4 種防腐劑對(duì)副溶血弧菌生物膜形成的抑制作用

雷 歡，謝 婷，魏宇清，劉 歡，鐘青萍,*

（1.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，廣東 廣州 510642；2.中山大學(xué)附屬第三醫(yī)院，廣東 廣州 510630）

4 種防腐劑對(duì)副溶血弧菌生物膜形成的抑制作用

雷 歡1,2，謝 婷1，魏宇清1，劉 歡1，鐘青萍1,*

（1.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，廣東 廣州 510642；2.中山大學(xué)附屬第三醫(yī)院，廣東 廣州 510630）

在確定4 種防腐劑殼聚糖、山梨酸鉀、脫氫乙酸鈉和ε-聚賴氨酸對(duì)副溶血弧菌（Vibro parahaemolyticus）的最小抑菌濃度（minimum inhibitory concentration，MIC）的基礎(chǔ)上，研究其對(duì)副溶血弧菌生物膜的抑制作用。采用結(jié)晶紫染色法測(cè)生物膜形成量，XTT法測(cè)生物膜代謝活性，硫酸-苯酚法測(cè)定生物膜中胞外多糖的分泌量。結(jié)果表明，殼聚糖的MIC最小，為1.25 mg/mL。4 種防腐劑在MIC以及亞抑菌濃度條件下對(duì)副溶血弧菌生物膜均有明顯的抑制作用，不僅抑制生物膜的形成，而且能顯著降低細(xì)菌的代謝活性，減少胞外多糖的分泌，其中殼聚糖對(duì)副溶血弧菌生物膜的抑制作用最強(qiáng)。

副溶血弧菌；生物膜；防腐劑；抑制

副溶血弧菌（Vibro parahaemolyticus）是嗜鹽性革蘭氏陰性桿菌，廣泛存在于近海岸海水、海底沉積和魚(yú)貝類海洋生物中，是沿海地區(qū)引起食物中毒的重要致病菌[1-3]。近年來(lái)副溶血弧菌已成為食源性致病菌之首，在我國(guó)一些省市引起的食物中毒占細(xì)菌性食物中毒的60%以上[4-5]。副溶血弧菌污染的主要食物是海產(chǎn)品或鹽腌漬品，常見(jiàn)的有蟹類、貝類、海蜇、魚(yú)蝦、田螺等，其次是肉蛋類和蔬菜[6-7]。在自然環(huán)境中副溶血性弧菌主要以生物膜的形式存在[8]。生物膜是微生物細(xì)胞及其產(chǎn)生的細(xì)胞外大分子多聚物所形成的一種特殊細(xì)菌群落，它也是細(xì)菌抵抗不利環(huán)境、產(chǎn)生耐藥性并導(dǎo)致持續(xù)感染的重要方式[9-10]。研究表明成熟的生物膜內(nèi)細(xì)菌的耐藥性是游離菌的500～5 000 倍[11]。因此，生物膜一旦形成，使用一般的抗生素、消毒劑很難去除，在醫(yī)療和食品安全等領(lǐng)域帶來(lái)很大的風(fēng)險(xiǎn)[12-13]。

目前對(duì)副溶血弧菌生物膜的研究主要是對(duì)生物膜形成條件的探究[14-16]，關(guān)于不同的防腐劑對(duì)其抑制作用的研究較少。本實(shí)驗(yàn)研究了4 種食品防腐劑殼聚糖、山梨酸鉀、脫氫乙酸鈉、ε-聚賴氨酸對(duì)副溶血弧菌生物膜形成的抑制作用，分析其對(duì)生物膜形成量、生物膜代謝活性以及胞外多糖分泌量的影響，以期為防治副溶血弧菌污染提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

副溶血弧菌標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC17802購(gòu)于廣東省微生物研究所微生物菌種保藏中心，副溶血弧菌標(biāo)準(zhǔn)菌株J5421由中國(guó)軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院微生物流行病研究所贈(zèng)送。菌種均保藏在-80 ℃條件下20%的甘油管中。

