非靶向代謝組學(xué)用于藜蘆妨害人參治療脾氣虛的機(jī)制研究

林賀 皮子鳳 門麗慧 陳維佳 劉志強(qiáng) 劉忠英

摘要 采用超高效液相色譜串聯(lián)四級(jí)桿飛行時(shí)間質(zhì)譜（UPLC/QTOFMS）聯(lián)用技術(shù)，通過(guò)非靶向代謝組學(xué)方法分析大鼠尿液內(nèi)源性代謝物的變化，研究藜蘆妨害人參發(fā)揮藥效作用的機(jī)制。建立脾氣虛大鼠模型，連續(xù)給藥15天，測(cè)定力竭游泳時(shí)間及血液中白細(xì)胞、紅細(xì)胞、血紅蛋白的含量。結(jié)果表明，人參可顯著提高脾氣虛模型大鼠的力竭游泳時(shí)間（p<0.01），升高白細(xì)胞、紅細(xì)胞及血紅蛋白含量（p<0.05，p<0.01），藜蘆對(duì)脾氣虛模型大鼠各項(xiàng)指標(biāo)無(wú)明顯影響（p>0.05），人參與藜蘆配伍后對(duì)脾氣虛模型大鼠各項(xiàng)指標(biāo)均無(wú)顯著影響（p>0.05），表明藜蘆妨害了人參發(fā)揮藥效作用。采用UPLC/QTOFMS技術(shù)及非靶向代謝組學(xué)的方法分析了空白組、模型組、人參組、藜蘆組、參藜組對(duì)脾氣虛模型大鼠的尿液代謝組差異，其中主成分分析（PCA）得分圖顯示各組代謝輪廓有顯著差別，并通過(guò)正交偏最小二乘法判別分析（OPLSDA）及數(shù)據(jù)庫(kù)檢索，鑒定出15種人參干預(yù)調(diào)節(jié)脾氣虛模型大鼠的潛在生物標(biāo)志物，從中找出了7種人參藜蘆配伍后減弱人參上述干預(yù)作用的潛在生物標(biāo)志物，并對(duì)其涉及的代謝通路進(jìn)行了系統(tǒng)分析。上述研究結(jié)果表明，人參藜蘆配伍后妨害了人參對(duì)脾氣虛模型大鼠的治療作用，其機(jī)理可能是影響人參對(duì)體內(nèi)能量代謝、免疫平衡及氧化還原反應(yīng)等相關(guān)代謝的調(diào)節(jié)。

關(guān)鍵詞人參；藜蘆；配伍禁忌；脾氣虛；非靶向代謝組學(xué)

1引言

“相反”是中藥七情配伍理論的重要組成部分，屬于配伍禁忌，歷代各家本草均指出“十八反”決不可用。金元時(shí)期的醫(yī)家張子和總結(jié)了前人各家之說(shuō)創(chuàng)作了十八反的歌訣，其中人參作為“百草之王”應(yīng)用于數(shù)萬(wàn)方劑中，與藜蘆的相反作用也成為最有代表性配伍禁忌之一。

目前，關(guān)于“十八反”的作用機(jī)制的爭(zhēng)論主要集中在配伍后會(huì)增加毒性或降低藥效兩個(gè)方面[1～3＼]。但是在臨床應(yīng)用、合用后化學(xué)成分變化、藥效毒理以及藥物吸收代謝等方面的研究表明，“十八反”都沒(méi)有明顯一致的規(guī)律[4＼]。因此有效地結(jié)合新的研究技術(shù)及方法對(duì)配伍的每一個(gè)環(huán)節(jié)，如體內(nèi)吸收、分布、代謝、排泄和生理病理變化等情況進(jìn)行考察，挖掘其中的內(nèi)在聯(lián)系，有助于揭示“十八反”的科學(xué)內(nèi)涵[5，6＼]。

