(shù)中心，四川 成都 610040）

旨在探討乳糖水解程度及熱處理方法與Maillard反應(yīng)的關(guān)系，鮮牛乳用中性乳糖酶處理獲得不同水解程度的低乳糖牛乳，然后對(duì)牛乳進(jìn)行不同的熱處理，處理后的樣本進(jìn)行Maillard反應(yīng)程度評(píng)價(jià)。采用葡萄糖氧化酶法測(cè)定不同水解時(shí)間的牛乳中葡萄糖質(zhì)量濃度和乳糖水解率，用高效液相色譜法和紫外分光光度法分別測(cè)定水解后牛乳經(jīng)不同熱處理后的糠氨酸和5-羥甲基糠醛（5-hydroxymethylfurfural，5-HMF）含量及牛乳褐變程度的OD值。結(jié)果表明，隨著乳糖水解時(shí)間的延長(zhǎng)，牛乳中的葡萄糖含量呈增加的趨勢(shì)，葡萄糖質(zhì)量濃度從0.00 mg/100 mL增加到1 721.33 mg/100 mL，但增加趨勢(shì)逐漸變緩；乳糖水解率從0%增加到70.33%，水解時(shí)間2.0 h后的牛乳水解率達(dá)到了50%以上?？钒彼岷砍噬仙内厔?shì)（P＜0.05），水解時(shí)間在3.0 h以上并經(jīng)75 ℃、30 min熱處理的牛乳，糠氨酸含量超過(guò)了190 mg/100 g pro；水解時(shí)間為0.5 h及以上并經(jīng)75 ℃、15 s熱處理的牛乳，糠氨酸含量超過(guò)了12 mg/100 g pro。生鮮牛乳和水解后經(jīng)75 ℃、30 min熱處理的牛乳，均未檢測(cè)到5-HMF，水解后經(jīng)75 ℃、15 s熱處理的牛乳，隨乳糖水解時(shí)間的延長(zhǎng)，牛乳中5-HMF含量增加顯著（P＜0.05）。牛乳的褐變程度隨乳糖水解時(shí)間顯著增加（P＜0.05），且乳糖酶水解后75 ℃、30 min熱處理的牛乳的褐變程度明顯高于75 ℃、15 s熱處理的牛乳。本研究結(jié)果說(shuō)明，乳糖經(jīng)過(guò)酶水解后的牛乳，長(zhǎng)時(shí)間熱處理會(huì)加重乳Maillard反應(yīng)，影響乳的蛋白質(zhì)品質(zhì)。

牛乳；乳糖水解；Maillard反應(yīng)；糠氨酸；5-羥甲基糠醛

牛乳含有促進(jìn)人類生長(zhǎng)發(fā)育以及維持健康水平的必需營(yíng)養(yǎng)成分，是一種重要的飲食資源[1]。但由于牛乳中的乳糖不能被乳糖不耐人群消化和吸收，極易引發(fā)乳糖不耐受現(xiàn)象，使牛乳資源的利用受到限制。因此，針對(duì)這些人群開發(fā)低乳糖牛乳，即牛乳中的乳糖經(jīng)乳糖酶適度水解后生產(chǎn)的牛乳，是企業(yè)十分感興趣的課題。然而，牛乳中的乳糖經(jīng)水解后，生成半乳糖和葡萄糖，經(jīng)過(guò)必要的熱處理后更易發(fā)生Maillard反應(yīng)，而造成牛乳營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和感官品質(zhì)的降低[2-3]。因此，有必要研究熱處理對(duì)酶法水解乳糖牛乳Maillard反應(yīng)的影響。

通常認(rèn)為，乳制品中的糠氨酸是乳糖與氨基酸、蛋白質(zhì)在高溫條件下發(fā)生Maillard反應(yīng)的產(chǎn)物[4]。牛乳在加熱過(guò)程中，氨基酸、蛋白質(zhì)與乳糖通過(guò)Maillard反應(yīng)生成ε-N-脫氧乳果糖基-L-賴氨酸，經(jīng)酸水解生成更穩(wěn)定的糠氨酸（ε-N-2-呋喃甲基-L-賴氨酸）[5]。以下一些研究報(bào)道表明：還原糖與蛋白質(zhì)受熱發(fā)生Maillard反應(yīng)，也生成糠氨酸。Marconi等[6]報(bào)道了蜂王漿中糠氨酸的測(cè)定方法；周驍?shù)萚7]建立了高效液相色譜測(cè)定蜂花粉中糠氨酸的方法，此方法可作為標(biāo)準(zhǔn)方法評(píng)價(jià)蜂花粉的產(chǎn)品質(zhì)量；牛猛[8]進(jìn)行了全麥鮮濕面褐變機(jī)制及品質(zhì)改良的研究，結(jié)果表明全麥濕面在常溫（25 ℃左右）條件下保存時(shí)，其中可以檢測(cè)到糠氨酸，隨著保存溫度從20 ℃逐漸升高到80 ℃，糠氨酸含量也逐漸增加。

