犬膝關(guān)節(jié)骨關(guān)節(jié)炎動(dòng)物模型血清及關(guān)節(jié)液中IL-1、TNF-α和HA的分析

劉健瑩，羅春海，劉瑤，鄭程遠(yuǎn)，鄒曉，徐美花，付世新

（黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，大慶 163319）

犬膝關(guān)節(jié)骨關(guān)節(jié)炎動(dòng)物模型血清及關(guān)節(jié)液中IL-1、TNF-α和HA的分析

劉健瑩，羅春海，劉瑤，鄭程遠(yuǎn)，鄒曉，徐美花，付世新

（黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，大慶 163319）

測定模型組與對照組犬的血清和關(guān)節(jié)液中IL-1、TNF-α和HA濃度，為驗(yàn)證犬膝關(guān)節(jié)骨關(guān)節(jié)炎（OA）不同階段與其濃度變化是否具有臨床意義。將36只犬隨機(jī)平均分成為模型組和對照組，模型組采用前十字韌帶切斷法建立犬膝關(guān)節(jié)骨性關(guān)節(jié)炎模型，對照組只切開關(guān)節(jié)囊不切斷前十字韌帶。造模后第4、8、12周分別采集各組血清和關(guān)節(jié)液樣品，用ELISA方法定量測定各項(xiàng)指標(biāo)濃度。結(jié)果在第4、8、12周模型組與對照組IL-1、TNF-α和HA濃度比較分別差異顯著，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義P＜0.05。隨著模型組犬骨性關(guān)節(jié)炎的加重，犬關(guān)節(jié)液和血清中IL-l、TNF-α的濃度均呈逐漸升高趨勢，犬關(guān)節(jié)液中HA濃度呈逐漸升高，犬血清中HA的濃度呈下降。說明犬膝關(guān)節(jié)骨關(guān)節(jié)炎模型組血清及關(guān)節(jié)液各成分變化與OA的致病機(jī)制密切相關(guān)，能作為反應(yīng)OA病程的臨床指標(biāo)。

犬；IL-1；TNF-α；HA；膝關(guān)節(jié)骨關(guān)節(jié)炎

骨關(guān)節(jié)炎（Osteoarthritis，OA）是犬眾多疾病中常出現(xiàn)的一種疾病。據(jù)調(diào)查顯示有20%的中年犬和90%的老年犬患有1個(gè)或多個(gè)關(guān)節(jié)的OA[1]。由于OA是一個(gè)普遍存在的問題，獸醫(yī)需要一種盡早診斷疾病的精確方法。在骨關(guān)節(jié)炎疾病中，關(guān)節(jié)液的組成成分及理學(xué)性質(zhì)均發(fā)生變化，細(xì)胞因子含量的變化可以引發(fā)關(guān)節(jié)軟骨及滑膜出現(xiàn)不同程度的損傷，其中最重要的細(xì)胞因子白介素-1β（IL-1β）和細(xì)胞腫瘤壞死因子-ɑ（TNF-ɑ）是炎性反應(yīng)的調(diào)節(jié)劑，可使骨關(guān)節(jié)炎病理過程中的軟骨基質(zhì)降解和關(guān)節(jié)軟骨退變[2]?；褐型该髻|(zhì)酸（HA）可潤滑關(guān)節(jié)和有助于限制炎癥，為減緩疼痛和軟骨退化充當(dāng)減震器，并使關(guān)節(jié)以光滑幾乎無摩擦的方式移動(dòng)[3]。犬OA的診斷常見于中后期和不可逆的階段，治療只是減輕疼痛和延緩病情發(fā)展的一個(gè)治標(biāo)不治本的方式。通過科學(xué)方法對犬OA進(jìn)行的早期診斷、預(yù)防和治療，使犬OA的治愈變得更為現(xiàn)實(shí)。相關(guān)研究表明，OA發(fā)病時(shí)血清和關(guān)節(jié)液生化數(shù)值均有所上升或下降，與軟骨損傷密切相關(guān)[2]。所以實(shí)驗(yàn)選擇犬血清和關(guān)節(jié)液為研究對象。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組