殼聚糖 青島潛光生物工程有限公司；山梨酸鉀武漢萬(wàn)榮科技發(fā)展有限公司；脫氫乙酸鈉 廣東辰源精細(xì)化工有限公司；ε-聚賴氨酸 河南潤(rùn)誠(chéng)化工產(chǎn)品有限公司；鏈霉蛋白酶E（pronase E）、甲萘醌（純度＞98%） 美國(guó)Sigma公司；XTT（純度為98%） 南京凱基生物科技有限公司。

含3% NaCl的胰蛋白胨大豆肉湯培養(yǎng)基（TSB）：胰蛋白胨15 g、大豆蛋白胨5 g、NaCl 130 g、去離子水1 L。用1 mol/L NaOH溶液調(diào)節(jié)pH值為7.0～7.4；121 ℃，0.15 MPa條件下高壓滅菌20 min。含3% NaCl的胰蛋白胨大豆肉湯瓊脂培養(yǎng)基（TSA）：在上述TSB配方的基礎(chǔ)上加入2%的瓊脂，加熱融化后滅菌。水解酪蛋白胨肉湯（MH肉湯）：稱取MH肉湯培養(yǎng)基21 g，加入去離子水1 L，攪拌加熱煮沸至完全溶解，分裝三角瓶，121 ℃、0.15 MPa條件下高壓滅菌20 min。

1.2 儀器與設(shè)備

Multiskan FC酶標(biāo)儀、Forma Class Ⅱ A2生物安全柜美國(guó)Thermo公司；150A恒溫培養(yǎng)箱 江蘇省金壇市榮華儀器制造有限公司；5417R高速冷凍離心機(jī) 德國(guó)Eppendorf公司；KQ-500E型超聲波清洗器 昆山市超聲儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 菌懸液的制備

將菌種活化后，從TSA斜面培養(yǎng)基上挑取適量菌體，轉(zhuǎn)接入含3% NaCl的TSB培養(yǎng)基中，37 ℃恒溫150 r/min振蕩培養(yǎng)12～16 h，然后于4 ℃條件下，4 000 r/min離心10 min收集菌體，用無(wú)菌生理鹽水將菌濃度調(diào)整到108CFU/mL左右待用。

1.3.2 二倍稀釋法測(cè)定防腐劑對(duì)副溶血弧菌的最小抑菌濃度

采用96 孔板微量稀釋法測(cè)定不同防腐劑的最小抑菌濃度（minimum inhibitory concentration，MIC）。參考4 種防腐劑在食品保鮮過(guò)程中所使用的質(zhì)量濃度，將其用MH肉湯培養(yǎng)基二倍稀釋成6 個(gè)梯度，孔中再加入終濃度為105CFU/mL的菌液，同時(shí)設(shè)置未加防腐劑的對(duì)照組，在30 ℃條件下培養(yǎng)24 h后首先肉眼觀察渾濁度，防腐劑質(zhì)量濃度最小但孔內(nèi)卻澄清的質(zhì)量濃度可推測(cè)為最小抑菌濃度，然后在595 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，只有相鄰兩孔的吸光度差異較大且極顯著時(shí)（P＜0.01），確定為該防腐劑的MIC。

1.3.3 防腐劑對(duì)生物膜形成量的抑制

將制備好的濃度為108CFU/mL的菌懸液與TSB培養(yǎng)基按1∶3的比例加入96 孔板中，加入終質(zhì)量濃度分別為MIC、1/2 MIC、1/8 MIC的防腐劑溶液，同時(shí)設(shè)不加防腐劑的對(duì)照組。將96 孔板放置于30 ℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h，取出孔板，棄去游離菌，用250 μL無(wú)菌生理鹽水清洗2 次，然后60 ℃干燥固定15 min，再每孔加入0.1%的結(jié)晶紫溶液200 μL，染色5 min，用250 μL無(wú)菌生理鹽水清洗3 次，干燥后加入33%的冰乙酸200 μL，放置10 min，在595 nm波長(zhǎng)處測(cè)OD值[17]。抑制率計(jì)算參考下式：

