基于激光剝蝕—電感耦合等離子體質(zhì)譜技術(shù)的生物元素成像分析

張欣穎??鄭令娜 王海龍 史俊穩(wěn) 豐偉悅 李亮 王萌

摘要 生物體內(nèi)的微量元素具有十分重要的生物功能，也與許多疾病密切相關(guān)?，F(xiàn)代生物醫(yī)學(xué)的研究亟需能在組織、細胞等不同水平上原位分析生物樣品中微量元素的分析方法。本研究建立了激光剝蝕電感耦合等離子體質(zhì)譜（LAICPMS）原位分析生物樣品的方法。采用線掃描模式和較小的激光輸出能量（<1J/cm2），得到了鼠腦切片和金納米顆粒暴露后單細胞的金屬元素成像圖。LAICPMS具有空間分辨率高、檢出限好、運行成本較低等優(yōu)勢，有望在生物醫(yī)學(xué)研究中得到更廣泛的應(yīng)用，發(fā)揮更重要的作用。

關(guān)鍵詞電感耦合等離子體質(zhì)譜；激光剝蝕；元素成像；單細胞分析；鼠腦切片；金納米顆粒

1引言

生物體內(nèi)的微量元素具有十分重要的生物功能，參與多種生物化學(xué)過程[1＼]，如金屬離子常作為蛋白質(zhì)的活性中心，催化和調(diào)節(jié)生物體內(nèi)的化學(xué)反應(yīng)[2＼]。微量元素還與一些疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[3＼]。研究發(fā)現(xiàn)，阿爾茨海默?。ˋlzheimer′sdisease，AD）患者大腦的沉積斑中有高濃度的銅、鋅、鐵離子[4＼]；金屬離子在腦組織微區(qū)內(nèi)的代謝紊亂、氧化應(yīng)激與AD的形成和損傷關(guān)系密切[5＼]。因此，生物樣品中微量元素的分析和檢測，特別是元素的原位微區(qū)分析，無論對于研究微量元素在生物體內(nèi)的結(jié)構(gòu)、功能和生物效應(yīng)，還是對于闡明與微量元素相關(guān)疾病的發(fā)病機理，尋找這些疾病的預(yù)防和治療策略，都具有重要的意義。

生物體內(nèi)微量元素的分析主要使用原子吸收、原子發(fā)射、原子熒光、無機質(zhì)譜等原子光譜/質(zhì)譜儀器完成。常規(guī)方法大都需要使用強酸消化樣品，前處理過程冗長而繁瑣，一般只能得到元素總量的信息，而無法得到元素在生物樣品中的分布信息。如果采用具有空間分辨能力的原位分析方法，如二次離子質(zhì)譜[6＼]、激光電離飛行時間質(zhì)譜[7＼]、同步輻射X射線熒光[8＼]、激光燒蝕電感耦合等離子體質(zhì)譜（Laserablationinductivelycoupledplasmamassspectrometry，LAICPMS）[9＼]等方法，可以實現(xiàn)生物樣品中元素的原位、微區(qū)分析，得到元素成像圖。

在上述原位元素分析方法中，LAICPMS由于具有空間分辨率好（約5μm）、分析檢出限低（10

4g/L級）、儀器商品化程度高、運行成本較低等優(yōu)點，逐漸成為應(yīng)用最廣泛的元素成像方法[10，11＼]。楊紅霞等[12＼]利用LAICPMS原位分析了印度芥菜中的7種元素，得到了植物莖中的元素分布圖；馮流星等[13＼]將同位素稀釋法應(yīng)用于LAICPMS的定量分析，建立了生物切片中Fe元素的原位定量分析方法。本實驗詳細描述LAICPMS元素成像的步驟和方法，并將建立的方法應(yīng)用于鼠腦切片和單個細胞的元素成像分析。