Maillard反應(yīng)機(jī)理復(fù)雜，糠氨酸只是初期反應(yīng)的產(chǎn)物。5-羥甲基糠醛（5-hydroxymethylfurfural，5-HMF）是由糖類化合物在高溫或弱酸性條件下水解產(chǎn)生的一種呋喃類化合物，是Maillard反應(yīng)的一種重要的中間產(chǎn)物，可用來(lái)監(jiān)測(cè)熱處理對(duì)牛乳色澤的影響效果[9]。通過(guò)測(cè)定糠氨酸及5-HMF含量來(lái)綜合評(píng)價(jià)酶法水解乳糖與熱處理結(jié)合對(duì)牛乳Maillard反應(yīng)的影響。目前，關(guān)于牛乳Maillard反應(yīng)相關(guān)的研究很多，基本上集中在對(duì)生乳、復(fù)原乳及超高溫滅菌（ultra high temperature sterilization，UHT）乳中糠氨酸含量的測(cè)定及Maillard反應(yīng)對(duì)乳制品品質(zhì)的影響方面[10-14]，而對(duì)于低乳糖牛乳Maillard反應(yīng)的研究還較少。伍桃英等[15]以5-HMF作為考察指標(biāo)，采用β-半乳糖苷酶水解牛乳至乳糖水解率超過(guò)90%，研究了幾種褐變抑制劑對(duì)低乳糖乳褐變的抑制效果，結(jié)果表明Na2SO3、檸檬酸、NaHSO3、EDTA-2Na對(duì)低乳糖乳中5-HMF的抑制作用依次遞減。常浩祥[16]以水解率達(dá)到70%以上的牦牛乳為對(duì)象，添加不同種類的抑制劑，測(cè)定5-HMF的含量來(lái)評(píng)價(jià)抑制劑的抑制效果。結(jié)果表明，將低乳糖牛乳在85 ℃加熱10 min，除抗壞血酸對(duì)Maillard反應(yīng)有促進(jìn)作用外，VE、2,6-二叔丁基-4-甲基苯酚（butylated hydroxytoluene，BHT）、甲硫氨酸和半胱氨酸均能對(duì)低乳糖牦牛乳中Maillard反應(yīng)具有抑制作用。目前鮮見有關(guān)牛乳中乳糖不同水解程度與牛乳Maillard反應(yīng)之間關(guān)系的研究報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)以中性乳糖酶處理牛乳獲得不同水解程度的低乳糖牛乳，通過(guò)葡萄糖氧化酶法測(cè)定不同水解時(shí)間的牛乳中的葡萄糖質(zhì)量濃度和乳糖水解率，使用高效液相色譜法（high performance liquid chromatography，HPLC）和紫外分光光度法測(cè)定乳糖水解后再經(jīng)熱處理的牛乳中糠氨酸和5-HMF的含量及牛乳的褐變程度，研究酶法水解乳糖與熱處理對(duì)牛乳Maillard反應(yīng)的影響，旨在探索牛乳中乳糖水解程度與熱處理牛乳的Maillard反應(yīng)之間的關(guān)系，以期為開發(fā)低乳糖牛乳產(chǎn)品提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