實(shí)驗(yàn)選取36只健康普通雜種犬，平均體重23.3 kg，年齡范圍1～3歲。實(shí)驗(yàn)犬有單獨(dú)飼養(yǎng)的籠子，每天早晚定時(shí)進(jìn)食，自由飲水。并允許在研究開始之前有一個(gè)適應(yīng)期之后開始實(shí)驗(yàn)。按照隨機(jī)和重復(fù)的原則，將36只家犬隨機(jī)分為6組，4周、8周和12周對照組；4周、8周12周模型組。

1.2 主要試劑及儀器

ELISA試劑盒購買與上海古朵生物科技有限公司，離心機(jī)，海爾的電冰箱，2 mL，5 mL無菌針管，真空采血管，鹽水，移液器，移液器槍頭，頭孢曲松鈉，陸眠寧II。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 模型的制備

犬骨關(guān)節(jié)炎模型的制備：參考以往誘導(dǎo)成功率高，改良后穩(wěn)定性好的十字韌帶切斷法，均取家犬右側(cè)膝關(guān)節(jié)按前十字韌帶切斷法手術(shù)造模，用舒泰溶液按每0.2 mL·kg-1體重劑量靜脈給藥麻醉，將犬左側(cè)臥后四肢固定于手術(shù)臺上，用電剪將右后肢膝關(guān)節(jié)手術(shù)區(qū)域剃毛備皮，常規(guī)消毒皮膚做術(shù)前準(zhǔn)備。皮膚切口與膝關(guān)節(jié)屈曲處關(guān)節(jié)囊內(nèi)側(cè)髕旁，逐層切開進(jìn)入關(guān)節(jié)腔后，將髕骨翻向膝關(guān)節(jié)外側(cè)，屈曲膝關(guān)節(jié)，找到前十字韌帶切斷后，即可做前后抽屜試驗(yàn)證明前十字韌帶斷裂。隨后用生理鹽水沖洗關(guān)節(jié)腔，逐層縫合關(guān)節(jié)囊和肌肉筋膜組織，縫合皮膚切口。對照組實(shí)驗(yàn)犬手術(shù)操作同上，但是不切斷前十字韌帶。術(shù)中過程中要避免手術(shù)器械損傷軟骨、滑膜、肌肉及軟組織。手術(shù)一側(cè)肢體不固定，自由活動(dòng)，術(shù)后予各以頭孢曲松鈉50 mg·kg-1抗感染每天1次，連續(xù)皮下注射5 d，密切觀察傷口愈合情況，防止傷口感染和其他并發(fā)癥。自造模日起，每日早晚兩次室內(nèi)強(qiáng)迫驅(qū)趕家犬跑動(dòng)30 min。

1.3.2 血液樣本采集與保存

在造模后4周、8周和12周，使用5 mL注射器采集模型組及對照組犬后肢隱靜脈血液，置入3 000 r·min-1離心5 min。分離血清，并放入-80℃冰箱保存待檢。

1.3.3 膝關(guān)節(jié)關(guān)節(jié)液樣本的采集與保存

在造模后4周、8周和12周，采集模型組和對照組犬右肢膝關(guān)節(jié)內(nèi)關(guān)節(jié)液。使用舒泰麻醉后仰臥固定于手術(shù)臺上，用2 mL無菌注射器沿實(shí)驗(yàn)動(dòng)物右肢膝關(guān)節(jié)髕骨下髕直韌帶內(nèi)側(cè)關(guān)節(jié)間隙水平穿刺，將充分反復(fù)屈曲活動(dòng)犬膝關(guān)節(jié)數(shù)次，再在髕直韌帶外側(cè)關(guān)節(jié)間隙水平位置穿刺，用5 mL注射器抽取膝關(guān)節(jié)腔內(nèi)關(guān)節(jié)液1 mL，注入離心管，離心后迅速置于-80℃低溫冰箱中保存待測。

1.3.4 膝關(guān)節(jié)活動(dòng)度測定

先將犬膝關(guān)節(jié)完全抻直，而后使膝關(guān)節(jié)彎曲，用測量儀測量其抻直到彎曲的角度是膝關(guān)節(jié)活動(dòng)范圍，正常膝關(guān)節(jié)彎曲度約120～150°。在造模前、造模成功后及處死動(dòng)物前測量犬膝關(guān)節(jié)活動(dòng)范圍，使用儀器測量膝關(guān)節(jié)活動(dòng)最大值，左側(cè)關(guān)節(jié)活動(dòng)度是正常對照組，同一時(shí)間點(diǎn)每只犬膝關(guān)節(jié)測量3次，將3次測量平均值作為最終測量值。