1.3.4 生物膜代謝活性測(cè)定

將XTT用磷酸鹽緩沖液配制成1 g/mL的溶液，貯存在-80 ℃冰箱中。甲萘醌在用之前溶解在丙酮中，使其終濃度為1 mmol/L，每次實(shí)驗(yàn)所用XTT與甲萘醌比例為12.5∶1。不同防腐劑處理?xiàng)l件下副溶血弧菌培養(yǎng)48 h后形成生物膜，移除浮游菌，用100 μL無(wú)菌磷酸鹽緩沖液沖洗3 次，加入13.5 μL的混合液，輕輕振動(dòng)孔板，然后放置在黑暗處37 ℃溫育2～3 h，另設(shè)對(duì)照組，測(cè)定OD450nm值[18]。

1.3.5 胞外多糖含量測(cè)定

將制備好的濃度為108CFU/mL的菌懸液按1%的接種量加入到含有載玻片的液體培養(yǎng)基試管中，加入終質(zhì)量濃度分別為MIC、1/2 MIC、1/8 MIC的防腐劑溶液，同時(shí)設(shè)不加防腐劑的對(duì)照組。副溶血弧菌在30 ℃條件下培養(yǎng)48 h后形成生物膜，取出玻片，放入10 mL的生理鹽水中，超聲振蕩后取出玻片，將菌懸液煮沸10 min，室溫冷卻20 min。再加入50 μL的pronase E，37 ℃孵育2 h，加入200 μL的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%的TCA溶液，冰水放置30 min，10 000 r/min離心30 min。收集上清液，加入等體積的乙醇溶液，-20 ℃放置1 h，15 000 r/min離心20 min，除去上清液，沉淀物用95%的苯酚和5 mL濃硫酸復(fù)溶，沸水浴10 min，反應(yīng)液呈紅色，設(shè)置對(duì)照組，測(cè)定OD450nm值[19]。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

應(yīng)用SPSS 22.0軟件進(jìn)行平均值和標(biāo)準(zhǔn)偏差的計(jì)算，并對(duì)其進(jìn)行顯著性分析（P＜0.01為差異極顯著，0.01≤P＜0.05為差異顯著）。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同防腐劑對(duì)副溶血弧菌的MIC

表1 不同防腐劑對(duì)副溶血弧菌的MICTable 1 MICs of different food preservatives for V. parahaemolyticus

從表1可以看出，殼聚糖的MIC為1.25 mg/mL；山梨酸鉀的MIC為10 mg/mL，防腐劑不同，對(duì)副溶血弧菌的抑制作用所需的質(zhì)量濃度也有差異。4 種防腐劑都可以有效地抑制副溶血弧菌的生長(zhǎng)。每種防腐劑對(duì)2 株菌的MIC是一致的。

2.2 不同質(zhì)量濃度防腐劑抑制副溶血弧菌生物膜形成

圖1 不同防腐劑對(duì)ATCC17802菌株（A）和J5421菌株（B）生物膜形成的抑制率Fig. 1 Inhibitory effects of different food preservatives on V. parahaemolyticus ATCC17802 (A) and V. parahaemolyticus J5421 (B)