生鮮牛乳 新希望乳業(yè)控股有限公司。

中性乳糖酶（2 600 U/g） 荷蘭皇家帝斯曼集團(tuán)；葡萄糖測(cè)定試劑盒 北京普利萊基因技術(shù)有限公司；糠氨酸標(biāo)準(zhǔn)品（純度＞99%） 法國(guó)NeoMPS公司；5-HMF標(biāo)準(zhǔn)品（純度＞99%） 上海Aladdin公司；鹽酸、乙醇、磷酸、六氰合鐵酸鉀、乙酸鋅、甲醇、草酸（分析純）、乙腈、甲醇（色譜純） 成都市科龍化工試劑廠；三氟乙酸（色譜純） 上海源葉生物科技有限公司；考馬斯亮藍(lán)G-250、標(biāo)準(zhǔn)牛血清白蛋白（分析純）美國(guó)Sigma公司。

1.2 儀器與設(shè)備

1100高效液相色譜儀 美國(guó)安捷倫公司；快速乳成分分析儀 浙江大學(xué)食品科學(xué)與發(fā)酵工程研究所；恒溫水浴鍋 國(guó)華電器有限公司；DHP-9052電熱恒溫培養(yǎng)箱 上海齊欣科學(xué)儀器有限公司；紫外分光光度計(jì)翔藝儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

分別取9 份200 mL生鮮牛乳，在水浴鍋中經(jīng)過(guò)75 ℃、15 s預(yù)殺菌處理，冷卻至40 ℃左右，分別添加0.8 g乳糖酶（添加量4‰），攪拌均勻。將9 份牛乳樣品在40 ℃水浴中分別水解0.0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0 h，均取出10 mL牛乳，用于測(cè)定牛乳中的葡萄糖質(zhì)量濃度和乳糖水解率。剩余每份牛乳（190 mL）平均分成兩份，每份95 mL，9 個(gè)不同水解時(shí)間的牛乳為一組。第一組牛乳經(jīng)75 ℃、30 min加熱處理，第二組牛乳經(jīng)75 ℃、15 s加熱處理。兩組熱處理后的樣品均冷卻至25 ℃左右，測(cè)定樣品糠氨酸、5-HMF含量及褐變程度?？钒彼帷?-HMF含量及褐變程度指標(biāo)測(cè)定均以生鮮牛乳為對(duì)照。

1.3.2 指標(biāo)測(cè)定

1.3.2.1 乳成分的測(cè)定

采用快速乳成分分析儀對(duì)原料乳的成分進(jìn)行測(cè)定。

1.3.2.2 葡萄糖含量的測(cè)定

采用葡萄糖測(cè)定試劑盒和分光光度法測(cè)定乳糖水解后，產(chǎn)生的葡萄糖含量。按照操作說(shuō)明，將葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品和待測(cè)樣品在530 nm波長(zhǎng)處測(cè)定OD值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品中葡萄糖的含量。

1.3.2.3 乳糖水解率的測(cè)定

根據(jù)1.3.2.2節(jié)測(cè)定的葡萄糖的質(zhì)量濃度折算成乳糖后計(jì)算水解率（degree of hydrolysis，DH）[17]。其中，起始乳糖含量由乳成分分析儀測(cè)得，葡萄糖質(zhì)量濃度由葡萄糖測(cè)定試劑盒測(cè)得。水解率計(jì)算公式如式（1）。

式中：342為乳糖的相對(duì)分子質(zhì)量；180為葡萄糖的相對(duì)分子質(zhì)量；ρ為葡萄糖質(zhì)量濃度/（mg/100 mL）；c為起始乳糖含量/（g/100 g）。

1.3.2.4 糠氨酸含量的測(cè)定

采用HPLC法測(cè)定牛乳中的糠氨酸，參照文獻(xiàn)[13,18]方法，并做適當(dāng)調(diào)整。

糠氨酸標(biāo)準(zhǔn)工作溶液的配制：將糠氨酸標(biāo)準(zhǔn)品用3 mol/L鹽酸溶液配制成200 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)貯備液，貯存于4 ℃冰箱中。取0.1 mL標(biāo)準(zhǔn)貯備溶液，用3 mol/L鹽酸定容至10 mL配制成2 μg/mL的糠氨酸標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。

試樣水解液的制備：吸取2.00 mL牛乳，置于水解管中，加入6 mL的10.6 mol/L鹽酸溶液，混勻。向水解管中緩慢通入高純度氮?dú)?～2 min，密封試管。然后將其置于110 ℃的烘箱中水解24 h。水解結(jié)束后，將水解管從烘箱中取出，冷卻后過(guò)濾，保留濾液供測(cè)定。

