舒血寧注射液超濾工藝的優(yōu)化研究

姜國(guó)志，丁艷譜，趙玉欣，劉麗芳,3，高會(huì)芹，張?zhí)乩?，孫勝斌,3*

(1.神威藥業(yè)集團(tuán)有限公司，河北 石家莊 051430；2.中藥注射劑新藥技術(shù)開發(fā)國(guó)家地方聯(lián)合工程實(shí)驗(yàn)室，河北 石家莊 051430；3.河北省中藥注射劑工程技術(shù)研究中心，河北 石家莊 051430)

制 劑 工 藝

舒血寧注射液超濾工藝的優(yōu)化研究

姜國(guó)志1,2，丁艷譜1，趙玉欣1，劉麗芳1,3，高會(huì)芹1,2，張?zhí)乩?,2，孫勝斌1,3*

(1.神威藥業(yè)集團(tuán)有限公司，河北 石家莊 051430；2.中藥注射劑新藥技術(shù)開發(fā)國(guó)家地方聯(lián)合工程實(shí)驗(yàn)室，河北 石家莊 051430；3.河北省中藥注射劑工程技術(shù)研究中心，河北 石家莊 051430)

目的：考察舒血寧注射液超濾工藝適應(yīng)性，優(yōu)選超濾過程的工藝參數(shù)。方法：采用正交試驗(yàn)方法，以藥液溫度、密度、超濾膜孔徑和進(jìn)出口壓差作為影響因素，通過對(duì)超濾前后藥液中總黃酮醇苷、銀杏內(nèi)酯A、B、C的含量、總固體檢測(cè)分析。結(jié)果：根據(jù)綜合評(píng)價(jià)得分，藥液溫度、密度和進(jìn)出口壓差3個(gè)因素對(duì)總黃酮醇苷、銀杏內(nèi)酯A、B、C的透過率、總固體的降低率無(wú)顯著影響，而超濾膜孔徑對(duì)其有顯著的影響(P<0.01)。結(jié)論：舒血寧注射液選用10 k超濾膜，生產(chǎn)工藝適用性好。

舒血寧注射液；超濾工藝；總黃酮醇苷；銀杏內(nèi)酯；總固體

超濾技術(shù)是現(xiàn)代膜分離技術(shù)在中藥注射劑去除大分子物質(zhì)應(yīng)用中首選分離方法，其分離原理在于膜具有選擇透過性，是以外界能量或化學(xué)位差為推動(dòng)力，對(duì)雙組分或多組分的溶質(zhì)和溶劑進(jìn)行分離、分級(jí)、提純和富集的過程。根據(jù)制作材料不同，膜可分為有機(jī)膜和無(wú)機(jī)膜，有機(jī)膜是比較常用的高分子材料，包括聚烯烴類、聚乙烯類、聚丙烯腈、聚砜類、芳香族聚酰胺、含氟聚合物等[1]，常用于中藥注射劑的超濾膜有中空纖維聚砜膜(PS 膜)[2-5]和板式或卷式聚醚砜(PES膜)[6-8]材質(zhì)。經(jīng)文獻(xiàn)檢索發(fā)現(xiàn)，針對(duì)舒血寧注射液應(yīng)用超濾技術(shù)還未見報(bào)道，舒血寧注射液是銀杏葉或銀杏葉提取物經(jīng)提取制成的滅菌水溶液，具有擴(kuò)張血管，改善微循環(huán)的功效，其主要藥效成分為黃酮醇苷和萜內(nèi)酯[9]，為了有效去除大分子物質(zhì)，保證舒血寧注射液的用藥安全[10-13]，本文對(duì)舒血寧注射液應(yīng)用板式聚醚砜(PES膜)超濾工藝進(jìn)行優(yōu)化[14]，為超濾技術(shù)在中藥注射液生產(chǎn)過程中的應(yīng)用提供參考價(jià)值。