2實驗部分

2.1儀器與試劑

NWR213Nd：YAG激光剝蝕系統(tǒng)（美國NewWave公司）；四極桿電感耦合等離子體質(zhì)譜儀（NexION300DICPMS，美國PerkinElmer公司）；冷凍切片機（德國LEICA1900）；NuncLabTekII腔室載玻片（美國賽默飛世爾科技有限公司）

本實驗所用小鼠（C57BL/6J）購自中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院實驗動物研究所；高純Ar氣和He氣購自北京普萊克斯公司；LAICPMS調(diào)諧用標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)（SRM612），30nm金納米顆粒（RM8012）購自美國國家標(biāo)準(zhǔn)與技術(shù)研究院（NIST）；細胞培養(yǎng)基、小牛血清、PBS、胰酶、青霉素、鏈霉素均購自美國賽默飛世爾科技有限公司。

2.2樣品前處理

3月齡正常小鼠麻醉后，用生理鹽水快速灌注15min，再斷頭取腦組織。將腦組織快速冷凍，制成30μm厚的冠狀切片，置于干燥器中備用。

小鼠巨噬細胞（RAW264.7）用含有10%小牛血清（FBS）、100μg/mL鏈霉素、100units/mL青霉素的DMEM/F12培養(yǎng)基在培養(yǎng)箱中（37℃，5%CO2）培養(yǎng)。NIST金納米顆粒超聲處理后，用純水稀釋至合適的濃度，加入細胞培養(yǎng)液。細胞暴露于0.1mmol/L金納米顆粒4h后，JP吸出細胞培養(yǎng)液，用PBS反復(fù)清洗后，將細胞轉(zhuǎn)移至腔室載玻片，待細胞貼壁后，除去腔室間的隔斷，將載玻片置于干燥器中備用。

2.3LAICPMS實驗

激光剝蝕產(chǎn)生的氣溶膠由He氣載帶出樣品ZH（池，通過三通與Ar氣混合后進入ICPMS分析。ICPMS用NIST612調(diào)諧，使U、Th信號最強且得到較低的氧化物產(chǎn)率（UO+/U+）。LAICPMS所用的儀器參數(shù)見表1。

LA采用線剝蝕模式，激光剝蝕時自動觸發(fā)ICPMS以時間分辨模式采集質(zhì)譜數(shù)據(jù)。所得數(shù)據(jù)用MicrosoftExcel處理，用IgorPro.（美國WaveMetrics公司）軟件畫出元素成像圖。

3結(jié)果與討論

激光燒蝕系統(tǒng)可以作為ICPMS的固體進樣裝置，工作時激光束先剝蝕樣品表面，產(chǎn)生的固體氣溶膠被載氣運送至等離子體而完成電離，然后在質(zhì)譜中得到檢測。LAICPMS的準(zhǔn)確分析需要盡可能地滿足下面3個條件：（1）激光剝蝕產(chǎn)生的氣溶膠與固體樣品的組成相同；（2）氣溶膠可以高效率地傳輸至質(zhì)譜；（3）進入質(zhì)譜的氣溶膠可以完全電離[14＼]。在實際分析過程中，上CM（203/5述條件常常很難完全滿足，這樣會導(dǎo)致“元素分CM）ZH）餾”（不同元素在LAICPMS分析過程中的行為差異）的產(chǎn)生。為了校正激光能量、樣品厚度、漂移對質(zhì)譜響應(yīng)的影響，LAICPMS元素成像分析時，需要選用適合內(nèi)標(biāo)元素。還要使用基體匹配的標(biāo)準(zhǔn)，以獲取準(zhǔn)確的定量分析結(jié)果。研究表明，相比過去常用波長的激光器（如266nm），使用213nm波長的NdKG-3∶KG-5YAG激光剝蝕得到的樣品更為均勻，元素分餾效應(yīng)更小[15＼]。使用氦氣作為載氣，可以有效地提高氣溶膠的傳輸效率，從而提高分析的靈敏度[16＼]。因此，在本實驗中，使用波長為213nm的激光，采用He氣作為載氣，并采用13C的信號作為內(nèi)標(biāo)校正元素。