1.3.5 血清和關(guān)節(jié)液主要成分的測定

IL-1、TNF-α和HA濃度測定樣本稀釋后按ELISA說明書測定。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法分析

比較OA模型組與對照組血清和關(guān)節(jié)液IL-1、TNF-α和HA濃度。用SPSS16.0軟件統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，將所得數(shù)據(jù)均以平均數(shù)和標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，組間選擇T檢驗(yàn)對檢測數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，P＜0.05為差異顯著的標(biāo)準(zhǔn)。

2 結(jié)果分析

2.1 臨床癥狀觀察

在造模完成時(shí)犬膝關(guān)節(jié)骨關(guān)節(jié)炎臨床評分結(jié)果顯示：犬骨關(guān)節(jié)炎模型組膝關(guān)節(jié)在臨床觸診及視診方面均有不同程度的腫脹，攣縮畸形等表現(xiàn)，由表1可知，膝關(guān)節(jié)活動(dòng)度在各時(shí)間點(diǎn)均明顯低于對照組（P＜0.01），模型組4周、8周及12周的伸直和屈曲的活動(dòng)度比較差異顯著，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。即膝關(guān)節(jié)在各個(gè)方面表現(xiàn)隨時(shí)間加重。

表1 模型組與對照組各不同時(shí)間點(diǎn)犬膝關(guān)節(jié)活動(dòng)度比較（，n=6，單位：度）Table 1 Comparison of the activity of model group and the control group of dogs knee in various time points（，n=6，Unit：degrees）

表1 模型組與對照組各不同時(shí)間點(diǎn)犬膝關(guān)節(jié)活動(dòng)度比較（，n=6，單位：度）Table 1 Comparison of the activity of model group and the control group of dogs knee in various time points（，n=6，Unit：degrees）

項(xiàng)目伸直屈曲4周 8周 12周對照組132.93±7.26 38.62±6.09模型組130.48±15.96 40.00±6.65對照組133.08±7.40 38.69±5.94模型組128.19±14.86 40.86±7.09對照組133.00±12.49 38.77±6.00模型組128.24±14.90 41.27±8.46

2.2 犬血清中IL-1β、TNF-ɑ和HA的檢測結(jié)果

由表2可知，造模后4周、8周和12周，模型組犬血清中IL-1β濃度呈升高趨勢，但在第8周時(shí)出現(xiàn)波動(dòng)，第4周和第8周模型組濃度水平較對照組顯著性升高（P＜0.05），第12周模型組較對照組極顯著性升高（P＜0.01）。第4周與第8周、第8周與第12周模型組血清中的IL-1β含量均差異顯著（P＜0.05），而第4周與第12周模型組血清中的IL-1β含量水平比較差異無顯著（P＞0.05）。

表2 模型組與對照組第4，8，12周犬血清中IL-1β值（，pg·mL-1）Table 2 IL-1β values of canine serum of model group and control group at 4，8 and 12 weeks（，pg·mL-1）

表2 模型組與對照組第4，8，12周犬血清中IL-1β值（，pg·mL-1）Table 2 IL-1β values of canine serum of model group and control group at 4，8 and 12 weeks（，pg·mL-1）

4周8周12周對照組27.45±1.58 25.06±3.91 26.26±2.23模型組61.06±7.05 58.89±7.23 77.47±8.71 P值P＜0.05 P＜0.05 P＜0.01

由表3可知，造模后4周、8周和12周，模型組犬血清中TNF-α濃度水平與對照組比較均有顯著性差異（P＜0.05），但第12周模型組與對照組比較差異極顯著（P＜0.01）。隨著造模時(shí)間的推移，模型組犬血清中TNF-α的濃度呈升高趨勢，模型組犬血清中TNF-α濃度三組組間比較結(jié)果顯示均有差異顯著（P＜0.05）。

表3 模型組與對照組第4，8，12周犬血清中TNF-α值（，pg·mL-1）Table 3 TNF-α values of canine serum of model group and control group at 4，8 and 12 weeks（，pg·mL-1）

表3 模型組與對照組第4，8，12周犬血清中TNF-α值（，pg·mL-1）Table 3 TNF-α values of canine serum of model group and control group at 4，8 and 12 weeks（，pg·mL-1）