1 試藥和儀器

1.1 試藥

舒血寧藥液(神威藥業(yè)集團(tuán)有限公司提供)；槲皮素對(duì)照品(批號(hào):100081-200907)；山奈素對(duì)照品(批號(hào)：110861-201209)；異鼠李素對(duì)照品(批號(hào)：110860-201109)；內(nèi)酯C對(duì)照品(批號(hào)：110864-201307)；內(nèi)酯A對(duì)照品(批號(hào)：110862-201310)；內(nèi)酯B對(duì)照品(批號(hào)：110863-201209)，以上對(duì)照品均購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院。其他試劑為分析純。

1.2 儀器

Agilent 1260/ELSD 2000ES高效液相色譜儀(美國(guó)安捷倫)；CPA225D電子天平(Sartorius)；ME203E電子天平(上海梅特勒-托利多)。

2 方法

2.1 舒血寧藥液制備

取舒血寧注射液產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)過程中稀釋前的濃溶液按表1加入適量注射液用水制備適宜濃度的藥液，備用。

2.2 檢測(cè)方法

2.2.1 含量測(cè)定方法

按照舒血寧注射液國(guó)家藥品標(biāo)準(zhǔn)(WS3-B-3707-98-2004-2012)測(cè)定。

2.2.1.1 總黃酮醇苷

照高效液相色譜法(中國(guó)藥典2015年版通則0512)測(cè)定。

色譜條件與系統(tǒng)適應(yīng)性試驗(yàn):以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；以甲醇-0.4%磷酸溶液(50∶50)為流動(dòng)相；檢測(cè)波長(zhǎng)為360 nm。理論板數(shù)按槲皮素峰計(jì)算應(yīng)不低于2500，分離度按山奈素與異鼠李素峰計(jì)算，應(yīng)大于1.5。

對(duì)照品溶液的制備:取槲皮素對(duì)照品、山奈素對(duì)照品、異鼠李素對(duì)照品適量，精密稱定，加甲醇制成每1 mL各分別含30 μg、30 μg、20 μg的混合溶液，作為對(duì)照品溶液。

供試品溶液的制備:精密量取稀釋液10 mL，加甲醇16 mL及18%鹽酸溶液6 mL，置水浴中加熱回流1.5 h，迅速冷卻至室溫，轉(zhuǎn)移至50 mL量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

測(cè)定法:分別精密吸取對(duì)照品溶液和供試品溶液各10 μL，注入液相色譜儀，測(cè)定，分別計(jì)算槲皮素、山奈素和異鼠李素的含量，按下式換算成總黃酮醇苷的含量。

總黃酮醇苷含量=(槲皮素含量+山奈素含量+異鼠李素含量)×2.51

2.2.1.2 銀杏內(nèi)酯

照高效液相色譜法(中國(guó)藥典2015年版通則0512)測(cè)定。

色譜條件與系統(tǒng)適應(yīng)性試驗(yàn):以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；以甲醇-四氫呋喃-水(20∶10∶75)為流動(dòng)相；用蒸發(fā)光散射檢測(cè)器檢測(cè)。理論板數(shù)按銀杏內(nèi)酯A峰計(jì)算應(yīng)不低于5 000。

對(duì)照品溶液的制備:取銀杏內(nèi)酯A對(duì)照品、銀杏內(nèi)酯B對(duì)照品、銀杏內(nèi)酯C對(duì)照品適量，精密稱定，加丙酮制成每1 mL各含1.5 mg、0.25 mg、0.5 mg的混合溶液，作為對(duì)照品溶液。

供試品溶液的制備:精密量取稀釋液15 mL，加稀鹽酸2滴，調(diào)節(jié)pH值至2，用乙酸乙酯振搖提取4次(20 mL、10 mL、10 mL、10 mL)，合并乙酸乙酯液，用5%醋酸鈉溶液20 mL洗滌，分取乙酸乙酯液，醋酸鈉溶液再以乙酸乙酯10 mL洗滌，合并乙酸乙酯液及洗液，用水洗滌2次，每次20 mL，合并乙酸乙酯液，蒸干，殘?jiān)颖芙獠⑥D(zhuǎn)移至2 mL量瓶中，加丙酮稀釋至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