3.1剝蝕模式的選擇

元素成像可采用點剝蝕模式（Spotablation）或線剝蝕模式（Lineablation）完成（圖1）。在點剝蝕模式中，激光在樣品表面每隔一定距離取一點剝蝕樣品，重復(fù)操作直到激光采樣的點陣覆蓋整個樣品。在此模式下，采集的數(shù)據(jù)真實反映每個采樣點上的元素信息，激光光斑越小，采樣點越多，得到的元素成像圖的分辨率越高。而在線剝蝕模式中，在樣品表面每隔一定距離設(shè)置一條剝蝕線段，重復(fù)設(shè)置剝蝕線段，直到激光采樣的線段覆蓋整個樣品。工作時激光沿直線連續(xù)剝蝕樣品，此時，元素成像圖的分辨率取決于激光光斑、剝蝕頻率、線掃描速率，以及剝蝕線間的距離等條件。

LAICPMS分析時，如果采用點剝蝕模式，在兩個剝蝕點之間需要耗費較多的時間等待質(zhì)譜信號回到本底水平，才能進行下一點的分析。這樣減少了有效質(zhì)譜分析時間的比例，增加了元素成像分析所需要的時間。所以在本實驗中，采用線剝蝕模式，并使用兩種剝蝕參數(shù)分別應(yīng)用于鼠腦切片和細胞樣品（見表1）。需要注意的是，由于剝蝕參數(shù)的選擇，最終得到的元素成像圖在激光掃描的方向常會拉長變形，一般需要在最后處理過程中恢復(fù)原始比例。

3.2激光能量的選擇

與地質(zhì)樣品不同，生物樣品的含水量較高，因此在剝蝕時，必須有效地控制剝蝕條件，既要實現(xiàn)完全剝蝕樣品，又要避免用過高的能量剝蝕而使樣品中的水大量汽化，造成樣品不規(guī)則撕裂和嚴(yán)重的元素分餾。此外，在分析生物樣品時，選擇較低能量密度（<1J/cm2），有利于得到穩(wěn)定的激光脈沖。有文獻報道，使用低溫樣品池可以有效減少由于樣品中水分汽化而造成的負(fù)面影響[17＼]。但是由于低溫樣品池結(jié)構(gòu)復(fù)雜，價格昂貴，從而限制了其實際應(yīng)用。我們發(fā)現(xiàn)，通過選擇合適的激光能量，也可以實現(xiàn)對生物樣品的有效剝蝕，而不必采用低溫樣品池。圖2顯示了不同能量的激光剝蝕鼠腦切片的結(jié)果，可以清楚地看出，對于本實驗中的鼠腦切片樣品來說，選用40%的激光輸出能量，即可得到較好的剝蝕效果。如果輸出能量大于40%，會導(dǎo)致激光穿透樣品而剝蝕載玻片，從而引入了來自載玻片的元素干擾，還會造成切片樣品的不規(guī)則剝蝕。對于實驗中的細胞樣品，經(jīng)過對比，選用80%的輸出能量可以達到良好的剝蝕效果。

3.3鼠腦和細胞的元素成像圖

元素C作為生物樣品的內(nèi)標(biāo)校正元素，F(xiàn)e，Cu，Zn是生物體中重要的必需微量元素，具有多種生物功能。所以，本研究選擇分析以上元素。LAICPMS分析得到的鼠腦元素成像見圖3。從圖3可以清楚地分辨小鼠腦的不同區(qū)域，并可以看出Fe，Cu，Zn等重要微量元素在各個腦區(qū)中的分布情況。由于Fe元素在ICPMS中受到ArO+等多原子離子的嚴(yán)重干擾，所以得到的Fe元素成像圖不如其它元素成像圖清晰。JP文獻＼[18＼]報道，采用碰撞反應(yīng)池技術(shù)可以消除測量時的質(zhì)譜干擾，得到更加清晰的Fe元素成像圖。由于缺乏可用于LAICPMS定量分析的生物標(biāo)準(zhǔn)參考物，定量元素成像分析相對困難。國外實驗室常自制基體匹配的生物切片標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，采用外標(biāo)校正的辦法，實現(xiàn)生物樣品的定量元素成像[10＼]。

