蛋白質半胱氨酸上的翻譯后修飾組分析方法進展

張曉勤+陳川+方彩云 陸豪杰

摘要 半胱氨酸的巰基具有很高的反應活性，作為親核、氧化還原催化反應、金屬結合及變構調節(jié)位點等在蛋白質的結構和功能中發(fā)揮著非常重要的作用，且容易發(fā)生多種翻譯后修飾，調控亦或損傷蛋白功能，與人類許多重要疾病關系密切，因此，定性與定量分析蛋白質半胱氨酸上的翻譯后修飾組對理解其生物學功能具有重要意義。本文綜述了近年來蛋白質半胱氨酸上常見的翻譯后修飾組的質譜和蛋白質組學分析方法進展。

關鍵詞半胱氨酸；蛋白質翻譯后修飾；質譜；蛋白質組學；綜述

1引言

自20世紀80年代以來，一系列軟電離技術如基質輔助激光解吸電離（MALDI）[1＼]和電噴霧電離（ESI）[2＼]發(fā)現(xiàn)后，生物質譜（MS）技術得到了迅速發(fā)展，為生命科學各領域包括蛋白質翻譯后修飾的研究提供了高通量、高靈敏和高分辨的分析平臺，并已成為現(xiàn)代生物技術快速發(fā)展的重要支撐。它不僅可提供修飾蛋白質的類型和位點信息，且可定量研究其修飾程度及變化，促進了人們對蛋白翻譯后修飾的理解。半胱氨酸（Cys，C）是一種存在于大多數(shù)蛋白質中頻次較低的氨基酸（約占1%～2%）[3＼]，但Cys的巰基反應活性高（親核性和氧化還原敏感性），常作為氧化還原催化反應、金屬結合及變構調節(jié)位點等在蛋白質的結構和功能中發(fā)揮重要作用，參與調控細胞識別、信號傳導等生理過程[4＼]。Cys巰基對細胞內局部環(huán)境的變化很敏感，易發(fā)生一系列非酶或酶催化的翻譯后修飾，從而快速、動態(tài)調控蛋白質的構型、活性等，甚至導致蛋白功能損傷，與人類許多重要疾病關系密切，因此，對蛋白質Cys上的翻譯后修飾組的研究具有十分重要的生物學意義，受到研究者的廣泛關注。但研究對象多為復雜的生物樣品，蛋白質豐度變化范圍大，而Cys被修飾的蛋白質/肽段大多豐度較低，在質譜分析過程中的信號容易受到抑制，常需特異富集后才能被有效鑒定；Cys上修飾種類多，但性質各異，在樣品處理或質譜分析時大多不穩(wěn)定，常需建立合適的質譜方法進行分析。此外，在質譜分析過程中，不同的離子斷裂方式如碰撞誘導解離（Collisioninduceddissociation，CID），高能碰撞解離（Highenergycollisiondissociation，HCD），電子捕獲解離（Electroncapturedissociation，ECD）和電子轉移解離（Electrontransferdissociation，ETD）等各有特點，能提供的碎片離子信息各不相同，在蛋白質翻譯后修飾研究中應用不同?；诖耍疚木C述了質譜和蛋白質組學分析方法對Cys殘基上一些常見的翻譯后修飾組的研究進展（如圖1示），包括氧化還原依賴的修飾如亞硝基化、Cys氧化和谷胱甘肽化等，脂質衍生親電試劑（Lipidderivedelectrophiles，LDEs）如4Hydroxy2nonenal（HNE）化修飾，及脂質修飾如棕櫚?；彤愇煜┗?。

2氧化還原依賴的翻譯后修飾

Cys巰基的氧化還原修飾是細胞信號轉導的一個重要機制。細胞進行有氧呼吸或代謝時不可避免地會產生“活性氮”（RNS）或“活性氧”（ROS）等高活性物質，這些天然副產物在細胞信號轉導及維持細胞穩(wěn)態(tài)中扮演著重要的角色；同時，在外界刺激下過量產生的RNS或ROS也會引起氧化應激甚至抗氧化防御系統(tǒng)的破壞，與心血管、腫瘤等重大疾病關系密切。