4周8周12周對照組37.71±1.42 36.60±1.53 36.60±0.76模型組95.16±4.05 97.40±0.88 134.65±6.76 P值P＜0.05 P＜0.05 P＜0.01

表4可知：手術(shù)造模后4周、8周和12周，膝關(guān)節(jié)骨關(guān)節(jié)炎模型組犬血清中HA的濃度與對照組比較均有顯著差異（P＜0.05），但第8周和第12周模型組與對照組比較極顯著性差異（P＜0.01）。隨造模時(shí)間延長，模型組犬血清中HA的濃度呈逐漸下降，模型組組間比較無顯著性差異（P＞0.05）。

表4 模型組與對照組第4，8，12周犬血清中HA值（，ng·mL-1）Table 4 HA values of canine serum of model group and control group at 4，8 and 12 weeks（，ng·mL-1）

表4 模型組與對照組第4，8，12周犬血清中HA值（，ng·mL-1）Table 4 HA values of canine serum of model group and control group at 4，8 and 12 weeks（，ng·mL-1）

4周8周12周對照組237.67±44.98 200.33±51.81 222.17±63.88模型組158.21±43.17 132.34±45.03 115.24±52.62 P值P＜0.05 P＜0.01 P＜0.01

2.3 犬關(guān)節(jié)液中IL-1β、TNF-α和HA的檢測結(jié)果

由表5可知，造模后4周、8周、12周，膝關(guān)節(jié)骨關(guān)節(jié)炎模型組犬關(guān)節(jié)液中IL-1β濃度水平較對照組極顯著性升高（P＜0.01），隨著造模時(shí)間延長，模型組犬關(guān)節(jié)液中IL-1β濃度水平呈上升趨勢，第4周與第8周模型組比較無顯著差異（P＞0.05）；第12周與第4和8周模型組比較均有顯著性差異（P＜0.05）。

表5 模型組與對照組第4、8、12周犬關(guān)節(jié)液中IL-1β的測量（，pg·mL-1）Table 5 IL-1β measurement of canine synovial fluid in model group and control group at 4，8 and 12 weeks（，pg·mL-1）

表5 模型組與對照組第4、8、12周犬關(guān)節(jié)液中IL-1β的測量（，pg·mL-1）Table 5 IL-1β measurement of canine synovial fluid in model group and control group at 4，8 and 12 weeks（，pg·mL-1）

4周8周12周對照組71.58±2.21 72.81±2.58 74.94±7.84模型組107.84±4.72 117.84±5.50 164.08±12.43 P值P＜0.01 P＜0.01 P＜0.01

由表6可知，第4、8和12周膝關(guān)節(jié)骨關(guān)節(jié)炎模型組犬關(guān)節(jié)液中TNF-α濃度水平較對照組均為極顯著性升高（P＜0.01）。隨著軟骨病理改變的加重，模型組關(guān)節(jié)液中TNF-α濃度水平呈波動(dòng)式逐漸升高，模型組犬關(guān)節(jié)液中TNF-α濃度水平三組組間比較均有顯著性差異（P＜0.05）。

表6 模型組與對照組第4、8、12周犬關(guān)節(jié)液中TNF-α的測量（，pg·mL-1）Table 6 TNF-α measurement of canine synovial fluid in model group and control group at 4，8 and 12 weeks（，pg·mL-1）

表6 模型組與對照組第4、8、12周犬關(guān)節(jié)液中TNF-α的測量（，pg·mL-1）Table 6 TNF-α measurement of canine synovial fluid in model group and control group at 4，8 and 12 weeks（，pg·mL-1）

4周8周12周對照組90.67±3.51 93.14±3.78 92.08±7.87模型組160.68±3.24 156.38±7.09 217.51±6.51 P值P＜0.01 P＜0.01 P＜0.01

表7可知：手術(shù)造模后4、8和12周，膝關(guān)節(jié)骨關(guān)節(jié)炎模型組犬關(guān)節(jié)液中HA的濃度與對照組比較均有顯著差異（P＜0.05），隨造模時(shí)間延長，模型組犬血清中HA的濃度呈下降趨勢，第4周與第12周模型組組間比較具有顯著性差異（P＜0.05）。

表7 模型組與對照組第4、8、12周犬關(guān)節(jié)液中HA值（，mg·mL-1）Table 7 HA measurement of canine synovial fluid in model group and control group at 4，8 and 12 weeks（，mg·mL-1）