如果LAICPMS技術(shù)與免疫組織化學(xué)方法相結(jié)合，使用元素標(biāo)記的抗體與切片上的待測抗原反應(yīng)，通過分析標(biāo)記的元素，可以得到切片上蛋白質(zhì)（抗原）的分布信息，進一步拓展LAICPMS在生物成像分析的應(yīng)用范圍。Seuma等[19＼]成功得到了兩種癌癥生物標(biāo)志物在組織上的成像。利用類似的方法，Wang等[20＼]同時得到了Fe，Cu，Zn等金屬元素和β淀粉樣蛋白在老年癡呆模型鼠腦切片中的元素和分子成像圖。

圖4是暴露金納米顆粒后的單細胞光學(xué)成像和元素成像圖。在本實驗條件下，除了Mg元素外，不能得到其它天然微量元素的清晰成像。這主要是由于細胞中的這些元素含量較低，或者是由于分析這些元素時存在較為嚴(yán)重干擾。從圖4可見，Mg和Au元素濃度較高的位置與光學(xué)顯微鏡中細胞所在位置重合，而在沒有細胞的位置，Mg和Au元素濃度很低。因此可以確定，Mg和Au的元素信號分別來自于細胞本身和進入細胞的金納米顆粒。

為了準(zhǔn)確得到單個細胞中的元素含量，需要發(fā)展合適的定量標(biāo)準(zhǔn)和校正方法。Wang等使用微噴系統(tǒng)制備了與細胞大小和含碳量相似的標(biāo)準(zhǔn)液滴，作為基體匹配的單細胞定量標(biāo)準(zhǔn)，成功實現(xiàn)LAICPMS定量分析單細胞中的金屬納米顆粒[21＼]。此外，現(xiàn)有的激光器最小光斑約為5μm，如果希望用LAICPMS技術(shù)得到單個細胞中的元素成像圖，則需要進一步提高空間分辨率。Becker等提出的近場剝蝕技術(shù)，將LAICPMS空間分辨率提高到亞微米級，有望真正實現(xiàn)單個細胞成像分析[22＼]。

4結(jié)論

本研究建立了LAICPMS元素成像方法，得到了鼠腦切片、單細胞等不同水平生物樣品的元素成像圖。LAICPMS由于具有空間分辨率高、檢出限低、運行成本較低等優(yōu)勢，有望作為其它生物成像技術(shù)的有力補充，在生物醫(yī)學(xué)研究中得到更廣泛的應(yīng)用，發(fā)揮更重要的作用。

References

1（#LiYF，ChenCY，QuY，GaoYX，LiB，ZhaoYL，ChaiZF.PureAppl.Chem.，2008，80（12）：2577-2594

2FinneyLA，O′HalloranTV.Science，2003，300（5621）：931-936

3BushAI.TrendsNeurosci.，2003，26（4）：207-214

4MillerLM，WangQ，TelivalaTP，SmithRJ，LanzirottiA，MiklossyJ.J.Struct.Biol.，2006，155（1）：30-37

5ZHAOBaoLu，WANLi.Prog.Biochem.Biophy.，2012，39（8）：756-763

趙寶路，萬莉.HTK生物化學(xué)與生物物理進展，2012，39（8）：756-763

6FletcherJS，RabbaniS，HendersonA，BlenkinsoppP，ThompsonSP，LockyerNP，VickermanJC.Anal.Chem.，2008，80（23）：9058-9064