LM

2.1S亞硝基化修飾（SNitrosylation）

一氧化氮性質活潑，可共價結合到蛋白質Cys巰基上，使之變成亞硝基硫醇（SNO）形成S亞硝基化，這是一種可逆、氧化還原依賴的翻譯后修飾形式，參與調控幾乎所有的生物學過程，與人類疾病密切相關[5＼]。但SNO修飾蛋白豐度低，SNO穩(wěn)定性相對較差，質譜尤其是MALDIMS分析時[6＼]，SNO鍵比肽段的骨架結構更易碎裂，引起NO丟失，而在相對溫和的條件下如ESIMS分析，有時能檢測到含NO基團的修飾肽段[7＼]。Hao等[8＼]利用NO的中性丟失，發(fā)展了SNO修飾蛋白質及其位點的質譜直接檢測方法。Wang等[9＼]通過調節(jié)儀器參數(shù)（如椎體電壓等）和緩沖溶液的組成，可保持SNO鍵在質譜分析時不斷裂。為避免中性丟失，Beuve等[10＼]則先用N（6＼[生物素胺＼]3′（2′吡啶二硫）丙酰胺（biotinHPDP）衍生化NO修飾位點，再聯(lián)用不同的質譜碎裂方式（CID和HCD）進行分析。由于ETD是通過將電子從活潑的陰離子基團轉移到質子化的肽段上，誘發(fā)肽段主鏈發(fā)生斷裂，而側鏈上的SNO等修飾基團仍保留在肽段上，因此被越來越多地用于各種翻譯后修飾如亞硝基化的研究中[11＼]。但這些方法均限于純化的重組蛋白等簡單樣品的分析。

為高通量分析亞硝基化蛋白質及位點，在蛋白質組學領域中以生物素轉換方法（Biotinswitchmethod，BS）應用最為廣泛，一般是通過烷基化封閉蛋白質中的自由巰基，用抗壞血酸鹽選擇性還原SNO產生新的自由巰基，采用生物素化試劑如biotinHPDP標記新產生的自由巰基，再利用其中的生物素親和純化后質譜分析[12，13＼]，得到修飾蛋白和位點信息。但這類方法操作繁瑣，富集效率受多步反應的影響，內源性生物素化蛋白等可能會帶來背景干擾，而且富集材料的理化性質也會在很大程度上影響富集的效果。Camerini等[14＼]將SNO轉換成Histag標簽，再利用鎳柱純化目標蛋白，避免了內源性生物素化蛋白等的干擾。另外，有機汞樹脂[15＼]、丙基硫氧嘧啶功能化的瓊脂糖樹脂[16＼]和金納米粒子[17＼]等能直接與巰基反應的固相材料也被用于SNO化蛋白質的富集，通過一步反應即可實現(xiàn)目標蛋白的富集，操作更簡便快捷，避免了內源性生物素化蛋白的干擾，進而可提高富集效率。