設(shè)定4 個(gè)防腐劑的質(zhì)量濃度均為MIC、1/2 MIC、1/4 MIC、1/8 MIC，測(cè)定它們對(duì)兩株副溶血弧菌的生物膜形成的影響。從圖1可以看出，不同質(zhì)量濃度的4 種防腐劑對(duì)副溶血弧菌生物膜的形成有顯著的抑制作用，隨著質(zhì)量濃度的升高，抑制率明顯增大。殼聚糖質(zhì)量濃度為MIC和1/8 MIC時(shí)對(duì)兩株菌生物膜的抑制率分別為70.98%、14.38%和67.90%、13.94%；山梨酸鉀質(zhì)量濃度為MIC和1/8 MIC時(shí)對(duì)兩株菌生物膜的抑制率分別為50.16%、7.06%和43.07%、9.93%；脫氫乙酸鈉質(zhì)量濃度為MIC和1/8 MIC時(shí)對(duì)ATCC17802菌株、J5421菌株生物膜的抑制率分別為66.35%、11.50%和55.74%、10.23%；ε-聚賴氨酸質(zhì)量濃度為MIC和1/8 MIC時(shí)對(duì)兩株菌生物膜的抑制率分別為56.50%、9.67%和50.97%、7.22%。其中殼聚糖的抑制效果最顯著。兩株菌之間無(wú)顯著差異。

2.3 不同質(zhì)量濃度防腐劑對(duì)副溶血弧菌生物膜代謝活性的影響

圖2 不同防腐劑對(duì)ATCC17802菌株（A）和J5421菌株（B）生物膜代謝活性影響Fig. 2 Effects of different food preservatives on the metabolic activity of V. parahaemolyticus ATCC17802 (A) and V. parahaemolyticus J5421 (B)

將培養(yǎng)后的菌株ATCC17802和J5421，通過(guò)XTT法檢測(cè)4 種防腐劑在不同質(zhì)量濃度條件下對(duì)兩株菌代謝活性的影響，結(jié)果如圖2所示。可以看出隨著防腐劑質(zhì)量濃度的增加，生物膜代謝活性抑制率逐漸增大。殼聚糖質(zhì)量濃度為MIC和1/8 MIC時(shí)對(duì)兩株菌生物膜代謝活性的抑制率分別為46.83%、17.17%和52.40%、12.37%；山梨酸鉀質(zhì)量濃度為MIC和1/8 MIC時(shí)對(duì)兩株菌生物膜代謝活性的抑制率分別為24.81%、8.66%和23.59%、8.77%；脫氫乙酸鈉質(zhì)量濃度為MIC和1/8MIC時(shí)對(duì)兩株菌生物膜代謝活性的抑制率分別為40.63%、10.57%和37.06%、13.85%；ε-聚賴氨酸質(zhì)量濃度為MIC和1/8MIC時(shí)對(duì)兩株菌生物膜代謝活性的抑制率分別為33.58%、7.79%和32.98%、9.60%。其中，殼聚糖的抑制作用最強(qiáng)，即使亞抑菌質(zhì)量濃度，1/2 MIC處理時(shí)，仍有明顯的抑制作用。

2.4 不同質(zhì)量濃度防腐劑對(duì)副溶血弧菌胞外多糖產(chǎn)生的影響

圖3 防腐劑對(duì)ATCC17802菌株（A）和J5421菌株（B）生物膜胞外多糖產(chǎn)生的影響Fig. 3 Effects of different food preservatives on EPS secretion of V. parahaemolyticus ATCC17802 (A) and V. parahaemolyticus J5421 (B)

胞外多糖是細(xì)菌生物膜的主要成分，既是生物膜結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)，又是功能的主要承擔(dān)者[20]。因此，抑制或減少細(xì)菌分泌胞外多糖，是抑制生物膜形成的一種重要方法。將培養(yǎng)后的菌株ATCC17802和J5421，通過(guò)苯酚-硫酸法檢測(cè)4 種防腐劑在不同質(zhì)量濃度條件下對(duì)兩株菌胞外多糖的影響，結(jié)果如圖3所示。隨著防腐劑質(zhì)量濃度的增加，生物膜胞外多糖抑制率逐漸增大。殼聚糖質(zhì)量濃度為MIC和1/8 MIC時(shí)對(duì)兩株菌生物膜胞外多糖的抑制率分別為78.04%、27.01%和76.87%、29.38%；山梨酸鉀質(zhì)量濃度為MIC和1/8 MIC時(shí)對(duì)兩株菌生物膜胞外多糖的抑制率分別為55.53%、17.25%和48.56%、14.30%；脫氫乙酸鈉質(zhì)量濃度為MIC和1/8 MIC時(shí)對(duì)兩株菌生物膜胞外多糖的抑制率分別為67.53%、24.08%和64.65%、18.04%；ε-聚賴氨酸質(zhì)量濃度為MIC和1/8 MIC時(shí)對(duì)兩株菌生物膜胞外多糖的抑制率分別為60.33%、18.14%和56.76%、 14.18%。而且，亞抑菌質(zhì)量濃度1/2 MIC條件下的4 種防腐劑的抑制作用強(qiáng)度與MIC的抑制作用無(wú)顯著差異，與1/4 MIC和1/8 MIC的抑制作用有顯著性差異（P＜0.05）。其中，殼聚糖對(duì)兩株菌生物膜胞外多糖的產(chǎn)生影響最大。

