銀杏葉提取物對(duì)人胚肺成纖維細(xì)胞增殖與凋亡的干預(yù)研究

張興彩,蔡余力,張偉,陳憲海

(山東中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院肺病科，山東 濟(jì)南 250011)

銀杏葉提取物對(duì)人胚肺成纖維細(xì)胞增殖與凋亡的干預(yù)研究

張興彩,蔡余力,張偉,陳憲海

(山東中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院肺病科，山東 濟(jì)南 250011)

目的:觀察銀杏葉提取物對(duì)人胚肺成纖維細(xì)胞增殖、凋亡的影響，為臨床治療肺纖維化提供理論依據(jù)。方法：HELF細(xì)胞培養(yǎng)后，分別分為A對(duì)照組；B模型組加入TGF-β1；C1-3TGF-β1+銀杏葉提取物低中高劑量組。MTT法測(cè)量各孔吸光度OD值并計(jì)算各藥物組細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率，流式細(xì)胞術(shù)Annexin V/PI雙染色法檢測(cè)細(xì)胞凋亡率。結(jié)果：與對(duì)照組相比，模型組細(xì)胞OD值明顯升高；與模型組相比，銀杏葉提取物各濃度組細(xì)胞增殖OD值均明顯降低，其中高濃度組明顯低于中、低濃度組，經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，有顯著差異性(P<0.05)。與對(duì)照組相比，模型組細(xì)胞凋亡率明顯降低；與模型組相比，銀杏葉提取物各濃度組細(xì)胞凋亡率均明顯升高，其中高濃度組明顯高于中、低濃度組，經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，有顯著差異性(P<0.05)。結(jié)論：TGF-β1可明顯促進(jìn)成肺纖維細(xì)胞的增殖，抑制其凋亡；銀杏葉提取物具有抑制肺成纖維細(xì)胞增殖，促進(jìn)其凋亡的作用，且作用成一定量效相關(guān)。

TGF-β；人胚肺成纖維細(xì)胞(HELF)；銀杏葉提取物；肺纖維化

肺間質(zhì)纖維化(簡(jiǎn)稱肺纖維化)是最常見的肺間質(zhì)疾病,也是呼吸系統(tǒng)最嚴(yán)重疾病之一。它累及肺間質(zhì)、肺泡和(或)細(xì)支氣管的肺部彌漫性疾病,其主要病理改變?yōu)閺浡苑闻菅装Y，肺泡上皮細(xì)胞持續(xù)損傷，肺成纖維細(xì)胞過(guò)度增殖，細(xì)胞外基質(zhì)的反復(fù)修復(fù)和過(guò)度沉積。目前已有多種中藥制劑用于治療肺纖維化，其療效及可能的作用機(jī)制都尚未明確[1-2]。目前關(guān)于中藥對(duì)肺纖維化的研究多以動(dòng)物模型為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，與人體研究結(jié)果尚存在差異。本研究通過(guò)體外培養(yǎng)人胚肺成纖維細(xì)胞HELF，利用TGF-β誘導(dǎo)其肺纖維化模型, 觀察銀杏葉提取物對(duì)細(xì)胞增殖、細(xì)胞凋亡的影響。進(jìn)一步探討中藥的作用機(jī)理，為臨床治療肺纖維化提供理論依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 實(shí)驗(yàn)細(xì)胞

實(shí)驗(yàn)所用細(xì)胞株購(gòu)自南京凱基生物科技發(fā)展有限公司，使用含10%的胎牛血清的α-MEM培養(yǎng)基，置入5%CO2、37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)HLF-Ⅰ細(xì)胞，當(dāng)培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)細(xì)胞生長(zhǎng)達(dá)80%左右時(shí)，用胰酶消化傳代，選擇第3～4代細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。

1.2 實(shí)驗(yàn)藥物

銀杏葉提取物：商品名金納多，17.5 mg/5 mL，批準(zhǔn)文號(hào)：X20010117，德國(guó)威瑪舒培博士藥廠。

1.3 主要試劑

小牛血清：南京凱基生物科技發(fā)展有限公司；α-MEM培養(yǎng)基(含青霉素、鏈霉素)：南京凱基生物科技發(fā)展有限公司；GF-β1(儲(chǔ)存液：0.01 μg/μL；工作液：1 ng/5 μL；終濃度：1 ng/mL)：南京凱基生物科技發(fā)展有限公司；胰蛋白酶：美國(guó)Sigma公司；二甲基亞砜(DMSO)：美國(guó)Sigma公司；MTT：美國(guó)Amresco公司；碘化丙啶(PI)：美國(guó)Sigma公司；其它常規(guī)化學(xué)試劑均為進(jìn)口或國(guó)產(chǎn)分析純產(chǎn)品。