為進一步研究不同生理、病理條件下SNO蛋白質的動態(tài)變化，相應的基于穩(wěn)定同位素標記的質譜定量分析方法也得到了迅速發(fā)展，利用化學衍生、體內代謝等方法在樣品中引入穩(wěn)定同位素標簽如13C和18O等，通過比較含“輕”和“重”同位素標簽的同一肽段的質譜峰信號強度，可實現(xiàn)定量研究。因此，在BS方法的基礎上，Zhang等[18＼]用與巰基反應的ICAT（Isotopecodedaffinitytag）試劑開展了亞硝基化定量蛋白質組研究，發(fā)現(xiàn)37條肽段在正常小鼠和Ⅱ型糖尿病小鼠中具有不同的修飾水平；Zhou等[19＼]則利用SILAC（Stableisotopelabelingwithaminoacidsincellculture）技術定量比較了LPS/IFNγ誘導前后RAW264.7細胞中亞硝基化蛋白質組。此外，iTRAQ（Isobarictagsforrelativeandabsolutequantitation）[20＼]和iodoTMT（Iodoacetyltandemmasstag）[21＼]也相繼用于亞硝基化定量蛋白質組研究中。這些標記定量方法分析原理不同，各有優(yōu)缺點。SILAC為體內代謝標記方法，“重”同位素標簽是在細胞培養(yǎng)過程中引入的，因此可減少實驗操作中帶來的誤差，但它不能用于臨床樣本等的定量分析。而ICAT、iTRAQ和iodoTMT標記技術則可用于體外樣品的標記定量，ICAT和iodoTMT是與巰基特異反應的試劑，質譜分析時，前者根據(jù)一級質譜定量，后者利用二級質譜定量；iTRAQ雖也屬二級質譜定量，但它是與肽段氨基反應進行同位素標記，因此需與SNO蛋白質特異富集方法結合使用。此外，SILAC和ICAT能同時標記的樣品數(shù)量相對較少，而iTRAQ和iodoTMT則能進行6組甚至更多樣品的同時定量分析，提高了分析通量。實際上，這些富集和定量分析方法大多是通用的，與Cys上特定修飾（如亞磺?；┑臉悠奉A處理方法相結合，也同樣適用其它修飾的定性和定量分析，如Wojdyla等[22＼]利用iodoTMT試劑同時定量分析了氧化應激狀態(tài)下大腸桿菌中亞硝基化和亞磺酰化這兩種修飾及其位點占有率，并發(fā)現(xiàn)它們常會發(fā)生在同一位點上；Araki等[23＼]定量研究了還原（如DTT）和氧化（如H2O2）條件下細胞中不同Cys殘基的氧化還原敏感程度。

2.2半胱氨酸氧化（Cysteineoxidation）

Cys巰基是胞內ROS的主要靶點，平均pKa≈8.5。受胞內環(huán)境、蛋白質三維結構、附近氨基酸的極性和帶電狀態(tài)等影響，不同蛋白質巰基的pKa不同，對氧化修飾的敏感度也不同，通常pKa較低的巰基較易被氧化，可被選擇性氧化生成次磺酸（CysSOH）、亞磺酸（CysSO2H）、磺酸（CysSO3H）及分子內/間二硫鍵（CysSSCys）[24＼]，其中次磺酸容易進一步氧化成二硫鍵、亞磺酸或磺酸，成為“氧化還原開關”影響信號轉導。

亞磺?；揎棧⊿Sulfenylation，SOH）由Cys巰基與氧化劑如H2O2、HClO和羥自由基等反應生成，S亞硝基硫醇（SNitrosothiol）也能水解產生亞磺?；揎?，對催化、信號傳導等都有重要作用。為高通量分析亞磺?；揎椀鞍踪|，Saurin等[25＼]利用亞砷酸鹽將次磺酸還原變?yōu)閹€基，在BS方法的基礎上，建立了選擇性富集亞磺?；揎椀鞍踪|的方法。由于雙甲酮可作為次磺酸的特異受體，所形成的加合物可用于檢測蛋白質中的次磺酸[26＼]，帶上生物素基團便可實現(xiàn)選擇性富集[27＼]用于組學研究中。但生物素偶聯(lián)的雙甲酮對細胞膜的滲透性較低，因此Carroll等[28～30＼]發(fā)展了含炔基和疊氮基的雙甲酮類似物探針，再利用點擊化學結合質譜分析研究了細胞內亞磺酰化修飾蛋白質組，該類探針能直接標記細胞內可能發(fā)生修飾的位點，且點擊化學反應效率高，提高了富集效率并減少了假陽性結果。為定量研究蛋白質亞磺酰化修飾，Seo等[31＼]發(fā)展了基于雙甲酮穩(wěn)定同位素標記試劑的質譜定量分析方法，ElKhatib等[32＼]則利用含金屬離子的雙甲酮試劑建立了基于ICPMS（Inductivelycoupledplasmamassspectrometry）的定量方法。

由于亞磺酸和磺酸的酸性極強，會明顯改變被修飾肽段的電荷特性，因此，Paulech等[33＼]發(fā)展了強陽離子交換和親水作用色譜聯(lián)用的分離純化方法，從心肌組織中鑒定到181個亞磺酸和磺酸化修飾位點。JP