3 結(jié)論與討論

4 種防腐劑在MIC以及亞抑菌質(zhì)量濃度條件下對(duì)副溶血弧菌生物膜均有明顯的抑制作用，不僅抑制了生物膜的形成，而且生物膜內(nèi)細(xì)菌的代謝活性明顯下降，胞外多糖的分泌也減少了。其中殼聚糖對(duì)副溶血弧菌生物膜的抑制作用最強(qiáng)，其對(duì)兩株菌的生物膜抑制率分別為70.98%和67.90%，代謝活性抑制率分別為46.83%和52.40%，胞外多糖的抑制率分別為78.04%和76.87%。

近年來(lái)尋求天然、高效、安全的防腐劑以控制生物膜的研究逐漸興起，如有研究報(bào)道了天然產(chǎn)物（生姜提取物、大蒜提取物、茶多酚、留蘭香精油）可有效地抑制副溶血弧菌生物膜的形成[20-21]。殼聚糖、山梨酸鉀、脫氫乙酸鈉、ε-聚賴氨酸是應(yīng)用較廣的食品防腐劑，它們的抑菌譜不同，抑菌效果也大不相同。本實(shí)驗(yàn)考察了這兩種天然防腐劑和兩種化學(xué)防腐劑對(duì)副溶血弧菌生物膜的抑制作用，研究發(fā)現(xiàn)這4 種防腐劑對(duì)副溶血弧菌生物膜均有顯著的抑制作用，在MIC以及亞抑菌質(zhì)量濃度條件下，對(duì)生物膜的形成量、代謝活性、胞外多糖的產(chǎn)生皆表現(xiàn)出抑制效果，其中殼聚糖的抑制作用最強(qiáng)。殼聚糖對(duì)于細(xì)菌成熟生物膜的作用，可能是殼聚糖通過(guò)自身所帶的正電荷與微生物細(xì)胞膜所攜帶的負(fù)電荷相互作用，破壞細(xì)菌細(xì)胞壁原有結(jié)構(gòu)，造成細(xì)胞成分的泄漏而起到抗菌作用[22]。一些小分子的殼聚糖可以滲透進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)與帶陰離子的生物大分子發(fā)生作用，破壞細(xì)胞的正常代謝活動(dòng)，從而抑制細(xì)菌的生長(zhǎng)[23]。胡春紅等[24]研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)過(guò)殼聚糖涂膜后的介質(zhì)表面對(duì)細(xì)菌和真菌生物膜的形成具有抑制作用；Zheng Zhonghui等[25]研究發(fā)現(xiàn)殼聚糖結(jié)合抗生素對(duì)李斯特菌被膜的抑制和清除作用顯著。Costa等[26]研究表明低濃度的山梨酸鉀對(duì)金黃色葡萄球菌的生長(zhǎng)和生物膜形成具有明顯的抑制作用，高鹽濃度下山梨酸鉀會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)外滲透壓改變，使得細(xì)胞膨脹細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)外溢，生物膜結(jié)構(gòu)受到破壞，從而導(dǎo)致細(xì)菌生存能力下降[27]。此外，脫氫乙酸鈉的抗菌作用主要在于氨基酸脫氫酶的活性[28]。也有研究報(bào)道ε-聚賴氨酸在酸性條件下與乳酸鏈球菌素復(fù)配使用，能夠更好地抑制微生物的生長(zhǎng)[29]，其作用機(jī)制主要是因?yàn)殪o電相互作用的影響以及進(jìn)入生物膜的能力的差異性，對(duì)生物膜的抑制作用受到周?chē)后w中二價(jià)陽(yáng)離子的影響，減小pH值和增加ε-聚賴氨酸的正電荷可以有效抑制生物膜形成[30]。因此，防腐劑在控制細(xì)菌生物膜方面具有較好的應(yīng)用前景，可進(jìn)一步開(kāi)發(fā)復(fù)合抗生物膜制劑，減少使用量，提高效果。

