補陽還五湯對Aβ誘導(dǎo)大鼠微血管內(nèi)皮細胞凋亡保護作用

劉斌，劉國良，張寧，張紅，張濤*，董曉紅，周忠光

(1.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)，黑龍江 哈爾濱 150040；2.佳木斯大學(xué)，黑龍江 佳木斯 154007)

補陽還五湯對Aβ誘導(dǎo)大鼠微血管內(nèi)皮細胞凋亡保護作用

劉斌1，劉國良1，張寧1，張紅2，張濤2*，董曉紅1，周忠光1

(1.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)，黑龍江 哈爾濱 150040；2.佳木斯大學(xué)，黑龍江 佳木斯 154007)

目的：研究補陽還五湯對Aβ誘導(dǎo)的大鼠微血管內(nèi)皮細胞(PMVEC)凋亡的影響。方法：建立Aβ?lián)p傷大鼠微血管內(nèi)皮細胞模型，不同濃度(0.1、1、10 μg/ml)補陽還五湯干預(yù)，MTT法檢測大鼠微血管內(nèi)皮細胞活力；western-blot法檢測大鼠微血管內(nèi)皮細胞中凋亡蛋白bax和caspase9表達水平。結(jié)果：補陽還五湯在濃度(0.1、1、10 μg/ml)能夠抑制Aβ誘導(dǎo)的大鼠微血管內(nèi)皮細胞bax和caspase9蛋白的表達并呈濃度依賴性。結(jié)論：補陽還五湯能夠通過抑制凋亡蛋白bax和caspase9的表達而具有保護大鼠微血管內(nèi)皮細胞的作用，可能成為是一種有效的抗腦血管系統(tǒng)疾病治療劑。

補陽還五湯；bax；caspase9；大鼠微血管內(nèi)皮細胞

阿爾茨海默病(Alzheimer’s disease，AD)，又稱老年癡呆，是一種以記憶逐步減退和進行性認知障礙為臨床特征的中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病。AD的主要病理特征為神經(jīng)元丟失、老年斑(senile plaque，SP)、神經(jīng)纖維纏結(jié)(neurofibrillary tangles，NFT)和細胞外β淀粉樣蛋白(Aβ)沉積[1-4]。近十多年來的研究表明,微血管內(nèi)皮細胞(vascularendothelial cell,VEC)是一種具有廣泛生物活性的細胞,它通過合成、分泌多種生物活性物質(zhì)調(diào)節(jié)血管的通透性。微血管內(nèi)皮細胞能夠限制可溶性物質(zhì)從血液進入大腦，是血腦屏障的主要組成部分，當VEC功能受損時,其功能失調(diào),通透性改變,從而引起相關(guān)疾病的發(fā)生[5]。

中醫(yī)認為AD屬于“絡(luò)病”范疇，補陽還五湯出自清代王清任的《醫(yī)林改錯》，由黃芪、當歸、赤芍、桃仁、川芎、紅花、地龍組成，諸藥合用，共奏補氣活血、通經(jīng)活絡(luò)之功效?，F(xiàn)代藥理研究表明，補陽還五湯具有改善腦血循環(huán)和微循環(huán)[6]，促進血管新生[7]、抗細胞凋亡[8-9]，對抗興奮性氨基酸[10-11]等藥理作用。補陽還五湯以往多用于治療缺血性腦血管疾病[12-13],但其與微血管內(nèi)皮細胞的作用關(guān)系如何，補陽還五湯是否可以通過抑制血管內(nèi)皮細胞凋亡來達到抗老年癡呆的效果目前尚不清楚，特別是與凋亡因子bax和caspase9關(guān)系如何尚未見報道。本試驗以補陽還五湯作用于大鼠微血管內(nèi)皮細胞為研究對象，考察補陽還五湯對凋亡因子bax和caspase9表達的影響，探討Caspase-9和Bax在AD發(fā)生中的作用。

1 材料與方法

1.1 補陽還五湯(BYHWD)粉劑制備

BYHWD由黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)實驗中心田明教授制備成干粉，4℃冰箱中保存。

1.2 大鼠腦血管內(nèi)皮細胞的培養(yǎng)

大鼠腦血管內(nèi)皮細胞(BMVEC)常規(guī)培養(yǎng)于含10%胎牛血清、雙抗各1×105U/L的DMEM培養(yǎng)液中，置細胞培養(yǎng)室內(nèi)，于37℃恒溫、5% CO2、100%飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.3 Aβ25-35誘導(dǎo)腦微血管內(nèi)皮細胞損傷構(gòu)建

