歸芪多糖對(duì)衰老大鼠腎組織氧化損傷作用的研究

蒲秀瑛，李海兵，李曉玥，馬小龍，劉璐，任菁

(蘭州理工大學(xué) 生命科學(xué)與工程學(xué)院 甘肅省中藏藥篩選評(píng)價(jià)及深加工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，甘肅 蘭州 730050)

歸芪多糖對(duì)衰老大鼠腎組織氧化損傷作用的研究

蒲秀瑛，李海兵，李曉玥，馬小龍，劉璐，任菁

(蘭州理工大學(xué) 生命科學(xué)與工程學(xué)院 甘肅省中藏藥篩選評(píng)價(jià)及深加工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，甘肅 蘭州 730050)

目的：研究歸芪多糖對(duì)D-半乳糖所致衰老大鼠腎組織氧化損傷的影響。方法：通過(guò)水提醇沉法從一定比例的當(dāng)歸和黃芪中提取出歸芪多糖，并用苯酚-硫酸法進(jìn)行多糖含量測(cè)定；除正常對(duì)照組外其余各組均采用D-半乳糖(0.15 g/kg/d)皮下注射建立大鼠衰老模型；以不同劑量的歸芪多糖(2.0 g/kg和0.5 g/kg)給大鼠連續(xù)灌胃42 d后，測(cè)定其腎組織中超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶(GSH-PX)活力、谷胱甘肽(GSH)含量、丙二醛(MDA)含量和蛋白質(zhì)羰基含量。結(jié)果：歸芪多糖可增強(qiáng)衰老大鼠腎組織中的SOD、GSH-PX活力和GSH含量，顯著降低MDA和蛋白羰基含量。結(jié)論：歸芪多糖可保護(hù)D-半乳糖所致衰老大鼠腎組織的氧化損傷，從而起到保護(hù)腎臟衰老的作用。

歸芪多糖；衰老；SOD；GSH-PX；GSH；MDA；蛋白羰基

衰老(senescence, aging)，又稱老化，是指生物體發(fā)育成熟后，隨著年齡的增長(zhǎng)，機(jī)體在形態(tài)、結(jié)構(gòu)、功能方面出現(xiàn)的種種不利的漸進(jìn)性退行性變化，如皮膚變薄起皺、色素形成、器官老化、智力下降等[1-2]。目前認(rèn)為，由自由基引起機(jī)體衰老的主要機(jī)制有生命大分子的交聯(lián)聚合和脂褐素的堆積、器官組織細(xì)胞的破壞與減少和自由基作用于免疫系統(tǒng)，引起細(xì)胞免疫與體液免疫功能減弱等[3]。

當(dāng)歸和黃芪，是我國(guó)歷史悠久、臨床應(yīng)用廣泛的中藥之一，是甘肅省的道地藥材，具有益氣補(bǔ)血、增強(qiáng)免疫功能、抗氧化、改善腎病患者蛋白質(zhì)、脂質(zhì)和糖代謝紊亂等作用[4-5]。歸芪多糖(GQP)是由當(dāng)歸和黃芪按照質(zhì)量比1:5混合提取的植物多糖，前期的研究結(jié)果表明，GQP可延緩D-半乳糖所致大鼠的衰老，但對(duì)衰老大鼠腎組織氧化損傷的作用未進(jìn)行研究。在此基礎(chǔ)上，本研究通過(guò)D-半乳糖建立衰老大鼠模型，研究歸芪多糖對(duì)衰老大鼠腎組織超氧化物歧化酶(SOD)和谷胱甘肽過(guò)氧化物酶(GSH-PX)的活力、谷胱甘肽(GSH)含量、丙二醛(MDA)含量和蛋白質(zhì)羰基含量的影響，從而來(lái)判斷歸芪多糖是否具有保護(hù)衰老大鼠腎組織氧化損傷的作用，為歸芪多糖的進(jìn)一步開發(fā)利用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 藥材及實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

當(dāng)歸、黃芪均購(gòu)自甘肅岷縣順發(fā)藥材有限公司。藥材樣品分別經(jīng)甘肅省藥品檢驗(yàn)所鑒定為當(dāng)歸Angelicasinensis(Oliv)和膜莢黃芪Astragalusmembranaceus(Fisch)Bge的干燥的根。

Wistar大鼠：SPF級(jí)，體質(zhì)量180 g～200 g，雌雄各半，購(gòu)于甘肅中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。