二硫鍵（Disulfidebonds）是一種常見的蛋白質翻譯后修飾形式，發(fā)生在一級或高級結構中相鄰的Cys殘基之間，對蛋白質的穩(wěn)定性和生物活性至關重要。聯(lián)用不同的烷基化試劑，如先在非還原條件下用碘乙酰胺（IAM）標記蛋白質中原有自由Cys，加入還原劑打開二硫鍵后，再用N乙基馬來酰亞胺（NEM）等其它烷基化試劑封閉新產生的自由巰基，可在一定程度上通過烷基化標簽的質量數(shù)差異質譜分析其中的二硫鍵[34＼]。自上而下（Topdown）的蛋白質組技術是在質譜儀上直接對完整蛋白質進行分析，可提供完整蛋白質更豐富的信息，因此，利用質譜碎裂信息可獲取相關二硫鍵及其它翻譯后修飾的信息[35，36＼]。Scotcher等[37，38＼]將Topdown與穩(wěn)定同位素標記技術聯(lián)用，通過定量測定Cys巰基的氧化還原電位，建立了Cys巰基氧化還原活性位點的分析新方法。由于譜圖復雜、解譜困難，上述分析方法僅適用于簡單樣品的分析。為此，Lu等[39＼]發(fā)展了精確解析復雜樣品中蛋白質二硫鍵結構的高通量分析方法，包括克服蛋白質二硫鍵體外交換、保持其天然結構的樣品制備方法，以及二硫鍵交聯(lián)肽段的最優(yōu)質譜分析方法及配套的鑒定軟件pLinkSS，并開展了目前最大規(guī)模的蛋白質二硫鍵組學研究。

為富集含二硫鍵的蛋白質，BS方法也得到了廣泛應用。采用還原劑打開二硫鍵后用帶生物素標簽的烷基化試劑如biotinIAM、biotinHPDP等[40＼]標記，可純化富集目標蛋白/肽，用于質譜分析；也可用熒光試劑如碘乙酰胺熒光素、Cy3/Cy5馬來酰亞胺等標記，結合雙向凝膠電泳（2DE）分離進行定量分析[41＼]。對于鄰位的兩個巰基（一級結構中處于-CXnC-結構域，n=2～6，或三級結構中非常接近）形成的分子內二硫鍵，可用對、鄰位二巰基特異的試劑氧化苯胂（PAO）先封閉臨近的兩個巰基，用NEM烷基化封閉其它巰基后，用2，3二巰基丙磺酸除去PAO，重新暴露鄰位二巰基，再進行生物素化標記純化或熒光試劑標記結合2DE實現(xiàn)定性與定量分析[42＼]。其中ICAT試劑也常被用于二硫鍵的定量分析[43＼]。

2.3S谷胱甘肽化（Glutathionylation，proteinSSG）

谷胱甘肽（Glutathione，GSH）是細胞內含量豐富的一種含巰基小分子肽，是體內重要的抗氧化劑和自由基清除劑，它可通過與蛋白質Cys上的巰基形成二硫鍵使蛋白質發(fā)生谷胱甘肽化修飾。這是一種可逆的蛋白質翻譯后修飾形式，在基礎和氧化應激狀態(tài)下均能發(fā)生，在信號傳導、蛋白質穩(wěn)態(tài)、細胞氧化還原狀態(tài)調節(jié)等方面都發(fā)揮著重要作用，與心血管、神經系統(tǒng)疾病等相關[44＼]。

質譜是分析蛋白質及其翻譯后修飾狀態(tài)的有力工具，修飾前后蛋白質/肽段分子量的變化以及串級質譜中離子的碎片信息等，都能在一定程度上為蛋白質翻譯后修飾的研究提供證據(jù)[45＼]。Chen等[46＼]利用二級（MS2）和三級（MS3）譜圖信息分析了蛋白質Hemoglobin上104，93和112位點上的谷胱甘肽化修飾及其修飾程度，發(fā)現(xiàn)20位吸煙者中Cys104和Cys93的谷胱甘肽化程度顯著高于20位不吸煙者，且修飾程度與吸煙者每天吸煙的數(shù)量和吸煙指數(shù)顯著相關。不同的質譜碎裂模式下，產生的碎片離子信息不同，因此能為蛋白質的鑒定分析提供的信息也不盡相同。Chou等[47＼]比較了谷胱甘肽化肽段在不同碎裂模式（CID，HCD，ETD）下的MS/MS碎裂行為，發(fā)現(xiàn)HCD能得到更多留有谷胱甘肽化肽段的碎片離子信息，側鏈中性丟失較少，有助于修飾位點的鑒定。另外，Topdown技術也在重要蛋白質（如Ras、p53）的谷胱甘肽化等氧化修飾研究中發(fā)揮著越來越重要的作用[48～50＼]。