試樣水解液中蛋白質(zhì)含量的測(cè)定：采用考馬斯亮藍(lán)G-250法[19]測(cè)定蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度。具體方法為：吸取1.0 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)牛血清白蛋白0.0、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL于7 支試管，補(bǔ)加蒸餾水至1.0 mL，在每支試管中加入4 mL考馬斯亮藍(lán)G-250試劑，混勻。2～5 min后，測(cè)定各樣品在595 nm波長(zhǎng)處的OD值，作出標(biāo)準(zhǔn)曲線。吸取0.2～0.8 mL樣品溶液，補(bǔ)加蒸餾水至1.0 mL后，其余步驟同牛血清白蛋白，測(cè)定樣品的OD值，并計(jì)算樣品中的蛋白含量。

試樣水解液中糠氨酸含量的測(cè)定：吸取0.5 mL過(guò)濾后的試樣水解液于試管內(nèi)，用3 mol/L鹽酸溶液定容至3 mL，過(guò)0.45 μm濾膜，濾液用于HPLC測(cè)定。

色譜條件：色譜柱：Waters Symmetry C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動(dòng)相：A為0.08%三氟乙酸，B為甲醇；紫外檢測(cè)波長(zhǎng)：280 nm；進(jìn)樣量：10 μL；柱溫：35 ℃。梯度洗脫程序見表1。

表1 梯度洗脫程序Table 1 Gradient elution program for furosine

在測(cè)定時(shí)，首先將洗脫液A和B的混合液（50∶50），以1 mL/min的流速平衡色譜系統(tǒng)。并注入20～50 μL的3 mol/L鹽酸溶液平衡色譜柱，以檢測(cè)溶劑的純度。每測(cè)定10 個(gè)樣品后測(cè)定一次標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，以校準(zhǔn)儀器。

糠氨酸含量按式（2）計(jì)算。

式中：W為樣品中每100 g蛋白質(zhì)中糠氨酸的質(zhì)量/（mg/100 g pro）；ρ為樣品水解液中糠氨酸的質(zhì)量濃度/（μg/mL）；d為測(cè)定時(shí)稀釋倍數(shù)（d＝6）；ρ1為樣品水解液中蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度/（mg/mL）。

1.3.2.5 5-HMF含量的測(cè)定

采用HPLC法測(cè)定牛乳中的5-HMF，參照文獻(xiàn)[20]方法，并做適當(dāng)調(diào)整。

5-HMF標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制：精確稱取5-HMF標(biāo)準(zhǔn)品0.03 g，用10 mL甲醇溶解后，用水稀釋定容至100 mL，得到300 μg/mL 5-HMF標(biāo)準(zhǔn)貯備液。取一定量5-HMF貯備液，用水稀釋成質(zhì)量濃度分別為0.00、0.10、0.50、1.00、1.50、2.00 μg/mL的5-HMF標(biāo)準(zhǔn)溶液。

樣品溶液的制備：準(zhǔn)確稱取牛乳樣品10.00 g，加入5 mL 0.15 mol/L草酸溶液，混合均勻。再加入92 g/L六氰合鐵酸鉀溶液3 mL和183 g/L乙酸鋅溶液3 mL，振搖充分后靜置10 min，用甲醇定容至50 mL，混勻、過(guò)濾，棄去固相，收集上清液，用0.45 μm濾膜過(guò)濾后進(jìn)樣。

色譜條件：色譜柱：Waters Symmetry C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相：甲醇-水（體積比15∶85）；紫外檢測(cè)波長(zhǎng)：280 nm；流速：1.0 mL/min；進(jìn)樣量：10 μL；柱溫：30 ℃。

結(jié)果計(jì)算：樣品中5-HMF的含量按式（3）計(jì)算，扣除空白。

式中：X為樣品中5-HMF的含量/（mg/kg）；Si為樣品中5-HMF的峰面積；Ss為標(biāo)準(zhǔn)溶液中5-HMF的峰面積；ρs為標(biāo)準(zhǔn)工作液中5-HMF的質(zhì)量濃度/（μg/mL）；V為樣品最終定容體積/mL；m為樣品的取樣質(zhì)量/g。

1.3.2.6 紫外分光光度法測(cè)定牛乳的褐變程度

根據(jù)文獻(xiàn)[21]的方法并稍作修改進(jìn)行測(cè)定。取1 mL處理后的牛乳，用蒸餾水稀釋200 倍，在420 nm波長(zhǎng)處測(cè)定樣品的OD值（以生鮮牛乳作為空白）。OD值越大，表明牛乳的褐變程度越劇烈。