參考文獻(xiàn)：

[1] 滕勇勇, 王琪, 吳雷, 等. 致病性弧菌的生物學(xué)特性和致病因子研究進(jìn)展[J]. 熱帶醫(yī)學(xué)雜志, 2014, 14(10): 1396-1398.

[2] SU Yicheng, LIU Chengchu. Vibrio parahaemolyticus: a concern of seafood safety[J]. Food Microbiology, 2007, 24(6): 549-558. DOI:10.1016/j.fm.2007.01.005.

[3] DRAKE S L, DEPAOLA A, JAYKUS L A. An overview of Vibrio vulnif i cus and Vibrio parahaemolyticus[J]. Comprehensive Reviews in Food Science and Food Safety, 2007, 6: 120-144. DOI:10.1111/j.1541-4337.2007.00022.x.

[4] 李明強(qiáng), 汪皓秋, 鄭偉, 等. 余杭區(qū)8 起副溶血弧菌食物中毒的同源性研究[J]. 中國(guó)衛(wèi)生檢驗(yàn)雜志, 2011, 21(2): 502-504.

[5] 劉秀梅, 陳艷, 郭云昌, 等. 2005年中國(guó)食源性疾病暴發(fā)事件監(jiān)測(cè)資料分析[J]. 中國(guó)食品衛(wèi)生雜志, 2008, 20(6): 506-509. DOI:10.3969/ j.issn.1004-8456.2008.06.012.

[6] 龍誠(chéng), 羅書(shū)全, 何源. 一起副溶血性弧菌食物中毒的調(diào)查與分析[J].食品與發(fā)酵科技, 2010, 46(1): 97-99. DOI:10.3969/j.issn.1674-506X.2010.01-025.

[7] 嚴(yán)紀(jì)文, 朱海明, 王海燕, 等. 2000—2005年廣東省食品中食源性致病菌的監(jiān)測(cè)與分析[J]. 中國(guó)食品衛(wèi)生雜志, 2006, 15(6): 528-531. DOI:10.3969/j.issn.1004-8456.2006.06.009.

[8] ELEXSON N, AFSAH-HEJRI L, RUKAYADI Y, et al. Effect of detergents as antibacterial agents on biofilm of antibiotics-resistent Vibrio parahaemolyticus isolates[J]. Food Control, 2014, 35(1): 378-385. DOI:10.1016/j.foodcont.2013.07.020.

[9] WHITEHEAD K A, VERRAN J. Formation, architecture and functionality of microbial biofilms in the food industry[J]. Current Opinion in Food Science, 2015, 2: 84-91. DOI:10.1016/ j.cofs.2015.02.003.

[10] SMIRNOVA T A, DIDENKO L V, AZIZBEKYAN R R, et al. Structural and functional characteristics of bacterial biofilms[J]. Microbiology, 2010, 79(4): 413-423. DOI:10.1134/ S0026261710040016.

[11] 何年安, 王文平. 超聲在細(xì)菌生物膜相關(guān)感染治療中的應(yīng)用[J].中華超聲影像學(xué)雜志, 2012, 21(9): 815-817. DOI:10.3760/cma. j.issn.1004-4477.2012.09.025.