表7 模型組與對照組第4、8、12周犬關(guān)節(jié)液中HA值（，mg·mL-1）Table 7 HA measurement of canine synovial fluid in model group and control group at 4，8 and 12 weeks（，mg·mL-1）

4周8周12周對照組15.82±3.79 15.31±3.09 14.67±3.96模型組10.56±1.87 9.41±3.00 6.61±3.08 P值P＜0.05 P＜0.05 P＜0.05

3 討論

3.1 IL-1與OA

多項(xiàng)實(shí)驗(yàn)證明，細(xì)胞因子濃度對OA病理發(fā)展過程非常重要，細(xì)胞因子與滑膜、關(guān)節(jié)軟骨和軟骨下骨的功能改變密切相關(guān)。一些細(xì)胞因子在關(guān)節(jié)炎的病理過程中對關(guān)節(jié)軟骨和關(guān)節(jié)滑膜具有一定的破壞作用，其中最引人注目的是IL-1[4]。IL-1是一種多肽類物質(zhì)主要來源于巨噬細(xì)胞、纖維母細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、破骨細(xì)胞等，。IL-1的濃度在OA的整個(gè)病理過程中不斷變化，證明了IL-1在OA發(fā)病過程中有致病作用[5]。IL-1引導(dǎo)基質(zhì)金屬蛋白酶基因mRNA表達(dá)增高，使明膠酶、膠原酶及基質(zhì)溶解酶等合成和分泌的上升。IL-1激發(fā)軟骨細(xì)胞表現(xiàn)特定的基因圖譜，使軟骨基質(zhì)降解性蛋白質(zhì)的產(chǎn)生增加，造成軟骨的破壞，并參與血管重塑、新生血管形成軟骨基質(zhì)的破壞和重塑[6]。此外，IL-1通過對磷脂酶A2和環(huán)氧合酶等作用后，促進(jìn)滑膜細(xì)胞及軟骨細(xì)胞合成并釋放前列環(huán)素及其他炎性遞質(zhì)，從而產(chǎn)生強(qiáng)大的致炎作用。OA中IL-1嚴(yán)重?cái)_亂關(guān)節(jié)滑膜組織的新陳代謝，能促進(jìn)關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞外基質(zhì)蛋白降解。IL-1是一種多效性細(xì)胞因子，分別為IL-1ɑ與IL-1β兩種不同的亞型，兩者都能導(dǎo)致炎性反應(yīng)，但是IL-1β是致炎作用強(qiáng)于IL-1ɑ，IL-1ɑ致炎作用主要產(chǎn)生在細(xì)胞內(nèi)部，而IL-1β致炎作用是分泌到細(xì)胞膜外面產(chǎn)生，Pelletier JP等[8]人報(bào)道膝關(guān)節(jié)關(guān)節(jié)液中IL-1多以IL-1β為主要組成部分。有研究表明，在骨關(guān)節(jié)炎早期采用免疫組化法分析滑膜組織發(fā)現(xiàn)關(guān)節(jié)滑膜襯內(nèi)層細(xì)胞中有IL-1β。在關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞中IL-1β相對于關(guān)節(jié)內(nèi)的淋巴細(xì)胞聚集的地方和外周血管翳處較多。IL-1β刺激加速了滑膜的成纖維細(xì)胞上升，使滑膜細(xì)胞粘附分子表達(dá)升高，加強(qiáng)了滑膜細(xì)胞與浸潤性炎性細(xì)胞的反應(yīng)，形成不利于關(guān)節(jié)軟骨生存和生長的環(huán)境[9]。IL-1是與OA病變中有關(guān)的最重要促進(jìn)炎癥反應(yīng)的分解性細(xì)胞因子之一[7]。已有研究發(fā)現(xiàn)，膝關(guān)節(jié)動(dòng)物模型的關(guān)節(jié)液和血清中IL-1β水平均高于正常組。實(shí)驗(yàn)結(jié)果說明模型組血清，關(guān)節(jié)液中的IL-1β濃度分別與實(shí)驗(yàn)對照組對比，差異顯著（P＜0.05），說明隨著犬膝關(guān)節(jié)OA的病情的不斷加重，IL-1β濃度逐漸上升的趨勢，證明IL-1β對犬膝關(guān)節(jié)軟骨功能衰退和破壞的最具有影響力，是導(dǎo)致骨性關(guān)節(jié)炎發(fā)病過程中重要的炎癥調(diào)節(jié)因子。