1.4 數(shù)據(jù)處理

2 結(jié)果與分析

2.1 牛乳基本成分GB 19301—2010《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 生乳》規(guī)定：蛋白質(zhì)含量≥2.80 g/100 g，脂肪含量≥3.1 g/100 g，非脂乳固體含量≥8.1 g/100 g[22]。由表2可知，本實(shí)驗(yàn)所使用的牛乳滿足國(guó)標(biāo)對(duì)原料乳的質(zhì)量要求。

表2 牛乳基本成分Table 2 Proximate composition of milk

2.2 不同水解時(shí)間牛乳中葡萄糖含量及乳糖水解率變化在530 nm波長(zhǎng)處，以各標(biāo)準(zhǔn)管OD值為y軸，葡萄糖濃度為x軸，繪制出葡萄糖質(zhì)量濃度的標(biāo)準(zhǔn)曲線，線性關(guān)系表示為y＝0.018 3x+0.021 5，R2＝0.999 6。通過(guò)該方法可準(zhǔn)確測(cè)出樣品中葡萄糖的含量。在不同水解時(shí)間，牛乳中葡萄糖含量及乳糖水解率變化見表3。隨著水解時(shí)間的延長(zhǎng)，牛乳中的葡萄糖含量一直在增加，這是由于在乳糖酶的作用下，牛乳中的乳糖水解生成了葡萄糖。水解時(shí)間在0.0～2.0 h，葡萄糖質(zhì)量濃度增加速率較快，從0.00 mg/100 mL增加到了1 250.99 mg/100 mL，增加了1 250.99 mg/100 mL；水解時(shí)間在2.0～4.0 h，葡萄糖質(zhì)量濃度增加速率減慢，從1 250.99 mg/100 mL上升到1 721.23 mg/100 mL，增加了470.24 mg/100 mL。這表明，隨乳糖水解時(shí)間的延長(zhǎng)，牛乳中的乳糖水解為葡萄糖的含量增加，但乳糖酶的水解效率下降。

隨著乳糖水解時(shí)間的延長(zhǎng)，牛乳中乳糖水解率（DH）呈上升的趨勢(shì)。水解時(shí)間從0.0～4.0 h，乳糖水解率從0%增加到70.33%。高亞濱[23]認(rèn)為，當(dāng)牛乳中的乳糖降低50%后，就可以克服乳糖不耐癥的問(wèn)題。因此，乳糖水解時(shí)間為2.0 h及以后的牛乳滿足了乳糖不耐癥患者的需要。

表3 不同水解時(shí)間牛乳中葡萄糖含量及乳糖水解率變化Table 3 Changes in glucose content and hydrolysis degree of milk as a function of hydrolysis time

2.3 不同水解時(shí)間牛乳中糠氨酸變化

2.3.1 糠氨酸標(biāo)準(zhǔn)品色譜圖

質(zhì)量濃度為2 μg/mL糠氨酸標(biāo)準(zhǔn)工作溶液的色譜圖見圖1。從出峰情況可以看出，糠氨酸的保留時(shí)間為5.990 min。

圖1 糠氨酸標(biāo)準(zhǔn)品色譜圖Fig. 1 HPLC chromatogram of furosine standard

2.3.2 不同水解時(shí)間的牛乳中糠氨酸含量

在乳糖酶作用下，牛乳水解0.0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0 h后，采用HPLC測(cè)定牛乳中糠氨酸的含量，結(jié)果見表4。