測(cè)定法:分別精密吸取對(duì)照品溶液3 μL、10 μL，供試品溶液5～10 μL，注入液相色譜儀，測(cè)定，用外標(biāo)兩點(diǎn)法對(duì)數(shù)方程分別計(jì)算銀杏內(nèi)酯A、銀杏內(nèi)酯B、銀杏內(nèi)酯C的含量，即得。

2.2.2 總固體測(cè)定方法

精密量取藥液10 mL，置已干燥至恒重的蒸發(fā)皿中，水浴上蒸干，在105℃干燥3 h，移至干燥器中，冷卻30 min，迅速精密稱定重量，即得。

2.3 計(jì)算方法

2.4 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)

根據(jù)實(shí)際生產(chǎn)過程控制及文獻(xiàn)報(bào)道，以舒血寧藥液各含量透過率及總固體降低率為考察指標(biāo)，采用L9(34)正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)(見表1)，對(duì)藥液溫度(A)、藥液濃度(B)、超濾膜孔徑(C)和進(jìn)出口壓差(D)進(jìn)行4因素3水平篩選，采用加權(quán)綜合評(píng)分法計(jì)算綜合得分(S綜合=總黃酮醇苷含量透過率×0.25+[銀杏內(nèi)酯A含量透過率+銀杏內(nèi)酯B含量透過率+銀杏內(nèi)酯C含量透過率]÷3×0.25+總固體降低率×0.5)。

3 結(jié)果

3.1 正交試驗(yàn)結(jié)果

根據(jù)表1正交試驗(yàn)因素水平表，得出試驗(yàn)結(jié)果(見表2、表3)。

表1 正交試驗(yàn)因素水平表

表2 正交試驗(yàn)結(jié)果

表3 轉(zhuǎn)移率方差分析表

注：*P<0.05為顯著，**P<0.01為極其顯著

由表2直觀分析可知，各因素對(duì)總黃酮轉(zhuǎn)移率影響為C>A>D>B、對(duì)內(nèi)酯A轉(zhuǎn)移率影響為C>A>D>B、對(duì)內(nèi)酯B轉(zhuǎn)移率影響為C>D>A >B、對(duì)內(nèi)酯C轉(zhuǎn)移率影響為C>B>D>A、對(duì)總固體降低率影響為C>A>D >B；根據(jù)綜合得分因素影響順序?yàn)镃>A>B>D，整體看，影響最大的因素為C即超濾膜孔徑，其他因素對(duì)各轉(zhuǎn)移率影響雖不盡相同，但R值差別不大，對(duì)于轉(zhuǎn)移率，超濾膜孔徑越大，轉(zhuǎn)移率越高，而總固體降低率越低，說明隨膜孔徑增大，超濾截留效率逐漸下降，因此，在保證有效截留的前提下并結(jié)合生產(chǎn)實(shí)際情況，適當(dāng)降低過濾時(shí)藥液溫度與藥液濃度可有利保護(hù)超濾及節(jié)省過濾時(shí)間，采用綜合得分最優(yōu)組合為A1B3C2D3，當(dāng)C因素取水平2時(shí)，各含量的平均轉(zhuǎn)移率情況為：總黃酮90.67%、內(nèi)酯A87.43%、內(nèi)酯B86.11%、內(nèi)酯C87.46%；總固體下降率為18.42%，此時(shí)總體含量保留率均在85%以上而總固體下降率可達(dá)18.42%，即各含量得到較高保留又有效去除了雜質(zhì)。表3方差分析結(jié)果表明，除因素A藥液溫度對(duì)總黃酮有顯著影響，因素B藥液濃度對(duì)內(nèi)酯C有顯著影響外，因素C超濾膜孔徑對(duì)總黃酮及內(nèi)酯A、B、C轉(zhuǎn)移率和總固體降低率均有極其顯著影響。從綜合得分的方差分析結(jié)果看，僅因素C超濾膜孔徑對(duì)各含量及總固體有極其顯著影響，與直觀分析的結(jié)果一致，只有選擇適當(dāng)?shù)某瑸V膜孔徑，才能使各含量保留率較高且有效去除雜質(zhì)。