代謝組學(xué)作為系統(tǒng)生物學(xué)的分支，是研究代謝組在新陳代謝某一動(dòng)態(tài)時(shí)刻的變化規(guī)律的一門學(xué)科[7＼]。它將人體作為一個(gè)完整的動(dòng)態(tài)系統(tǒng)，因此被越來(lái)越多地應(yīng)用于中醫(yī)中藥的相關(guān)研究中[8，9＼]。目前，最常用的分析方法是核磁共振（NMR）和各種質(zhì)譜聯(lián)用，如液質(zhì)聯(lián)用（LCMS，UPLCMS，UPLCMS/MS），JP氣質(zhì)聯(lián)用（GCMS，GCQTOFMS/MS），電泳質(zhì)譜聯(lián)用（CEMS）和等離子體質(zhì)譜（ICPMS）等[9，10＼]。

代謝組學(xué)按其研究的目的可分為靶向和非靶向代謝組學(xué)。其中靶向代謝組學(xué)是研究少數(shù)幾種或幾類結(jié)構(gòu)、性質(zhì)相似或生化功能相關(guān)的內(nèi)源性代謝物。非靶向代謝組學(xué)則是針對(duì)生物樣品中盡可能多的內(nèi)源性代謝物進(jìn)行研究[11＼]。

本研究擬通過(guò)采用非靶向代謝組學(xué)的研究方法，結(jié)合UPLCMS聯(lián)用技術(shù)，在病理生理?xiàng)l件下考察“十八反”中人參與藜蘆這一具有代表性的反藥配伍組合干擾、改變、降低或消除藥效的作用機(jī)制，為更好地詮釋中醫(yī)藥配伍禁忌傳統(tǒng)理論提供科學(xué)依據(jù)。

2實(shí)驗(yàn)部分

2.1儀器與試劑

WatersAcquityUPLC液相色譜系統(tǒng)、QTOFSYNAPTG2HDMS質(zhì)譜儀（美國(guó)Waters公司）；MilliQ超純水儀（美國(guó)Millipore公司）；BC5300Vet全自動(dòng)血液細(xì)胞分析儀（中國(guó)深圳邁瑞公司生物醫(yī)療電子股份有限公司）；乙腈、甲酸（色譜純，美國(guó)Fisher公司）；紅細(xì)胞、白細(xì)胞、血紅蛋白生化測(cè)定試劑盒（中國(guó)長(zhǎng)春匯力生物技術(shù)有限公司）。

人參（PanaxginsengC.A.Mey.）購(gòu)自吉林撫松縣萬(wàn)良人參市場(chǎng)，藜蘆（VeratrumnigrumL.）購(gòu)自安徽豐原銅陵中藥飲片有限公司，分別取人參、藜蘆及人參藜蘆（以人參：藜蘆10KG-3∶KG-51比例合用）藥材適量，加10倍體積水浸泡1h，加熱回流提取兩次，每次1.5h，合并提取液，濃縮后凍干，保存?zhèn)溆谩?/p>

Wistar大鼠（中國(guó)吉林大學(xué)白求恩醫(yī)學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心），實(shí)驗(yàn)動(dòng)物許可證：SCXK（吉）20130001。

2.2動(dòng)物實(shí)驗(yàn)

雄性Wistar大鼠隨機(jī)分成5組，分別為空白組、模型組、人參組、藜蘆組、參藜組?？瞻捉M及模型組給予相同體積蒸餾水，其余各組分別灌胃給予相應(yīng)藥物，每日1次，連續(xù)15d。

除空白組外，其余各組在給藥同時(shí)開始造模[13＼]。造模第1天灌胃50°白酒10mL/kg，第2天以后每天灌胃食醋10mL/kg，同時(shí)喂飼體質(zhì)量5%的硝黃飼料（正常飼料、大黃粉、芒硝，以60KG-3∶KG-51KG-3∶KG-51的比例（質(zhì)量比）混合均勻，即成），每日下午大鼠背部固定質(zhì)量約為體質(zhì)量10%的鐵絲，放入水深50cm、水溫25℃～27℃的水槽中游泳，以力竭為度（大鼠鼻尖沒(méi)入水面10s以上），共15d。期間空白組大鼠喂飼正常飼料并進(jìn)行常規(guī)飼養(yǎng)。