糠氨酸是Maillard反應(yīng)產(chǎn)生的特定產(chǎn)物。近年來(lái)，糠氨酸常被用作判斷食品受熱程度的指標(biāo)，在蛋類、谷物、乳制品、肉制品、中藥口服液中均有應(yīng)用[24]。由表4可知，隨著乳糖酶水解時(shí)間的延長(zhǎng)，牛乳中糠氨酸含量呈上升的趨勢(shì)（P＜0.05）。生鮮牛乳中糠氨酸含量為3.040 mg/100 g pro，符合生鮮乳糠氨酸含量3～5 mg/100 g pro的要求[13]。生鮮牛乳經(jīng)75 ℃、15 s預(yù)殺菌處理，乳糖酶水解0 h，再經(jīng)75 ℃、30 min熱處理，其糠氨酸含量是同樣條件下經(jīng)75 ℃、15 s熱處理牛乳的14 倍以上，表明牛乳經(jīng)巴氏預(yù)殺菌后再經(jīng)長(zhǎng)時(shí)間熱處理，糠氨酸含量會(huì)明顯增加。NY/T 939—2005《巴氏殺菌乳和UHT滅菌乳中復(fù)原乳的鑒定》規(guī)定，巴氏殺菌乳中糠氨酸含量大于12 mg/100 g pro或UHT乳中糠氨酸含量大于190 mg/100 g pro，則鑒定為含有復(fù)原乳[5]。對(duì)于水解時(shí)間在3.0 h以上且經(jīng)75 ℃、30 min熱處理的牛乳，糠氨酸含量基本超過(guò)了190 mg/100 g pro，相當(dāng)于含有復(fù)原乳的UHT殺菌乳。對(duì)于水解時(shí)間為0.5 h及以上并經(jīng)75 ℃、15 s熱處理的牛乳，糠氨酸含量超過(guò)了12 mg/100 g pro，相當(dāng)于含有復(fù)原乳的巴氏殺菌乳。孫琦[25]測(cè)定了生鮮牛乳經(jīng)75 ℃、15 s熱處理后糠氨酸的含量，與生鮮牛乳相比，熱處理后的牛乳糠氨酸含量有所增加，但不顯著；但經(jīng)超高溫瞬時(shí)滅菌（137 ℃、4 s）后糠氨酸含量顯著增加，超過(guò)了100 mg/100 g pro。

糠氨酸是牛乳加工過(guò)程中經(jīng)Maillard反應(yīng)使蛋白質(zhì)和還原糖形成的特征產(chǎn)物之一。隨著水解時(shí)間的延長(zhǎng)，乳糖被乳糖酶水解生成葡萄糖和半乳糖的量增加，而還原性單糖更容易發(fā)生Maillard反應(yīng)[26]，表征Maillard反應(yīng)程度加劇。

2.4 不同水解時(shí)間牛乳中5-HMF變化

2.4.1 5-HMF標(biāo)準(zhǔn)品色譜圖及標(biāo)準(zhǔn)曲線

表4 不同水解時(shí)間牛乳中糠氨酸含量Table 4 Change in furosine content of milk as a function of hydrolysis time

表5 不同水解時(shí)間牛乳中5-HMF含量Table 5 Change in 5-HMF content of milk as a function of hydrolysis time

圖2 5-HMF標(biāo)準(zhǔn)品色譜圖Fig. 2 HPLC chromatogram of 5-HMF standard

質(zhì)量濃度為2.00 μg/mL標(biāo)準(zhǔn)品的色譜圖見圖2。從出峰情況可以看出，保留時(shí)間為4.890 min。5-HMF標(biāo)準(zhǔn)工作曲線峰面積與質(zhì)量濃度的線性關(guān)系表示為y＝10 058x+35.482，R2＝0.994 7。通過(guò)該方法可準(zhǔn)確測(cè)出樣品中5-HMF的含量。

2.4.2 不同水解時(shí)間的牛乳中5-HMF含量

在乳糖酶作用下，牛乳水解0.0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0 h后，采用HPLC測(cè)定牛乳中5-HMF的含量，結(jié)果見表5。