[12] GUPTA P, SARKAR S, DAS B, et al. Biofilm, pathogenesis and prevention-a journey to break the wall: a review[J]. Archives of Microbiology, 2016, 198: 1-15. DOI:10.1007/s00203-015-1148-6

[13] TAYLOR P K, YEUNG A T Y, HANCOCK R E W. Antibiotic resistance in Pseudomonas aeruginosa biofilms: towards the development of novel anti-biofilm therapies[J]. Journal of Biotechnology, 2014, 191: 121-130. DOI:10.1016/ j.jbiotec.2014.09.003.

[14] HAN N, MIZAN M F R, JAHID I K, et al. Biof i lm formation by Vibrio parahaemolyticus on food and food contact surfaces increases with rise in temperature[J]. Food Control, 2016, 70: 161-166. DOI:10.1016/ j.foodcont.2016.05.054.

[15] 陳珍, 覃映雪, 鄒文政, 等. 致病性副溶血弧菌生物膜形成特性研究[J].海洋學(xué)報(bào), 2010, 32(5): 110-116.

[16] 渠宏雁, 孟良玉, 劉錦峰, 等. 副溶血性弧菌生物被膜的形成與優(yōu)化[J].中國(guó)食品學(xué)報(bào), 2013, 13(9): 56-61.

[17] 渠宏雁, 李學(xué)鵬, 儀淑敏, 等. 亞硝酸鈉對(duì)金黃色葡萄球菌和副溶血性弧菌生物被膜形成的抑制作用[J]. 食品工業(yè)科技, 2015, 36(21): 178-182.

[18] MEJDI S, DEHMANI A, NOUMI E, et al. Chemical composition and antibiof i lm activity of Petroselinum crispum and Ocimum basilicum essential oils against Vibrio spp. strains[J]. Microbial Pathogenesis, 2016, 90: 13-21. DOI:10.1016/j.micpath.2015.11.004.

[19] 王桂洋. 殼聚糖對(duì)希瓦氏菌生物被膜抑制和清除作用的研究[D]. 杭州: 浙江工商大學(xué), 2015: 30.

[20] 郭欽, 徐海棠, 楊龍平, 等. 不同條件下副溶血弧菌生物膜形成規(guī)律及其天然抑制物質(zhì)的研究[J]. 食品工業(yè)科技, 2014, 35(10): 110-115.

[21] SNOUSSI M, NOUMI E, TRABELSI N, et al. Mentha spicata essential oil: chemical composition, antioxidant and antibacterial activities against planktonic and biofilm cultures of Vibrio spp. strains[J]. Molecules, 2015, 20: 14402-14424. DOI:10.3390/ molecules200814402.

[22] CARLSON R P, TAFFS R, DAVISON W M, et al. Antibiofilm properties of chitosan-coated surfaces[J]. Journal of Biomaterials Science Polymer Edition, 2008, 19(8): 1035-1046. DOI:10.1163/156856208784909372.

[23] MU Haibo, ZHANG Amin, ZHANG Lin, et al. Inhibitory effects of chitosan in combination with antibiotics on Listeria monocytogenes biofilm[J]. Food Control, 2014, 38: 215-220. DOI:10.1016/ j.foodcont.2013.10.032.

[24] 胡春紅, 葛紅蓮, 李季平, 等. 苯甲酸鈉對(duì)大腸桿菌和金黃色葡萄球菌生長(zhǎng)的影響[J]. 食品工業(yè)科技, 2011, 32(4): 180-181.

[25] ZHENG Zhonghui, ZENG Wei, HUANG Yaojian, et al. Detection of antitumor and antimicrobial activities in marine organism associated actinomycetes isolated from the Taiwan Strait, China[J]. FEMS Microbiology Letters, 2000, 188(1): 87-91. DOI:10.1111/j.1574-6968.2000.tb09173.x.