4 討論

中藥注射液中大分子物質(zhì)是導(dǎo)致臨床應(yīng)用中出現(xiàn)藥物不良反應(yīng)的主要原因之一[10]，傳統(tǒng)精制工藝去除率不理想，致使中藥注射液的相關(guān)物質(zhì)不達(dá)標(biāo)，而采用超濾技術(shù)可使舒血寧注射液中鞣質(zhì)、樹脂等大分子物質(zhì)去除得非常徹底，總黃酮醇苷及總銀杏內(nèi)酯等有效成分，相對(duì)分子質(zhì)量小，分子結(jié)構(gòu)較為簡(jiǎn)單，透過率高，綜合評(píng)價(jià)結(jié)果為舒血寧注射液在超濾過程中受藥液溫度、濃度、超濾過程中膜進(jìn)出口壓差3個(gè)因素的影響較小，而選擇不同孔徑的超濾膜對(duì)指標(biāo)成分的透過率以及總固體降低率效果影響較大，為進(jìn)一步優(yōu)化舒血寧注射液的超濾工藝提供了客觀的科學(xué)依據(jù)。

本實(shí)驗(yàn)過程中只考察了不同孔徑的板式聚醚砜(PES膜)對(duì)舒血寧有效成分的透過率及超濾過程中總固體去除率的影響，還應(yīng)該對(duì)物質(zhì)基礎(chǔ)采用指紋圖譜進(jìn)行超濾前后的對(duì)比分析及超濾對(duì)內(nèi)毒素的去除率效果，待進(jìn)一步研究。

超濾技術(shù)應(yīng)用于中藥注射液，還沒有具體的研究指導(dǎo)原則，根據(jù)文獻(xiàn)研究報(bào)道，大部分是在研究過程中對(duì)有代表性的成分、總固體、內(nèi)毒素等指標(biāo)進(jìn)行了相應(yīng)的對(duì)比研究，筆者建議還應(yīng)進(jìn)一步對(duì)超濾前后的物質(zhì)基礎(chǔ)做深入研究。

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Optimization of Ultrafiltration Process for Shuxuening Injection

JIANG Guo-zhi1,2, DING Yan-pu1,ZHAO Yu-xin1,LIU Li-fang1,3,GAO Hui-qin1,2,ZHANG Te-li1,2,SUN Sheng-bin1,3

(1.ShinewayPharmaceuticalGroupLtd,Shijiazhuang051430,China; 2.State-LocalJointEngineeringLaboratory

ofNewDrugsDevelopmentTechnologyforTCMInjection,Shijiazhuang051430,China;3.HebeiProvinceEngineeringResearchCenterforTCMInjection,Shijiazhuang051430,China)

Objective:To examine the adaptability of ultrafiltration process in Shuxuening injection and to optimize technical parameters of ultrafiltration process. Methods: The orthogonal test method was adopted to analyze the testing results of total flavonol glycosides, ginkgolide A, B, C contents and total solids both pre- ultrafiltration and post-ultrafiltration by taking temperature, density, pore diameter and differential pressure between inlet and outlet as the influence factors. Results: According to the overall evaluation score, all three factors (temperature, density and differential pressure) between inlet and outlet had no significant influence on the transmission rate of total flavonoid glycosides, the transmission rate of ginkgolide A, B, C and the removal rate of total solids. However, the pore diameter of ultrafiltration membrane had a significant influence (P<0.01). Conclusion: By applying 10 k pore diameter of ultrafiltration membrane, the production process of Shuxuening injection is applicable.

Shuxuening injection; Ultrafiltration process; Total flavonol glycosides; Ginkgo biloba;Total solids

2016-04-12

2016-5-22

國(guó)家重大新藥創(chuàng)制專項(xiàng)(2014ZX09201022-004)

姜國(guó)志(1981-)，男，高級(jí)工程師，主要從事藥品質(zhì)量及產(chǎn)業(yè)化研究。

*通訊作者：孫勝斌(1982-)，男，工程師，主要從事藥品工藝技術(shù)、質(zhì)量研究及產(chǎn)業(yè)化研究。

R283

A

1002-2392(2017)02-0089-05