1.2 試劑及儀器

超氧化物歧化酶(SOD)試劑盒、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶(GSH-PX)試劑盒、還原型谷胱甘肽(GSH)試劑盒、丙二醛(MDA)試劑盒、蛋白羰基含量測(cè)定試劑盒、總蛋白濃度測(cè)定試劑盒均購(gòu)于南京建成科技有限公司，D-半乳糖(sigma公司)，維生素E(廈門星鯊制藥有限公司，批號(hào):091110)。

ES-2002H電子天平(上海良平儀器儀表有限公司)，高速臺(tái)式離心機(jī)(上海安亭科學(xué)儀器廠)，HH-4恒溫水浴鍋(北京科委永興儀器有限公司)，N4S紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)(上海儀電分析儀器有限公司)。

1.3 歸芪多糖的制備及含量測(cè)定

1.3.1 水提醇沉法提取歸芪多糖粗品

將當(dāng)歸與黃芪的混合物(1∶5)以10倍量(體積質(zhì)量比)80%的乙醇回流提取2次，每次2 h；過(guò)濾得歸芪粗粉。然后將歸芪殘?jiān)尤雸A底燒瓶中，加蒸餾水1∶10料液比，80 ℃蒸餾水超聲、回流2次，每次2 h。水提取物加3倍乙醇4 ℃沉淀12 h；沉淀物蒸餾水溶解，離心，得上清液，減壓濃縮，得歸芪多糖粗品[6]。

1.3.2 Sevag法除蛋白

將歸芪多糖粗品用少量蒸餾水溶解，將氯仿按多糖水溶液1/5體積加入，然后加氯仿體積1/5的正丁醇，劇烈振搖20 min離心，分去水層與溶液層交界處的變性蛋白，重復(fù)3～5次；收集上層多糖溶液，減壓濃縮得歸芪多糖[7]。

1.3.3 歸芪多糖中多糖含量的測(cè)定

應(yīng)用苯酚-硫酸法測(cè)定歸芪多糖的多糖含量[8]。

1.4 歸芪多糖對(duì)腎組織氧化損傷作用的影響

1.4.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組

取50只大鼠，隨機(jī)分為5組，每組10只，雌雄各半，分別為正常對(duì)照組、衰老模型對(duì)照組、陽(yáng)性藥物對(duì)照組(維生素E混懸液0.1 g/kg)、歸芪多糖高劑量組、歸芪多糖低劑量組[9]。

1.4.2 衰老大鼠模型的建立及灌胃給藥

除正常對(duì)照組外，其余各組大鼠按0.15 g/(kg·d)皮下注射D-半乳糖，正常對(duì)照組注射同劑量的生理鹽水。從第8天開始，同時(shí)對(duì)歸芪多糖高、低劑量組進(jìn)行灌胃，配置100 mg/mL的歸芪多糖水溶液，高劑量組按2 g/(kg·d)、低劑量組按0.5 g/(kg·d)灌胃。同時(shí)配置維生素E混懸液(0.1 g/kg)作為陽(yáng)性對(duì)照組，每只每天灌服，1次/天，共計(jì)42 d[10-11]。

1.4.3 腎組織氧化損傷指標(biāo)的檢測(cè)

42 d后，處死大鼠，取出部分腎組織用預(yù)冷的生理鹽水漂洗，拭干，加入9倍體積的冷生理鹽水，玻璃勻漿器充分研磨，3 000 r/min離心5 min，收集上清得10%的腎組織勻漿液。采用相應(yīng)的試劑盒測(cè)定腎組織SOD、GSH-PX活力，GSH、MDA和蛋白羰基含量[12]。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果與分析

2.1 歸芪多糖得率及多糖含量的測(cè)定

歸芪多糖得率為8.79%，苯酚-硫酸法測(cè)得其多糖含量為87.6%。

2.2 歸芪多糖對(duì)衰老大鼠腎組織MDA、蛋白羰基含量的影響

從表1可以看出，衰老模型組與正常對(duì)照組相比，MDA含量顯著升高(P<0.05)，說(shuō)明D-半乳糖可加速大鼠衰老，自由基引發(fā)腎組織脂質(zhì)過(guò)氧化，不飽和脂肪酸破壞，使MDA產(chǎn)量增多；經(jīng)過(guò)高、低劑量歸芪多糖(2、0.5 g/kg)以及維生素E(100 mg/kg)的干預(yù)后，各組大鼠的MDA含量均顯著降低，其中歸芪多糖高劑量組下降呈顯著差異(P<0.05),歸芪多糖低劑量組下降呈極顯著差異(P<0.01)，提示歸芪多糖低劑量組效果更好。陽(yáng)性藥物組與歸芪多糖高劑量組和低劑量組比較無(wú)顯著性差異，提示歸芪多糖與維生素E具有同等的降低腎組織MDA含量的作用。