5-HMF是葡萄糖、果糖等單糖化合物在高溫或弱酸性條件下脫水產(chǎn)生的酚醛類化合物，其為黑色，具有難聞氣味，是引起食品風(fēng)味和褐變的指標(biāo)成分之一[27]。若5-HMF質(zhì)量濃度偏高，表明加工過(guò)程中受到過(guò)度加熱。由表5可知，生鮮牛乳和乳糖酶水解后經(jīng)75 ℃、30 min熱處理的牛乳，均未檢測(cè)到5-HMF。這可能是因?yàn)榕Ｈ榻?jīng)長(zhǎng)時(shí)間熱處理，牛乳中還原糖和氨基酸或蛋白質(zhì)中的自由氨基縮合生成的Shiff堿經(jīng)過(guò)一系列的反應(yīng)而產(chǎn)生的Maillard中間產(chǎn)物5-HMF極不穩(wěn)定，與多余的氨基化合物反應(yīng)生成了褐色的含氮聚合物和共聚物[28-29]，還可能是5-HMF發(fā)生異構(gòu)化（裂解）反應(yīng)，生成了小分子物質(zhì)[30]，因此未檢測(cè)到5-HMF。對(duì)于75 ℃、15 s熱處理的牛乳，隨著乳糖水解時(shí)間的延長(zhǎng)，牛乳中5-HMF含量呈上升的趨勢(shì)（P＜0.05），表明即使牛乳中的乳糖經(jīng)乳糖酶水解成還原性單糖，巴氏殺菌處理（75 ℃、15 s）對(duì)牛乳的殺菌強(qiáng)度仍沒有達(dá)到劇烈的程度，而使牛乳中檢測(cè)不到5-HMF。2.5 不同水解時(shí)間牛乳的褐變程度變化

在乳糖酶作用下，牛乳水解0.0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0 h后，經(jīng)75 ℃、30 min和75 ℃、15 s加熱處理。采用分光光度法測(cè)定樣品的褐變程度，其測(cè)定結(jié)果見圖3。

褐變分為酶促褐變和非酶褐變。本實(shí)驗(yàn)中的牛乳經(jīng)過(guò)巴氏殺菌處理，大部分酶已失活，主要考慮加工過(guò)程發(fā)生的非酶褐變（Maillard反應(yīng)）。Maillard反應(yīng)體系在420 nm波長(zhǎng)處的紫外吸收大小與Maillard反應(yīng)中間產(chǎn)物的形成有關(guān)[31]。由圖3可知，隨著乳糖酶水解時(shí)間的延長(zhǎng)，牛乳的褐變程度呈顯著上升的趨勢(shì)（P＜0.05），這表明，乳糖酶水解時(shí)間越長(zhǎng)，Maillard反應(yīng)程度越大，這是因?yàn)榕Ｈ橹械娜樘撬夂螅€原糖數(shù)量增加，更容易發(fā)生Maillard反應(yīng)[16]。乳糖酶水解后75 ℃、30 min熱處理的牛乳的褐變程度明顯高于75 ℃、15 s熱處理的牛乳，說(shuō)明長(zhǎng)時(shí)間熱處理對(duì)牛乳Maillard反應(yīng)的影響更劇烈。

圖3 不同水解時(shí)間牛乳褐變程度變化Fig. 3 Browning degree of milk during Maillard reaction as a function of hydrolysis time

3 結(jié) 論

采用中性乳糖酶對(duì)牛乳水解，并對(duì)牛乳進(jìn)行熱處理，獲得以下結(jié)論：

測(cè)定不同水解時(shí)間牛乳中葡萄糖質(zhì)量濃度和乳糖水解率表明，隨著乳糖水解時(shí)間的延長(zhǎng)，牛乳中葡萄糖含量呈增加的趨勢(shì)，但這種趨勢(shì)逐漸變緩。水解時(shí)間0.0～4.0 h，牛乳中的葡萄糖質(zhì)量濃度從0.00 mg/100 mL增加到1 721.33 mg/100 mL；乳糖水解率從0%增加到70.33%，乳糖水解時(shí)間為2.0 h及以后的牛乳水解率達(dá)到了50%以上。

隨著乳糖酶水解時(shí)間的延長(zhǎng)，牛乳中糠氨酸含量呈上升的趨勢(shì)。對(duì)于水解時(shí)間在3.0 h以上并經(jīng)75 ℃、30 min熱處理的牛乳，糠氨酸含量基本超過(guò)了190 mg/100 g pro，相當(dāng)于含有復(fù)原乳的UHT殺菌乳。對(duì)于水解時(shí)間為0.5 h及以上并經(jīng)75 ℃、15 s熱處理的牛乳，糠氨酸含量超過(guò)了12 mg/100 g pro，相當(dāng)于含有復(fù)原乳的巴氏殺菌乳。

生鮮牛乳和乳糖酶水解后經(jīng)75 ℃、30 min熱處理的牛乳，均未檢測(cè)到5-HMF；而乳糖酶水解后經(jīng)75 ℃、15 s熱處理的牛乳，隨著乳糖水解時(shí)間的延長(zhǎng)，牛乳中5-HMF含量呈上升的趨勢(shì)。