1.4 主要儀器

超凈工作臺(tái)：YZ-875 蘇州凈化設(shè)備廠；低溫離心機(jī)：國(guó)產(chǎn)，儀器型號(hào)：TG16W；流式細(xì)胞儀：Beckman XL型，Beckman Coulter 公司；CO2培養(yǎng)箱：國(guó)產(chǎn)，儀器型號(hào)：GNP-9080型；恒溫水浴箱：江蘇常州國(guó)華儀器廠；振蕩混合儀：美國(guó)，儀器型號(hào)：S0200-230V；酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀：TAKARA，日本；紫外分光光度計(jì)：ND1000，美國(guó)；移液槍：吉爾森。

1.5 主要試劑的配制

培養(yǎng)液：90%培養(yǎng)基+10%胎牛血清；消化液：胰蛋白酶-EDTA消化液；凍存液：10%DMSO+90%胎牛血清；PBS(磷酸鹽緩沖液)：0.2 mol/L 磷酸氫二鈉溶液+磷酸氫二鈉(無(wú)水)28.4 g+氯化鈉8.77 g+去離子水或雙蒸水至1000 mL。調(diào)pH至7.2，高壓滅菌。

2 方法

2.1 HELF細(xì)胞分組處理

2.1.1 收集細(xì)胞并記數(shù)

大培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)細(xì)胞經(jīng)胰酶消化后，離心收集，棄上清液，用新的培養(yǎng)液定容至4mL，取少量用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)。

2.1.2 細(xì)胞接種至培養(yǎng)板

96孔板用于MTT實(shí)驗(yàn)，按照實(shí)驗(yàn)分組接種，每組5個(gè)復(fù)孔，使細(xì)胞濃度達(dá)到：1×105個(gè)/mL，體積：200 μL/孔；16孔板用于流式凋亡細(xì)胞檢測(cè)，每組3個(gè)復(fù)孔，使細(xì)胞濃度達(dá)到：1×105個(gè)/mL，體積：2 mL/孔?；靹?，5%CO2、37℃培養(yǎng)箱中貼壁培養(yǎng)4 h。

2.1.3 實(shí)驗(yàn)分組

A組為對(duì)照組；B組為模型組加入TGF-β1(1 ng/mL)；C1組加入TGF-β1(1 ng/mL) +銀杏葉提取物(5 μL/mL)；C2組加入TGF-β1(1 ng/mL)+銀杏葉提取物(10 μL/mL)；C3組加入TGF-β1(1 ng/mL)+銀杏葉提取物(20 μL/mL)；12孔板每組各6個(gè)復(fù)孔，96孔板每組各5個(gè)復(fù)孔。加藥后充分混勻，孵育24 h。

2.2 方法

2.2.1 MTT實(shí)驗(yàn)

96孔板，每孔加入200 μL的培養(yǎng)液，鋪板使待測(cè)細(xì)胞調(diào)密度至1×105個(gè)/mL，(邊緣孔用無(wú)菌PBS填充)。提前4 h每孔加入MTT(噻唑藍(lán))10 μL，輕晃混勻，放入CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)，若藥物與MTT能夠反應(yīng)，可先離心后棄去培養(yǎng)液，小心用PBS沖2～3遍后，再加入含MTT的培養(yǎng)液。4 h后取出板，棄上清液，在預(yù)先準(zhǔn)備好的吸水紙上輕拍兩下，棄凈上清液。用排槍加入DMSO(二甲基亞砜)，在振蕩器上低速震蕩10 min，使結(jié)晶物充分溶解。490 nm波長(zhǎng)依序測(cè)量各孔吸光度OD值并計(jì)算各藥物組細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率。細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率計(jì)算公式：生長(zhǎng)抑制率=(對(duì)照組OD值-藥物組OD值)/對(duì)照組OD值×100%。