要分析復雜生物樣品中的谷胱甘肽化修飾蛋白質組，則需選擇性富集純化后再進行分析。現(xiàn)有高通量的分析方法有兩類：（1）基于谷胱甘肽標記的方法。利用生物素化谷胱甘肽類似物如還原型的BiotinGSH、氧化型的BiotinGSSG或谷胱甘肽乙酯（BiotinGEE）等[51＼]標記目標蛋白質，純化分離后進行組學分析，Zaffagnini等[52＼]用BiotinGEE方法從C.reinhardtii中鑒定到225個谷胱甘肽化修飾蛋白質。盡管能有效標記目標蛋白質，但外加的BiotinGSSG等可能會改變胞內正常巰基含量及GSH/GSSG比例[53＼]，且GSSG并不是生理條件下蛋白質谷胱甘肽化的主要途徑，可能會使一些蛋白質得不到分析。Chiang等[54＼]利用谷胱甘肽特異的酶（GspS）發(fā)展了一種可選擇性分析哺乳動物細胞中谷胱甘肽化蛋白質的方法，該酶能將生物素化的多胺基團連接到GSH上形成GSH衍生物，再利用生物素實現(xiàn)目標蛋白質的分離純化。這是與常規(guī)富集方法不同之處，由于酶的催化效率高且專一性強，因此，可在很大程度上提高富集的特異性和效率。Samarasinghe等[55＼]發(fā)現(xiàn)將谷胱甘肽合成酶突變后，可高效、選擇性地催化帶疊氮基團的Ala代替Gly，產生疊氮標記的谷胱甘肽，進而可利用點擊化學反應接上生物素等，實現(xiàn)谷胱甘肽化蛋白質的特異、靈敏檢測。（2）基于谷氧還蛋白介導還原反應（GRXmediatedreduction）的方法：谷氧還原蛋白是一種二硫鍵氧化還原酶，能特異切除與谷胱甘肽混合形成的二硫鍵，因此，NEM封閉樣品中自由巰基后，再用GRXs選擇性地還原產生新的自由巰基，最后利用含生物素等富集標簽的巰基反應試劑選擇性富集目標蛋白/肽[56＼]，結合iTRAQ[57＼]和TMT[58＼]等標記技術還能進行定量分析。

34羥基壬烯酸（HNE）修飾

LDEs如HNE等是細胞代謝和脂質過氧化的產物，具有很高的生物反應活性，能與蛋白質上組氨酸、賴氨酸，尤其是Cys發(fā)生邁克爾加成反應，從而改變蛋白質的功能，甚至損傷細胞機制。

盡管通過分析修飾前后分子量的變化，可用質譜直接檢測蛋白質的HNE修飾[59＼]，但含HNE修飾的肽段在CID模式下通常會發(fā)生中性丟失（156Da）[60＼]，基于此，Rauniyar等[61＼]發(fā)展了基于中性丟失掃描質譜直接分析HNE修飾及其位點的方法。Milic等[62＼]則利用7（二乙氨基）香豆素3甲酰肼特異衍生后，在正離子模式下產生特征的碎片離子，建立了HNE修飾肽段的分析方法。

為大規(guī)模分析HNE修飾蛋白質組，Roe等[63＼]先用肼化學法富集，再聯(lián)用中性丟失掃描和Q值脈沖裂解（PulsedQdissociation，PQD）兩種質譜掃描方式，鑒定了67個蛋白質上的125個修飾位點。肼化學法是基于肼基與醛基間的反應，由于非特異性吸附少，富集特異性高，在糖組學等領域中也應用廣泛。Maier研究組[64，65＼]利用醛基與羥胺反應生成肟的性質，發(fā)展了HNE修飾蛋白質組的選擇性富集新方法。與Cys上其它修飾類似，生物正交法也得到了廣泛的應用，Porter研究組[66，67＼]以含疊氮或炔基的HNE衍生物為分子探針，經施陶丁格連接或點擊化學反應連接上生物素后進行分離富集，建立了高通量分析HNE修飾蛋白質組的方法。