第14d給藥1h后，測(cè)定各組大鼠力竭游泳時(shí)間，并放入代謝籠中收集24h尿液，離心，

80℃保存?zhèn)溆?。?5d給藥1h后，麻醉大鼠，腹主動(dòng)脈取血測(cè)定紅細(xì)胞、白細(xì)胞、血紅蛋白含量。

2.3色譜質(zhì)譜條件及樣品分析

選用WatersACQUITYUPLCBEHC18色譜柱（50mm×2.1mm，1.7μm）。

色譜條件：A乙腈，B超純水（0.1%甲酸）；梯度洗脫：0～3min，5%～20%A；3～6min，20%～50%A；6～9min，50%～100%A。柱溫：30℃；流速：0.4mL/min，進(jìn)樣量5μL。

質(zhì)譜條件：離子源ESI；電離源溫度120℃；錐孔氣為氮?dú)?，流?0L/h；去溶劑氣為氮?dú)?，溫?50℃，流速800L/h。正離子模式下毛細(xì)管電壓3.0kV，錐孔電壓35V，提取錐孔電壓5.0V；負(fù)離子模式下毛細(xì)管電壓2.0kV，錐孔電壓35V，提取錐孔電壓5.0V。

在本實(shí)驗(yàn)中，使用質(zhì)控樣品（Qualitycontrol，QC）進(jìn)行方法驗(yàn)證，用以保證整個(gè)分析系統(tǒng)的穩(wěn)定性。QC樣品是由每個(gè)樣品各取100μL混合得到，為降低誤差，樣品檢測(cè)為隨機(jī)進(jìn)行。在對(duì)樣品進(jìn)行分析前，為平衡系統(tǒng)先運(yùn)行5次QC樣品。在樣品的檢測(cè)過(guò)程中，每檢測(cè)5個(gè)正常樣品后運(yùn)行1次QC樣品，以衡量系統(tǒng)的穩(wěn)定性。

2.4數(shù)據(jù)處理

采用MassLynxV4.1和MarkerLynxApplicationManager對(duì)UPLC/QTOFMS檢測(cè)得到的數(shù)據(jù)進(jìn)行峰檢測(cè)、峰對(duì)齊以及歸一化。使用EZinfo2.0軟件中的PCA和OPLSDA進(jìn)行多元變量分析。使用SPSS13.0軟件進(jìn)行組間t檢驗(yàn)。使用生物學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)HMDB（http：//www.hmdb.ca/）、METLIN（http：//metlin.scripps.edu/）和KEGG（http：//www.kegg.com/）進(jìn)行潛在生物標(biāo)志物的鑒定和代謝通路的分析。JP

3結(jié)果與討論

3.1人參、藜蘆及人參藜蘆配伍合用對(duì)脾氣虛模型大鼠力竭游泳時(shí)間的影響

游泳耐力下降是脾氣虛證實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型最顯著的表現(xiàn)之一[14＼]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果（表1）顯示，與空白組比較，模型組大鼠力竭游泳時(shí)間明顯降低；與模型組比較，人參組大鼠力竭游泳時(shí)間顯著延長(zhǎng)，藜蘆組無(wú)明顯變化，表明人參能夠改善脾氣虛模型大鼠游泳耐力下降的狀況，但與藜蘆配伍合用后在一定程度上降低了這種作用。LM