[26] COSTA E M, SILVA S, MADUREIRA A R, et al. A comprehensive study into the impact of a chitosan mouthwash upon oral microorganism’s biof i lm formation in vitro[J]. Carbohydrate Polymers, 2014, 101: 1081-1086. DOI:10.1016/j.carbpol.2013.09.041.

[27] NOSANCHUK J D, CASADEVALL A. Cellular charge of Cryptococcus neoformans: contributions from the capsular polysaccharide, melanin, and monoclonal antibody binding[J]. Infection and Immunity, 1997, 65(5): 1836-1841.

[28] MORTEN H, TINA M, BRIAN S V, et al. The antimicrobial mechanism of action of epsilon-poly-l-lysine[J]. Applied Environmental Microbiology, 2014, 80(24): 7758-7770. DOI:10.1128/ AEM.02204-14.

[29] van der WAAL S V, JIANG L M, de SOET J J, et al. Sodium chloride and potassium sorbate: a synergistic combination against Enterococcus faecalis biof i lms: an in vitro study[J]. European Journal of Oral Sciences, 2012, 120(5): 452-457. DOI:10.1111/j.1600-0722.2012.00982.x.

[30] ZHANG Hui, WEI Hewen, CUI Yinan, et al. Antibacterial interactions of monolaurin with commonly used antimicrobials and food components[J]. Journal of Food Science, 2009, 74(7): M418-M421. DOI:10.1111/j.1750-3841.2009.01300.x.

Inhibitory Effects of Four Kinds of Food Preservatives on Biof i lm Formation by Vibrio parahaemolyticus

LEI Huan1,2, XIE Ting1, WEI Yuqing1, LIU Huan1, ZHONG Qingping1,*
(1. College of Food Science, South China Agricultural University, Guangzhou 510642, China; 2. The Third Aff i liated Hospital, Sun Yat-sen University, Guangzhou 510630, China)

In this study, we analyzed the minimum inhibitory concentrations (MICs) of four kinds of food preservatives (chitosan, potassium sorbate, sodium dehydroacetate and ε-polylysine) for Vibro parahaemolyticus, and we then investigated their inhibitory effects on biof i lm formation by V. parahaemolyticus. The crystal violet straining method was conducted to determine the amount of biof i lm, and XTT reduction assay and phenol-sufuric acid method were used to detect the changes of metabolic activities and extracellular polysaccharide of biofilm, respectively. The results showed that the MIC of chitosan was the lowest, which was 1.25 mg/mL. At both MIC and sub-MIC, these four food preservatives could not only demonstrate a remarkable inhibitory effect on biof i lm formation by V. parahaemolyticus, but also reduce the metabolic activity and the secretion of extracellular polysaccharides of cells in biof i lms. Among these preservatives, the inhibitory effect of chitosan was the strongest.

Vibrio parahaemolyticus; biof i lm; food preservatives; inhibition

10.7506/spkx1002-6630-201707002

TS201.3

A

1002-6630（2017）07-0006-05

雷歡, 謝婷, 魏宇清, 等. 4 種防腐劑對(duì)副溶血弧菌生物膜形成的抑制作用[J]. 食品科學(xué), 2017, 38(7): 6-10. DOI:10.7506/ spkx1002-6630-201707002. http://www.spkx.net.cn

LEI Huan, XIE Ting, WEI Yuqing, et al. Inhibitory effects of four kinds of food preservatives on biofilm formation by Vibrio parahaemolyticus[J]. Food Science, 2017, 38(7): 6-10. (in Chinese with English abstract)

10.7506/spkx1002-6630-201707002. http://www.spkx.net.cn

2016-06-29

國(guó)家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目（31271956）

雷歡（1990—），女，碩士，研究方向?yàn)槭称焚|(zhì)量與安全。E-mail：15017568226@163.com

*通信作者：鐘青萍（1967—），女，副教授，博士，研究方向?yàn)槭称钒踩?、食品微生物。E-mail：zhongqp@scau.edu.cn