為定量研究HNE修飾蛋白質組，Han等[68＼]設計了酰肼功能化的同位素親和標簽（Hydrazidefunctionalizedisotopecodedaffinitytag，HICAT），利用酰肼與醛基的反應選擇性標記目標蛋白質，利用“輕”（12C）或“重”（13C）同位素進行質譜相對定量，但該標記試劑只能提供輕重兩種標記。Yang等[69＼]利用一種光可裂解的含炔基HNE類似物發(fā)展了選擇性富集HNE修飾蛋白質的方法，并利用該類似物中輕重同位素標簽，從RKO細胞中鑒定并定量了398個含炔基HNE類似物的蛋白質，其中386個發(fā)生在Cys上。此外，iTRAQ[70＼]、琥珀酰化[71＼]和二甲基[72＼]標記也被用于HNE修飾定量蛋白質組的研究中。

4S棕櫚酰化修飾（SPalmitoylation）

蛋白質的S棕櫚?；揎梉73＼]，即S?；揎棧⊿Acylation），通常是指16碳飽和脂肪酸在S?；D移酶的作用下通過硫酯鍵共價修飾到蛋白質Cys殘基上形成的。它是一種動態(tài)、可逆的脂質修飾，通過增加蛋白質的疏水性，調控蛋白質（如離子通道和激酶等）的結構、組裝、成熟及其功能，對細胞信號轉導、代謝和疾病的發(fā)生、發(fā)展等都起著重要作用。

棕櫚?；揎椈鶊F不穩(wěn)定，在樣品制備和質譜分析過程中易丟失。Ji等[74＼]考察了不同實驗條件（如反應溫度、試劑等）和質譜碎裂模式（CID，HCD，ECD和ETD）下棕櫚?；揎楇亩蔚姆€(wěn)定性，發(fā)現(xiàn)在常規(guī)的胰酶酶解條件下便可導致修飾基團的明顯丟失，相比于其它碎裂模式，ETD更適于直接鑒定棕櫚酰化修飾肽段。盡管已有利用質譜方法直接檢測棕櫚酰化修飾蛋白質的報道[75＼]，但也只限于簡單樣品的分析。目前用于大規(guī)模分離富集棕櫚?；揎椀鞍踪|組的方法主要有兩類，一是?；锼刂脫Q（Acylbiotinylexchange，ABE）[76，77＼]及其衍生方法[78，79＼]，即將蛋白質Cys殘基上的自由巰基烷基化封閉后，利用羥胺溶液選擇性水解，在棕櫚?；揎椢稽c處產生新的自由巰基，再與巰基特異的生物素化試劑反應后進行生物素親和純化或直接利用固相載體富集后進行組學分析；另一類則是基于疊氮[80＼]或炔基[81＼]棕櫚酸類似物代謝標記的方法，結合點擊化學可實現(xiàn)高通量的棕櫚?；揎椀鞍踪|組定性（含位點確定）甚至定量分析。本研究組也曾對此進行過綜述[82＼]。

5S異戊烯化（SPrenylation）

異戊烯化修飾是一種重要的脂質修飾，是法尼基（Farnesyl，C15）或牻牛兒牻牛兒基（Geranylgeranyl，C20）通過硫酯鍵連接到蛋白質C末端附近保守的CaaX結構域（a指脂肪族氨基酸，X通常為絲氨酸、甲硫氨酸、半胱氨酸、丙氨酸、谷氨酸或亮氨酸）或雙Cys結構域（CC/CXC，X為任意氨基酸）的Cys殘基上形成的，由法尼基轉移酶（FTase）和牻牛兒牻牛兒基轉移酶Ⅰ和Ⅱ（GGTaseⅠ和Ⅱ）[83＼]調控，形成法尼基化（Farnesylation）和牻牛兒牻牛兒基化（Geranylgeranylation）修飾，廣泛存在于動物、植物和真菌，在蛋白質的細胞定位、信號傳導等方面有重要作用。