隨著乳糖酶水解時(shí)間的延長(zhǎng)，牛乳的褐變程度呈極顯著上升的趨勢(shì)，且乳糖酶水解后75 ℃、30 min熱處理的牛乳的褐變程度明顯高于75 ℃、15 s熱處理的牛乳。長(zhǎng)時(shí)間熱處理對(duì)牛乳Maillard反應(yīng)的影響更劇烈，影響乳的蛋白質(zhì)品質(zhì)。

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Effect of Enzymatic Hydrolysis of Lactose Combined with Heat Treatments on Maillard Reaction of Milk

LI Sining1, TANG Shanhu1,*, HU Yang1, MAO Menglan1, LIU Yuan2
(1. College of Life Science and Technology, Southwest University for Nationalities, Chengdu 610041, China; 2. Technology Center, New Hope Dairy Holding Co. Ltd., Chengdu 610040, China)

The objective of this study was to investigate the relationship between the hydrolysis degree of lactose combined with heat treatments and Maillard reaction in milk. Fresh milk was hydrolyzed with neutral lactase to obtain low-lactose milk with different hydrolysis degrees. Then, the products were treated by various heating methods and the degree of Maillard reaction was assessed. The glucose concentration and the hydrolysis degree of lactose in milk at different hydrolysis times were measured by the glucose oxidase method. Furosine and 5-hydroxymethylfurfural (5-HMF) contents and browning degree (OD values) were determined by using high-performance liquid phase chromatography (HPLC) and ultraviolet spectrophotometry, respectively. The results showed that the glucose content in milk was increased with prolonged time of lactose hydrolysis, and glucose concentration slowly increased from 0.00 to 1 721.33 mg /100 mL. Similarly, lactose hydrolysis percentage increased from 0% to 70.33%, reaching a level higher than 50% after 2.0 h heat treatment. Furosine content in milk showed a rising trend with extended heat treatment (P ＜ 0.05). Milk subjected to hydrolysis for more than 3.0 h and then heat treatment at 75 ℃ for 30 min had a furosine content exceeding 190 mg/100 g protein, while hydrolysis for 0.5 h and longer followed by heat treatment at 75 ℃ for 15 s resulted in a furosine content more than 12 mg/100 g protein. 5-HMF was not detected in fresh milk or in milk hydrolyzed and heat treated at 75 ℃ for 30 min. The content of 5-HMF in hydrolyzed milk increased with the extension of hydrolysis time followed by heat treatment at 75 ℃ for 15 s (P ＜ 0.05). Likewise, the browning degree signif i cantly increased with the extension of hydrolysis time (P ＜ 0.05). Browning reaction in milk treated at 75 ℃ for 30 min was signif i cantly higher than that at 75 ℃ for 15 s. Therefore, enzymatic hydrolysis of lactose coupled with heat treatment can promote Maillard reaction and thus affect protein quality in milk.

10.7506/spkx1002-6630-201707020

TS252.4

A

1002-6630（2017）07-0122-07

2016-05-10

中央高?；究蒲袠I(yè)務(wù)費(fèi)專項(xiàng)資金項(xiàng)目（2015NZYQN35）；四川省科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目（2014NZ0032）

李思寧（1988—），女，實(shí)驗(yàn)師，碩士，研究方向?yàn)槭称芳庸づc貯藏技術(shù)。E-mail：616906108@qq.com

*通信作者：唐善虎（1964—），男，教授，博士，研究方向?yàn)閯?dòng)物性食品加工及檢測(cè)。E-mail：stang01@126.com

李思寧, 唐善虎, 胡洋, 等. 酶法水解乳糖與熱處理偶聯(lián)對(duì)牛乳Maillard反應(yīng)的影響[J]. 食品科學(xué), 2017, 38(7): 122-128. DOI:10.7506/spkx1002-6630-201707020. http://www.spkx.net.cn

LI Sining, TANG Shanhu, HU Yang, et al. Effect of enzymatic hydrolysis of lactose combined with heat treatments on Maillard reaction of milk[J]. Food Science, 2017, 38(7): 122-128. (in Chinese with English abstract)

10.7506/spkx1002-6630-201707020. http://www.spkx.net.cn

Key words:milk; lactose hydrolysis; Maillard reaction; furosine; 5-hydroxymethylfurfural