將凍干粉5 mgAβ25-35溶解于33.3 mL滅菌水配制成150 μmol/L的儲備液，過濾后37 ℃恒溫孵育7天，-20 ℃保存。將Aβ25-35分成6個濃度組：0 μmol/L、5 μmol/L、10 μmol/L、20 μmol/L、40 μmol/L、80 μmol/L。取細胞制成細胞懸液，將細胞濃度調(diào)整為5×103～1×104個/mL，接種于96孔板，100 μL每孔，8孔每組，細胞接種24 h后基本貼壁用移液槍吸盡個空中的完全培養(yǎng)液，按照分組每孔分別加入180 μL事先配制的不同濃度的Aβ25-35溶液，一次接種3塊96孔板，分別在換液后24 h，48 h，72 h進行OD值的檢測。

1.4 MTT法細胞活力分析

選取無菌96孔板，96孔培養(yǎng)板內(nèi)加入5×103～1×104個/mL單細胞懸液，每孔加入180 μL培養(yǎng)液，CO2孵箱中培養(yǎng)24 h并且加入倍比稀釋成3種濃度的BYHWD(0.1 mg/L,1 mg/mL,10 mg/mL)各180 μL，孵箱中培養(yǎng)68 h后吸去上清液，每孔中加入MTT 20 μL，繼續(xù)培養(yǎng)4 h后加入二甲基亞砜(DMSO)150 μL，自動酶標儀測量各孔的吸光度值(A值)。

1.5 bax和caspase9蛋白含量測定

補陽還五湯(0.1、1、10 μg/ml) 加入Aβ誘導(dǎo)的大鼠微血管內(nèi)皮細胞培養(yǎng)68 h后，收集細胞，用 Western blot 測定細胞中bax和caspase9蛋白的表達量。

1.6 統(tǒng)計分析

所有的實驗結(jié)果用三次實驗平均值±SD計算。統(tǒng)計結(jié)果分析使用方差分析，P<0.05差異認為具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Aβ劑量確定

如表1所示，小于1 nmol/L的Aβ基本不影響大鼠微血管內(nèi)皮細胞的活力，大于10 nmol/L的Aβ明顯抑制細胞活性。說明自10 nmol開始對大鼠微血管內(nèi)皮細胞造成損傷，并且隨著劑量的增大細胞活力降低，所以我們選擇10 nmol/L Aβ為造模濃度。

表1 相對細胞抑制率百分比結(jié)果±s)

注：與空白組比較，*P<0.05，**P<0.01

2.2 補陽還五湯對Aβ誘導(dǎo)PMVEC細胞bax蛋白表達的影響

由圖1，2可知，Aβ誘導(dǎo)顯著上調(diào)bax蛋白表達，補陽還五湯高中低劑量(10 mg/L,1 mg/mL,0.1 mg/mL)預(yù)處理，三個濃度對bax表達均有顯著逆轉(zhuǎn)作用，均有顯著性差異(P<0.01)。

圖1 補陽還五湯對Aβ誘導(dǎo)PMVEC細胞bax蛋白表達的影響

圖2 補陽還五湯對Aβ誘導(dǎo)PMVEC細胞bax蛋白表達的影響注：與空白組相比，#P<0.01;與UVB模型組相比，*P<0.05，**P<0.01

2.3 補陽還五湯對Aβ誘導(dǎo)PMVEC細胞casepase9蛋白表達的影響

由圖3，4可知，Aβ誘導(dǎo)顯著上調(diào)casepase9蛋白表達，濃度補陽還五湯高中低劑量(10 mg/L,1 mg/mL,0.1 mg/mL)預(yù)處理，三個濃度對casepase9表達均有顯著逆轉(zhuǎn)作用，均有顯著性差異(P<0.01)。

圖3 補陽還五湯對Aβ誘導(dǎo)PMVEC細胞casepase9蛋白表達的影響

圖4 補陽還五湯對Aβ誘導(dǎo)PMVEC細胞casepase9蛋白表達的影響注：與空白組相比，#P<0.01;與UVB模型組相比，*P<0.05，**P<0.01