3.2 TNF-α與OA

TNF-ɑ作為一種炎性細(xì)胞因子，影響關(guān)節(jié)軟骨的降解過程，還可以參與并介導(dǎo)多種炎癥反應(yīng)過程。OA的發(fā)生及發(fā)展與關(guān)節(jié)內(nèi)滑膜細(xì)胞分泌過多的TNF-ɑ有關(guān)，曾有學(xué)者認(rèn)為單核細(xì)胞等浸潤的炎性滑膜組織和變性的軟骨細(xì)胞可分泌形成TNF-α。TNF-α濃度到達(dá)一定程度可激活多型核細(xì)胞，增多滑膜細(xì)胞產(chǎn)生前列腺素E2，擴(kuò)張血管通透性。然而，現(xiàn)有實(shí)驗(yàn)證明關(guān)節(jié)液中TNF-α的突然升高主要是因?yàn)榛、B型細(xì)胞功能的異常引起的[10]，能誘發(fā)抗自身軟骨的自身免疫反應(yīng)，刺激軟骨基質(zhì)金屬蛋白酶的合成和分泌，從而導(dǎo)軟骨的破壞。在對骨關(guān)節(jié)炎患者的血清及關(guān)節(jié)液檢測中發(fā)現(xiàn)，TNF-ɑ濃度明顯高于正常人[11]，而骨性關(guān)節(jié)炎的關(guān)節(jié)液中TNF-ɑ是導(dǎo)致關(guān)節(jié)軟骨降解過程最早出現(xiàn)的細(xì)胞因子之一[12]。在創(chuàng)傷性骨關(guān)節(jié)炎病理變化過程中也與TNF-ɑ介導(dǎo)的炎性反應(yīng)有關(guān)[13]。體外研究表明，在病變的軟骨細(xì)胞和滑膜細(xì)胞內(nèi)，均可檢測大量TNF-ɑ的存在，TNF-ɑ能夠影響軟骨細(xì)胞基因表達(dá)，造成軟骨的主要成分Ⅱ型膠原和蛋白多糖的合成受到抑制，并促使其分解，同時(shí)Ⅰ、Ⅲ型膠原的合成增多，從而軟骨的結(jié)構(gòu)成分改變，導(dǎo)致關(guān)節(jié)炎的發(fā)生[14]。TNF-ɑ可以與破骨細(xì)胞前體上的TNFR-1結(jié)合，加快破骨細(xì)胞成熟，還可以使巨噬細(xì)胞集落刺激因子表達(dá)量上升，導(dǎo)致破骨細(xì)胞成熟及其功能增強(qiáng)，促使骨質(zhì)吸收及骨質(zhì)破壞[15]。查振剛通過研究證明，血清中TNF-ɑ的濃度和OA的輕重程度相關(guān)，OA晚期更加明顯[16]。實(shí)驗(yàn)分別在造模術(shù)后4、8、12周取相應(yīng)模型組的血清及關(guān)節(jié)液，用ELISA法檢測血清和關(guān)節(jié)液中TNF-α濃度，經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析：各實(shí)驗(yàn)組血清和關(guān)節(jié)液中的TNF-α濃度分別與相應(yīng)對照組相比，有顯著性差異（P＜0.05），由結(jié)果可以看出，TNF-α的濃度在4、8、12周時(shí)濃度有周明顯升高，高于對照組。同時(shí)，隨著OA病情的加重，血清和關(guān)節(jié)液中TNF-α濃度有上升趨勢，有明顯的相關(guān)性，說明利用血清和關(guān)液中TNF-α濃度變化證明OA的嚴(yán)重程度很有意義，但它并不能作為診斷OA的生化指標(biāo)。