3.2人參、藜蘆及人參藜蘆配伍合用對(duì)ZH（脾氣虛模型大鼠血液中白細(xì)胞、紅細(xì)胞、血紅蛋白含量的影響

傳統(tǒng)中醫(yī)認(rèn)為氣在機(jī)體內(nèi)具有防御作用，氣不足時(shí)會(huì)導(dǎo)致臟腑組織功能低下或衰退，其與現(xiàn)代免疫學(xué)有著相似之處，現(xiàn)代醫(yī)學(xué)認(rèn)為紅細(xì)胞和血紅蛋白下降會(huì)影響人體氣體交換，進(jìn)而影響中醫(yī)氣的生成[14＼]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果（表2）表明，與空白組比較，模型組大鼠白細(xì)胞、紅細(xì)胞及血紅蛋白明顯降低（p<0.01）；與模ZH）型組比較，人參組大鼠白細(xì)胞、紅細(xì)胞及血紅蛋白均顯著升高（p<0.05，p<0.01），藜蘆組及參藜組大鼠無(wú)明顯變化，表明人參可明顯的調(diào)節(jié)脾氣虛模型大鼠血液中白細(xì)胞、紅細(xì)胞及血紅蛋白含量，但與藜蘆配伍合用后其調(diào)節(jié)作用明顯減弱。

3.3人參、藜蘆及人參藜蘆配伍合用對(duì)脾氣虛模型大鼠影響的尿液代謝組學(xué)研究

3.3.1尿液代謝輪廓分析采用UPLC/QTOFMS分別在正、負(fù)離子模式下對(duì)樣本進(jìn)行分離和數(shù)據(jù)采集。圖1為各組典型的總離子流基峰強(qiáng)度色譜圖（BPI）。

應(yīng)用主成分分析法（PCA）對(duì)QC樣本進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，從圖2可見，正離子和負(fù)離子模式下QC樣本與正常尿液樣本能夠明顯分離，且QC樣本之間聚集緊密，進(jìn)一步驗(yàn)證了分析系統(tǒng)的穩(wěn)定性。

由空白組、模型組、人參組、藜蘆組和參藜組的PCA得分圖（圖3）可見，在正譜或負(fù)譜中，空白組、模型組和人參組大鼠尿液代謝物可明顯區(qū)分，說(shuō)明與正常大鼠比較，脾氣虛模型大鼠體內(nèi)代謝產(chǎn)生了擾動(dòng)，而人參能夠在一定程度上調(diào)節(jié)這一擾動(dòng)趨于正常。而藜蘆組和參藜組代謝物與模型組區(qū)分不明顯，說(shuō)明其對(duì)脾氣虛模型大鼠體內(nèi)的代謝擾動(dòng)沒(méi)有調(diào)節(jié)作用或調(diào)節(jié)較小。在PCA及OPLSDA模型中，R2X和R2Y表示模型對(duì)于數(shù)據(jù)中自變量X和因變量Y的模擬程度，Q2表示模型對(duì)數(shù)據(jù)的預(yù)測(cè)程度，這兩個(gè)值越接近1表示模型越好。其中正離子模式下模型的R2X=0.902，Q2=0.816，負(fù)離子模式下模型的R2X=0.897，Q2=0.803。