3 討論

Aβ是中樞神經(jīng)系統(tǒng)中一種重要的興奮性神經(jīng)遞質(zhì)，但當其細胞外濃度過高時，可產(chǎn)生興奮性神經(jīng)毒性，造成神經(jīng)元的損傷。前期我們以“β-淀粉樣蛋白級聯(lián)假說”為切入點，采用大鼠單側(cè)海馬區(qū)定向注射Aβ1-40復(fù)制AD動物模型，探討補陽還五湯對AD模型大鼠的作用及相關(guān)機制。研究結(jié)果表明，補陽還五湯對Aβ1-40所致AD模型大鼠學(xué)習(xí)記憶障礙具有明顯改善作用[14-16]；可顯著地降低AD模型大鼠海馬和皮質(zhì)Aβ沉積，改善Aβ所造成的神經(jīng)元和微血管損害，減輕腦組織炎性反應(yīng)；并且可以影響免疫炎性細胞因子及相關(guān)基因的表達[15-17]。然而補陽還五湯抗AD的分子調(diào)控機制仍有待于深入研究。

細胞凋亡(Apoptosis)是基因調(diào)控的自主、有序的死亡過程[18]。目前人們已認識到很多疾病的發(fā)生與細胞凋亡密切相關(guān)。細胞凋亡分子機制中重要的一條途徑為內(nèi)源性途徑， Caspase-9位于此途徑級聯(lián)反應(yīng)的上游，是凋亡途徑中重要起始因子[19]。本研究結(jié)果顯示，Caspase-9 在Aβ25-35誘導(dǎo)腦微血管內(nèi)皮細胞損傷表達量明顯高于正常組，引起細胞凋亡，而補陽還五湯干預(yù)后Caspase-9蛋白表達量降低，說明補陽還五湯具有抑制細胞凋亡作用。

Bax是Bcl-2基因家族中細胞凋亡促進基因[20-21]。本研究結(jié)果顯示，Bax在Aβ造模的大鼠微血管內(nèi)皮細胞表達量明顯高于正常細胞中的表達量(P<0.05)，提示在微血管內(nèi)皮細胞損傷導(dǎo)致的老年癡呆發(fā)生過程中可能有促凋亡基因 Bax 的參與，補陽還五湯作用大鼠微血管內(nèi)皮細胞后Bax蛋白表達下調(diào)，表明補陽還五湯可有效抑制Aβ誘導(dǎo)的細胞凋亡，從而起到保護的作用。

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Protective Effects of Buyang Huanwu Decoction on Apoptosis ofMicrovascular Endothelial Cells Induced by Aβ in Rats

LIU Bin1,LIU Guo-liang1,ZHANG Ning1,ZHANG Hong2,ZHANG Tao2,DONG Xiao-hong1,ZHOU Zhong-guang1

(1.HeilongjiangUniversityofChineseMedicine,Harbin150040,China；2.JiamusiUniversity，Jiamusi154007，China)

Objective：To investigate the influence of Buyang Huanwu decoction on apoptosis of microvascular endothelial cells induced by Aβin rats. Methods: Establish the damage models of microvascular endothelial cells induced by Aβ and different concentrations of Buyang Huanwu decoction (0.1, 1, 10 ug/ml) were given. Methylthiazolyl tetrazolium (MTT) assay was adopted to measure the viability of microvascular endothelial cells. Western blot method was used to determine the expression of bax and caspase-9 proteins. Results: The expression of bax and caspase-9 proteins of microvascular endothelial cells induced by Aβ were inhibited by Buyang Huanwu decoction (0.1, 1, 10 ug/ml) in a concentration-dependent manner. Conclusion: Buyang Huanwu decoction can inhibit the expression of bax and caspase-9 proteins and it has a protective effect on microvascular endothelial cells in rats, which may be an effective therapeutic agent for cardiovascular system diseases.

Buyang Huanwu decoction; Bax；Caspase9；Microvascular endothelial cells in rats

2016-10-12

2016-12-10

黑龍江省教育廳科學(xué)技術(shù)研究項目(12541758)

劉斌(1970-)，男，副教授，博士研究生，主要從事中醫(yī)藥防治老年性癡呆及其抗腫瘤的研究工作。

*通訊作者：張濤(1971-)，女，博士，教授，碩士研究生導(dǎo)師，主要從事腫瘤免疫機制及中藥抗腫瘤研究。

R285.5;R289.56

A

1002-2392(2017)02-0077-03