法尼基化修飾肽段在質譜碎裂過程中會產生204Da的中性丟失[84＼]，在反相色譜中具有更強的保留，可與非修飾肽段分離[85＼]。Bhawal等[86＼]利用H2O2或間氯過氧苯甲酸將異戊烯化肽段氧化，在修飾位點處會產生巰脂鍵，再利用亞砜基在氣相中可斷裂而產生特征串級譜圖的性質，發(fā)展了一種研究蛋白質異戊烯化修飾的新方法，通過特征的質量丟失可在一次實驗中鑒定并區(qū)分法尼基化和牻牛兒牻牛兒基化肽段。此外，Topdown技術也被用于異戊烯化修飾蛋白質的研究中[87＼]。

為大規(guī)模富集和分析異戊烯化修飾蛋白質組，Nguyen等[88＼]以生物素牻牛兒焦磷酸（BGPP）為脂質供體，構建了一整套哺乳動物蛋白質異戊烯轉移酶選擇性地將BGPP連接到異戊烯化底物中用于分離分析胞內異戊烯化蛋白質的方法。為減小生物素對蛋白質的膜定位和下游信號傳導的干擾，研究者們進一步發(fā)展了以炔基或疊氮類似物為報告基團[89＼]的分析方法，Chan等[90＼]用azidoGG類似物為探針發(fā)展了牻牛兒牻牛兒基化蛋白質組的方法。由于炔基探針比疊氮的靈敏度更高，背景標記少[91＼]，Charron等[92，93＼]設計合成了炔基法尼醇（alkFOH）為報告基團用于異戊烯化蛋白質組的分析。

6展望

Cys作為蛋白質組成序列中一個重要且特殊的氨基酸，正被越來越多的研究者關注，但Cys殘基含量較低，被修飾的Cys豐度更低；Cys巰基反應活性高，修飾類型多樣，受環(huán)境影響大，且常存在Crosstalk，大大增加了Cys翻譯后修飾組研究的難度。與其它方法相比，質譜技術能直接分析多種翻譯后修飾的類型及位點，與分離富集方法和同位素標記等技術相結合，還能進行大規(guī)模地定性和定量分析，在（修飾）蛋白質組學研究中具有非常重要的地位。因此，現(xiàn)代質譜儀器、各種質譜碎裂技術（如CID，HCD，ECD和ETD）、分析策略（如Topdown）和分析軟件等的發(fā)展，都極大地促進了Cys修飾組的研究。由于這些修飾都發(fā)生在Cys上，所以無論是定性還是定量方法大多是通用的，先將樣品中自由巰基烷基化封閉，再用特定的還原劑還原特定的修飾獲得新的自由巰基，然后利用合適的試劑衍生、分離純化，進行定性與定量分析。需要指出的是，利用生物正交反應結合質譜分析進行Cys修飾組研究是近年的重要進展，也仍將是今后的研究熱點。相信隨著各項技術的不斷發(fā)展與成熟，Cys上的翻譯后修飾組分析方法必將得到迅速地發(fā)展，為進一步理解蛋白質的結構和功能提供更有力的支持。

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AbstractCysteinethiolshavehighreactionactivityandplaysignificantrolesinproteinstructuresandfunctionsasthesitesofnucleophilic，redoxcatalysis，metalbindingandallostericregulation.Duetothereactivityofthethiolgroup，cysteineresiduesareverypronetoposttranslationalmodifications（PTMs）suchasoxidation，lipidation，andsoon，whichcanregulate/damageproteinfunctionsandareassociatedwithmanydiseases.Thus，itisveryimportanttoqualitativelyandquantitativelyanalyzePTMsinthecysteineresiduesforfurtherunderstandingitsbiologicalfunctions.Thisreviewmainlyfocusesonthedevelopmentofmassspectrometricandhighthroughputproteomicapproachesforinvestigatingsomecommoncysteineposttranslationalmodifications.

KeywordsCysteine；Posttranslationalmodifications；Massspectrometry；Proteomics；Review

HQWT6JY（Received23August2016；accepted26September2016）

ThisworkwassupportedbytheNationalNaturalScienceFoundationofChina（Nos.21205018，21335002）