3.3.2潛在標(biāo)志物鑒定對(duì)人參組和模型組尿樣進(jìn)行正交偏最小二乘法判別分析（OPLSDA）。正離子模式下模型的R2Y=0.913，Q2=0.882，負(fù)離子模式下模型的R2Y=0.924，Q2=0.905，說(shuō)明模式質(zhì)量良好。如OPLSDA得分圖（圖4A1，4B1）所示，人參組和模型模型組可以明顯區(qū)分。其中遠(yuǎn)離原點(diǎn)的化合物為潛在的標(biāo)志物（如圖4A2，4B2），同時(shí)以p>1且有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的變量（p<0.05）作為標(biāo)記物的判斷標(biāo)準(zhǔn)，并通過(guò)數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行質(zhì)譜信息匹配及標(biāo)準(zhǔn)品串聯(lián)質(zhì)譜驗(yàn)證的方法找出15種人參干預(yù)脾氣虛大鼠的潛在生物標(biāo)志物。同時(shí)按照上述方法對(duì)參藜組尿樣進(jìn)行了進(jìn)行正交偏最小二乘法判別分析（OPLSDA），找出了7種人參藜蘆配伍合用后對(duì)人參上述調(diào)節(jié)作用產(chǎn)生影響的潛在生物標(biāo)志物（表3），并對(duì)其相對(duì)含量進(jìn)行了統(tǒng)計(jì)分析（圖5）。結(jié)果表明，人參對(duì)于二氫硫辛酸、3氧肉豆蔻酸、15脫氧Δ12，14前列腺素J2、5羥基N甲酰犬尿氨酸、L谷氨酸、L乳酸、吲哚乙酸等潛在生物標(biāo)志物具有顯著的調(diào)節(jié)作用，而與藜蘆配伍合用后對(duì)上述潛在生物標(biāo)志物的調(diào)節(jié)作用明顯減弱，提示人參藜蘆配伍合用后可能在一定程度上降低了人參對(duì)脾氣虛模型大鼠的干預(yù)作用。

3.4生物標(biāo)志物代謝通路分析

5羥基N甲酰犬尿氨酸（5HydroxyNformylkynurenine）、吲哚乙酸（Indoleaceticacid）是色氨酸代謝LM

通路下游代謝產(chǎn)物[15＼]。其中色氨酸是一種必需氨基酸，在機(jī)體中起著至關(guān)重要的作用，在能量代謝中是蛋白質(zhì)合成或分解的中間體[16，17＼]。

通過(guò)犬尿氨酸途徑的色氨酸代謝被認(rèn)為是免疫系統(tǒng)中不斷調(diào)節(jié)病原體和抗原之間平衡的機(jī)制之一[18＼]。人參給藥后尿液中5羥基N甲酰犬尿氨酸及吲哚乙酸含量增加，對(duì)脾氣虛模型大鼠體內(nèi)色氨酸代謝具有促進(jìn)作用，間接表明人參對(duì)能量代謝具有一定促進(jìn)作用，此外，Li等[19＼]在對(duì)人參總皂苷抗應(yīng)激作用的代謝組學(xué)研究中也發(fā)現(xiàn)人參對(duì)5hydroxyNformylkynurenine含量具有調(diào)節(jié)作用，與本研究結(jié)果相似。而當(dāng)人參與藜蘆配伍合用后，尿液中這兩種物質(zhì)含量有所降低，從而影響了人參的上述促進(jìn)作用。

3氧肉豆蔻酸（3Oxotetradecanoicacid）、L乳酸（LLacticacid）分別是脂肪酸生物合成及丙酮酸代謝的合成代謝產(chǎn)物[20＼]。脂肪酸在人體中發(fā)揮著重要的生理作用，它通過(guò)β氧化直接生成乙酰輔酶A，而糖在體內(nèi)通過(guò)糖代謝可生成丙酮酸，也可進(jìn)一步生成乙酰輔酶A，乙酰輔酶A進(jìn)入到三羧酸循環(huán)，產(chǎn)生能量，三羧酸循環(huán)是能量代謝的重要途徑之一[21～23＼]。人參給藥后尿液中3氧肉豆蔻酸及L乳酸含量增加，加速了脾氣虛模型大鼠體內(nèi)三羧酸循環(huán)，促進(jìn)了能量代謝，而與藜蘆配伍合用后明顯抑制了這一促進(jìn)作用。

L谷氨酸（LGlutamicacid）是谷胱甘肽的代謝產(chǎn)物，是機(jī)體內(nèi)十分重要的抗氧化劑和自由基清除劑[24＼]。人參能夠增加脾氣虛模型大鼠尿液中L谷氨酸的含量，加速谷胱甘肽代謝，進(jìn)而起到增強(qiáng)抗氧化作用，而與藜蘆配伍合用后尿液中L谷氨酸的含量，降低了人參的上述作用。