3.3 HA與OA

關(guān)節(jié)液中的HA屬粘多糖物質(zhì)主要由滑膜B型細(xì)胞分泌，是關(guān)節(jié)液及軟骨基質(zhì)的主要組成成分，在關(guān)節(jié)液中濃度較機(jī)體的其他體液中為最高，關(guān)節(jié)液中正常濃度及正常屬性的HA主要功能為營養(yǎng)、潤滑和保護(hù)關(guān)節(jié)軟骨[17]。在骨關(guān)節(jié)炎疾病中，由于金屬蛋白酶類和細(xì)胞因子的作用，使滑膜組織產(chǎn)生自由基增多，HA的分泌減少導(dǎo)致關(guān)節(jié)液中HA濃度逐漸下降[18]。此外，透明質(zhì)酸酶活性的增高也導(dǎo)致關(guān)節(jié)液中HA分子量進(jìn)一步降解，使關(guān)節(jié)液中HA濃度下降[19]。在人類骨關(guān)節(jié)炎疾病的研究表明，OA患者隨病程延長血清中HA濃度增高，可作為疾病診斷和預(yù)后的指標(biāo)，而犬血清中HA濃度變化與之相反[20]。犬的關(guān)節(jié)液中HA濃度與年齡的變化相關(guān)，在未滿8個(gè)月的犬，血清中HA濃度升高顯著，老年犬與成年犬沒有顯著差異[21]。在骨關(guān)節(jié)炎的初期階段，由于各種病理性刺激的反應(yīng)使滑液HA濃度增加，HA合成克服軟骨的退化和損傷，隨著病情的發(fā)展，滑液中HA濃度與正?；怪蠬A的濃度相比較低[22]。犬膝關(guān)節(jié)骨骨關(guān)節(jié)炎的臨床癥狀如破行、疼痛和關(guān)節(jié)積液及關(guān)節(jié)液粘度的嚴(yán)重程度與關(guān)節(jié)液中HA的濃度密切相關(guān)，由于關(guān)節(jié)進(jìn)一步退化和關(guān)節(jié)炎癥的加重導(dǎo)致關(guān)節(jié)液中免疫細(xì)胞和炎性介質(zhì)的遷移和合成增加，使關(guān)節(jié)液中HA濃度下降[23]。髖關(guān)節(jié)發(fā)育不良性骨關(guān)節(jié)炎犬血清中HA的濃度明顯低于非髖關(guān)節(jié)發(fā)育不良犬，血清中HA的濃度變化能夠作為犬髖關(guān)節(jié)發(fā)育不良骨關(guān)節(jié)炎的診斷指標(biāo)[24]。實(shí)驗(yàn)結(jié)果，手術(shù)造模4、8和12周后，犬膝關(guān)節(jié)骨關(guān)節(jié)炎模型組血清和關(guān)節(jié)液中HA的濃度與對照組比較均P＜0.05有顯著差異，隨造模時(shí)間延長，模型組犬血清和血液中HA的濃度呈下降趨勢，模型組組間比較差異顯著。

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Analysis of IL-1，TNF-α and HA in Synovial Fluid and Serum of Dog Animal Model with Knee Osteoarthritis

Liu Jianying，Luo Chunhai，Liu Yao，Zheng Chengyuan，Zou Xiao，Xu Meihua，F(xiàn)u Shixin
（College of Animal Science and Veterinary Medicine，Heilongjiang Bayi Agricultural University，Daqing 163319）

Dog’s IL-1，TNF-α and HA concentration of serum and synovial fluid in model group and control group was determined to verify the clinical significance with the change in concentration at different stages of the canine knee osteoarthritis（OA）.36 dogs were randomly divided into model group and control group，Model group were cut off anterior cruciate ligament in dogs was established knee osteoarthritis model，control group were not cut off the joint capsule anterior cruciate ligament.At 4，8 and 12 weeks，respectively，the serum and synovial fluid samples were collected by using ELISA method for quantitatively determining the concentration of the indicators.The model group and control group IL-1，TNF-α and HA concentrations had relatively significant difference in the 4，8and 12 weeks，statistically significant P＜0.05.With the model group of canine osteoarthritis aggravated，IL-l and TNF-αof Canine synovial fluid and serum the concentration gradually increased，HA concentration of Canine synovial fluid gradually increased，HA concentrations of Canine serum decreased.The changes of serum and synovial fluid components of knee osteoarthritis model group canine were closely related to OA pathogenesis，which could be used as indicators reaction of clinical course of OA.

Dog；IL-1；TNF-α；HA；knee osteoarthritis

S857.16

A

1002-2090（2017）02-0029-06

10.3969/j.issn.1002-2090.2017.02.006

2016-04-10

劉健瑩（1986-），女，黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院2014級碩士研究生。

付世新，女，教授，博士研究生導(dǎo)師，E-mail：fushixin@163.com。