2.2.2 流式檢測(cè)細(xì)胞凋亡

藥物作用24 h后，從CO2培養(yǎng)箱取出12孔板，拍照，每孔取1 mL上清液至1.5 mLEP管，置于-80℃凍存，用于ELISA法檢測(cè)培養(yǎng)上清液中的蛋白含量。取凈剩余上清液，1×PBS(磷酸緩沖鹽溶液)洗2遍，加入適量胰酶消化，用培養(yǎng)液終止消化，收集細(xì)胞至EP管，4℃離心，650 g，7 min，1×PBS洗2遍，用500 μL 1×binding buffer重懸細(xì)胞，過(guò)濾轉(zhuǎn)管，抗體標(biāo)記：FITC-Annexin V 4μL，PI 8μL，室度避光孵育5 min，上機(jī)檢測(cè)(分析軟件：采用Winmidi 2.9分析)。結(jié)果判斷：凋亡細(xì)胞對(duì)細(xì)胞活性染料PI有抗染性，壞死細(xì)胞則不能。細(xì)胞膜有損傷的細(xì)胞的DNA可被PI著染產(chǎn)生紅色熒光，而細(xì)胞膜保持完好的細(xì)胞則不會(huì)有紅色熒光產(chǎn)生。因此，在細(xì)胞凋亡的早期PI不會(huì)著染而沒有紅色熒光信號(hào)。正常活細(xì)胞與此相似。

2.3 觀察指標(biāo)

2.3.1 對(duì)細(xì)胞增殖的影響

MMT法檢測(cè)人胚肺成纖維細(xì)胞增殖情況，以確定TGF-β1對(duì)其增殖的影響，以及藥物對(duì)細(xì)胞增殖的抑制作用。

2.3.2 對(duì)細(xì)胞凋亡的影響

流式細(xì)胞術(shù)Annexin V/PI雙染色法檢測(cè)細(xì)胞凋亡率。

2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

3 結(jié)果

3.1 MTT實(shí)驗(yàn)

表1 MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果

注：與模型組比較，△P<0.05；與不同濃度組比較，▲P<0.05;與對(duì)照組比較，★P<0.05

見表1。與對(duì)照組相比，模型組細(xì)胞OD值明顯升高；與模型組相比，銀杏葉提取物各濃度組細(xì)胞增殖OD值均明顯降低，其中高濃度組明顯低于中、低濃度組，經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，有顯著差異性(P<0.05)。

3.2 流式檢測(cè)細(xì)胞凋亡

見表2、圖1。與對(duì)照組相比，模型組細(xì)胞凋亡率明顯降低；與模型組相比，銀杏葉提取物各濃度組細(xì)胞凋亡率均明顯升高，其中高濃度組明顯高于中、低濃度組，經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，有顯著差異性(P<0.05)。

圖1 各組流式細(xì)胞凋亡散點(diǎn)圖(B2-壞死細(xì)胞，B3-活細(xì)胞，B4-凋亡細(xì)胞)

組別凋亡率(%)對(duì)照組7．3±0．60模型組2．6±0．36★銀杏葉低濃度組4．5±0．49△▲銀杏葉中濃度組6．7±0．45△▲銀杏葉高濃度組8．3±0．46△▲

注：與模型組比較，△P<0.05；與同種藥物不同濃度組比較，▲P<0.05；與對(duì)照組比較，★P<0.05

4 討論

銀杏葉為銀杏科植物銀杏的干燥葉，性味苦、澀，平。具有斂肺平喘，活血止痛之功效。銀杏葉提取物以銀杏黃酮為主要活性成分具有擴(kuò)張血管、改善微循環(huán)及抗氧化、清除氧自由基的作用。有實(shí)驗(yàn)證實(shí)銀杏葉提取物可抑制TGF-β1誘導(dǎo)人腎小管上皮細(xì)胞的α-SMA及Ⅰ型膠原的表達(dá)[3]；從銀杏葉中分離的成分Bioparyl可以調(diào)節(jié)核糖核酸酶的活性，防止或逆轉(zhuǎn)各組織的纖維變性[4]；銀杏葉提取物能夠有效抑制實(shí)驗(yàn)性肺纖維化大鼠血清PDGF和TGF-β1的表達(dá), 對(duì)肺纖維化具有一定的防治作用[5]；銀杏葉制劑可以抑制NF-kB活性，從而使其調(diào)控的TGF-βmRNA表達(dá)及其蛋白分泌降低，而使肺泡炎及纖維化的程度減輕[6]。目前，相關(guān)研究主要以動(dòng)物實(shí)驗(yàn)為主,尚缺乏大樣本的臨床研究資料。