15DeoxyΔ12，14PGJ2是花生四烯酸的代謝產(chǎn)物，花生四烯酸在體內(nèi)能夠起到第二信使的作用，能使腺苷酸環(huán)化酶活化致使細(xì)胞內(nèi)cAMP濃度增高。此外，還參與了體內(nèi)造血和免疫調(diào)節(jié)作用[25，26＼]。脾氣虛大鼠經(jīng)人參治療后，15DeoxyΔ12，14PGJ2的含量降低，在一定程度上抑制了花生四烯酸的代謝，表明人參促進(jìn)了脾氣虛模型大鼠的免疫調(diào)節(jié)作用，而與藜蘆配伍合用后降低了人參對(duì)免疫系統(tǒng)的調(diào)節(jié)作用。

4結(jié)論

本研究采用UPLCQTOFMS聯(lián)用技術(shù)，對(duì)人參、藜蘆及人參藜蘆配伍合用后對(duì)脾氣虛模型大鼠尿液進(jìn)行了非靶向代謝組學(xué)研究。共鑒定出15種人參干預(yù)脾氣虛大鼠的潛在生物標(biāo)志物，同時(shí)在其中找出了7種人參藜蘆配伍合用后對(duì)人參上述調(diào)節(jié)作用產(chǎn)生影響的潛在生物標(biāo)志物，主要參與體內(nèi)脂肪酸生物合成、花生四烯酸代謝、色氨酸代謝、谷胱甘肽代謝、丙酮酸代謝等代謝通路。表明人參藜蘆配伍合用后通過(guò)影響上述代謝途徑而妨害了人參對(duì)脾氣虛模型大鼠增強(qiáng)能量代謝、調(diào)節(jié)免疫、抗氧化等治療作用的發(fā)揮，初步闡明了人參藜蘆配伍禁忌的作用機(jī)理。

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AbstractAurinaryuntargetedmetabonomicsmethodbasedonUPLC/QTOFMSwasestablishedtoinvestigatethemechanismofcompatibilityofPanaxginsengandVeratrumnigruminSpleenqideficiencyrat.Spleenqideficiencyratmodelwasestablished，thentheexhaustiveswimmingtimeandthecontentofwhitebloodcells，redbloodcellandhemoglobininthebloodwasdetectedafteradministrationfor15days.TheresultsshowedthatPanaxginsengcouldincreasetheexhaustionswimmingtime（p<0.01）andthecontentofwhitebloodcells，redbloodcellandhemoglobinintheblood（p<0.05，p<0.01）ofspleenqideficiencyrats，andVeratrumnigrumorcompatibleapplicationhadnosignificanteffectindexmentionedabove（p>0.05）.TheurinarymetabolicprofilingwasanalyzedbyusingUPLC/QTOFMSandtheobtaineddatawereanalyzedbyPCA.ThescoreofPCAshowedthattherewassignificantdifferenceamongthemetabolicprofileofdifferentgroups.AccordingtotheresultsofOPLSDAandthedatabases，fifteenpotentialbiomarkerswereidentifiedasthetherapeuticeffectofPanaxginseng，andsevenofthemandtheirpathwayswereconsideredasreducingthetherapeuticeffectofPanaxginsengbycoadministrationwithVeratrumnigrum.TheresultsindicatedthattheeffectofPanaxginsengonpromotingenergymetabolism，regulatingimmuneandantioxidationinthespleenqideficiencyratsweredecreasedafterthecompatibilityofPanaxginsengandVeratrumnigrum.

KeywordsPanaxginseng；Veratrumnigrum；Incompatibility；Spleenqideficiency；Untargetedmetabonomics

HQWT6JY（Received24March2016；accepted12August2016）

ThisworkwassupportedbytheNationalBasicResearchProgramofChina（973Program）（Nos.2011CB505300，2011CB505305）