7GaoY，LinYM，ZhangBC，ZouDX，HeMH，DongB，HangW，HuangBL.Anal.Chem.，2013，85（9）：4268-4272

8WangHJ，WangM，WangB，MengXY，WangY，LiM，F(xiàn)engWY，ZhaoYL，ChaiZF.J.Anal.At.Spectrom.，2010，25（3）：328-333

9BeckerJS，ZoriyM，MatuschA，WuB，SalberD，PalmC，BeckerJS.MassSpectrom.Rev.，2010，29（1）：156-175

10HareD，AustinC，DobleP.Analyst，2012，137（7）：1527-1537

11KonzI，F(xiàn)ernandezB，F(xiàn)ernandezML，PereiroR，SanzMedelA.Anal.Bioanal.Chem.，2012，403（8）：2113-2125

12YANGHongXia，ZHAOLingHao，GAOJinXu，LIUWei，LIBing.ChineseJ.Anal.Chem.，2014，42（3）：355-359

楊紅霞，趙令浩，高津旭，劉葳，李冰.HTK分析化學(xué)，2014，42（3）：355-359

13FENGLiuXing，WANGJun.ChineseJ.Anal.Chem.，2014，42（4）：536-541

馮流星，王軍.HTK分析化學(xué)，2014，42（4）：536-541

14KochJ，GuntherD.Appl.Spectrosc.，2011，65（5）：155-162

15GuillongM，HornI，GuntherD.J.Anal.At.Spectrom.，2003，18（10）：1224-1230

16GuntherD，HeinrichCA.J.Anal.At.Spectrom.，1999，14（9）：1363-1368

17FeldmannJ，KindnessA，EkP.J.Anal.At.Spectrom.，2002，17（8）：813-818

18LearJ，HareDJ，F(xiàn)ryerF，AdlardPA，F(xiàn)inkelsteinDI，DoblePA.Anal.Chem.，2012，84（15）：6707-6714

19SeumaJ，BunchJ，CoxA，McLeodC，BellJ，MurrayC.Proteomics，2008，8（18）：3775-3784

20WangHJ，WangM，WangB，LiM，ChenHQ，YuXH，YangK，ChaiZF，ZhaoYL，F(xiàn)engWY.Metallomics，2012，4（10）：1113-1118

21WangM，ZhengLN，WangB，ChenHQ，ZhaoYL，ChaiZF，ReidHJ，SharpBL，F(xiàn)engWY.Anal.Chem.，2014，86（20）：10252-10256

22BeckerJS，GorbunoffA，ZoriyM，IzmerA，KayserM.J.Anal.At.Spectrom.，2006，21（1）：19-25）

AbstractTraceelementsplayaveryimportantroleinbiologicalorganismandcloselyrelatedtomanydiseases.Thenewanalyticalmethodsareurgentlyneededforinsitudeterminationoftraceelementsinbiologicaltissuesorsinglecells.Amethodbasedonlaserablationinductivelycoupledplasmamassspectrometry（LAICPMS）wasdevelopedforsuchinsituanalysis.Lineablationmodewaschosenandtheoutputenergyofthelaserwasalsooptimizedatalowfluenceoflessthan1J/cm2.Thetwokindsofelementalbioimagingofbothacoronalsectionfrommousebrainandsinglecellsexposedtogoldnanoparticleswereobtainedbythedevelopedmethod.Becauseoftheuniquecharacteristics，suchasgoodspatialresolution，excellentdetectionlimit，andreasonablerunningcost，LAICPMSwillbeappliedwidelyandbecomeausefultoolinbiomedicalresearchinthefuture.

KeywordsInductivelycoupledplasmamassspectrometry；Laserablation；Elementalbioimaging；Singlecellanalysis；Mousebrainsections；Goldnanoparticles

HQWT6JY（Received19February2016；accepted11April2016）

ThisworkwassupportedbytheNationalNaturalScienceFoundationofChina（Nos.21775136，U1432241，11505194）.