肺纖維化過(guò)程中的一個(gè)重要病理特點(diǎn)就是成纖維細(xì)胞的異常分裂增殖，正常情況下肺組織內(nèi)成纖維細(xì)胞處于靜息狀態(tài)，當(dāng)纖維化發(fā)生時(shí)，成纖維細(xì)胞受到內(nèi)外各種因素的刺激活化，從靜息狀態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)檫^(guò)度增殖狀態(tài)，使成纖維細(xì)胞的數(shù)目不斷增加。過(guò)多的成纖維細(xì)胞逐漸形成肺部的成纖維灶，取代正常的肺組織，導(dǎo)致肺部結(jié)構(gòu)的異常重塑，進(jìn)而誘發(fā)肺間質(zhì)纖維化。這一過(guò)程是成纖維細(xì)胞參與肺纖維化的重要方面。發(fā)生肺纖維化時(shí)，活化的成纖維細(xì)胞發(fā)生功能和表型改變，轉(zhuǎn)化為可以表達(dá)α-SMA的肌成纖維細(xì)胞[7]。肌成纖維細(xì)胞同時(shí)具有成纖維細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞的特性，導(dǎo)致纖維化后肺組織的機(jī)械特性發(fā)生改變，順應(yīng)性降低。研究發(fā)現(xiàn), 肌成纖維細(xì)胞的凋亡在纖維化的發(fā)展過(guò)程中受到抑制，而且持續(xù)存在,從而導(dǎo)致纖維化進(jìn)行性發(fā)展。因此，通過(guò)促進(jìn)成纖維細(xì)胞的凋亡,有利于肺纖維化恢復(fù)[8]。

本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果表明：銀杏葉提取物可以抑制肺成纖維細(xì)胞的異常增殖，并促進(jìn)肺成纖維細(xì)胞凋亡，其中高濃度組作用最顯著，結(jié)果顯示其作用呈一定的量效相關(guān)關(guān)系。由此推測(cè)銀杏葉提取物主要通過(guò)干預(yù)肺成纖維細(xì)胞的增殖與凋亡，起到減緩和阻斷肺纖維化的發(fā)生與發(fā)展的作用。目前，中藥制劑已廣泛應(yīng)用于肺纖維化的臨床治療，但不同藥物的作用靶點(diǎn)不盡相同，在中醫(yī)辨證論治與辨病論治相結(jié)合的基礎(chǔ)上，更加深入了解中藥制劑的作用機(jī)理，將有助于揭示肺纖維化的中醫(yī)病因病機(jī)實(shí)質(zhì)，獲得更好的臨床療效。

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Effect of Ginkgo Biloba Extract on Proliferation and Apoptosis ofHuman Embryonic Lung Fibroblasts

ZHANG Xing-cai, CAI Yu-li, ZHANG Wei, CHEN Xian-hai

(DepartmentofLungDiseases,AffiliatedHospitalofShandongUniversityofTraditionalChineseMedicine,Jinan250011,China)

Objective:The research observed the effect of ginkgo biloba extract on the proliferation and apoptosis of human embryonic lung fibroblasts ,to provided the theory basis for clinical treatment of pulmonary fibrosis. Methods: After HELF cell culture, the cells were divided into control group A, model group B which was added withTGF-β1, groups C1-3 which were added withTGF-β1and ginkgo biloba extract from low to high doses. Each hole absorbance of OD value was measured by MTT method and the cell growth inhibition rate of all drug groups were calculated, and the cell apoptosis rates were detected by flow cytometry Annexin V/PI double staining method. Results: The cell OD value of the model group B was increased significantly compared with that of the control group A; the cell OD value of groups C1-3 which were added withTGF-β1 and ginkgo biloba extract from low to high doses were significantly lower compared with model group B, and the cell OD value of group C3 which was added withTGF-β1 and ginkgo biloba extract of high dose was significantly lower than that of the medium dose or the low dose.There was a significant difference after statistics processing (P<0.05).The cell apoptosis rate of model group B was significantly decreased compared with that of control group A; the cell apoptosis rate of groups C1-3 which were added withTGF-β1 and ginkgo biloba extract from low to high doses were significantly higher compared with that of model group B, and the cell apoptosis rate of group C3 which was added with TGF-β1 and ginkgo biloba extract of high dose was significantly higher than that of the medium dose or the low dose. There was a significant difference after statistics processing (P<0.05). Conclusion: The TGF-β1 can obviously promote the proliferation of the lung fibroblasts, inhibit its apoptosis; Ginkgo biloba extract can inhibit the proliferation and promote the apoptosis of the lung fibroblast, and the effect is related to the dose.

TGF-β1; Human embryonic lung fibroblasts (HELF); Ginkgo biloba extract; Pulmonary fibrosis

2016-04-08

2016-09-03

中醫(yī)肺病學(xué)泰山學(xué)者崗位資金資助(ts20110819);山東省博士后創(chuàng)新項(xiàng)目專項(xiàng)基金(201303066)

張興彩(1974-)，女，博士，副主任醫(yī)師，碩士研究生導(dǎo)師,主要從事中醫(yī)肺病學(xué)專業(yè)。

R285.5

A

1002-2392(2017)02-0029-04