衰老模型組與正常對(duì)照組相比，蛋白羰基含量顯著升高(P<0.05)，表明自由基攻擊蛋白質(zhì)造成機(jī)體的氧化損傷，使蛋白質(zhì)羰基含量升高；經(jīng)歸芪多糖及維生素E保護(hù)后，陽(yáng)性對(duì)照組與給藥組的羰基蛋白含量含量均降低，其中陽(yáng)性對(duì)照組與歸芪多糖低劑量組下降更顯著(P<0.05)，但各給藥組間相比無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，表明歸芪多糖與維生素E具有同等的抑制腎組織蛋白質(zhì)羰基化的作用，且歸芪多糖低劑量組優(yōu)于高劑量組。

表1 歸芪多糖對(duì)衰老大鼠腎組織MDA、蛋白羰基含量的影響±s)

注：與衰老模型組相比，*P<0.05,**P<0.01

2.3 歸芪多糖對(duì)衰老大鼠腎組織SOD、GSH-PX活力和GSH含量的影響

從表2可以看出，衰老模型組與正常對(duì)照組相比，SOD活力顯著降低(P<0.01)，表明衰老大鼠體內(nèi)SOD清除氧自由基的能力衰弱，從而導(dǎo)致腎組織受氧化損傷嚴(yán)重。經(jīng)歸芪多糖及維生素E保護(hù)后，陽(yáng)性對(duì)照組與給藥組的SOD活力均顯著升高(P<0.01)，增強(qiáng)腎組織清除自由基的能力，從而達(dá)到抗衰老防氧化的作用，其中歸芪多糖低劑量組的效果更好。陽(yáng)性藥物組與歸芪多糖高劑量組和低劑量組比較無(wú)顯著性差異，提示歸芪多糖與維生素E具有同等的增強(qiáng)SOD清除氧自由基能力的作用。

衰老模型組與正常對(duì)照組相比，GSH-PX活力顯著降低(P<0.01)。經(jīng)歸芪多糖及維生素E干預(yù)后，陽(yáng)性對(duì)照組與給藥組的GSH-PX活力均升高，其中歸芪多糖高劑量組和低劑量組升高呈顯著性差異(P<0.05)。陽(yáng)性藥物組與歸芪多糖高劑量組和低劑量組相比無(wú)顯著性差異，提示歸芪多糖與維生素E具有同等的降低GSH-PX活力的作用，且歸芪多糖低劑量組優(yōu)于高劑量組。

衰老模型組與正常對(duì)照組相比，GSH含量顯著降低(P<0.01)；經(jīng)歸芪多糖及維生素E保護(hù)后，陽(yáng)性對(duì)照組與歸芪多糖高劑量組的GSH含量升高呈顯著性差異(P<0.05)，歸芪多糖低劑量組升高呈極顯著性差異(P<0.01)，提示歸芪多糖低劑量組的效果更好，但各給藥組間無(wú)顯著性差異，表明歸芪多糖和維生素E具有同等的降低GSH含量的作用。

表2 歸芪多糖對(duì)衰老大鼠腎組織SOD、GSH-PX活力和GSH含量的影響±s)

注：與衰老模型組相比,*P<0.05,**P<0.01

3 討論

在抗衰老的科學(xué)研究中，建立恰當(dāng)衰老動(dòng)物模型是成功實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)。目前用于衰老機(jī)制研究的動(dòng)物主要采用自然衰老動(dòng)物或人為致衰的動(dòng)物， 后者因其具有個(gè)體差異小， 實(shí)驗(yàn)周期短，節(jié)省人力物力等優(yōu)點(diǎn)廣泛用于衰老機(jī)制、抗衰老藥物篩選方面的研究。本實(shí)驗(yàn)采用D-gal制作衰老模型，結(jié)果顯示，模型組在注射D-半乳糖42 d后，大鼠腎組織MDA、蛋白羰基含量升高，SOD、GSH-PX活力、GSH含量下降。說(shuō)明D-半乳糖致衰老大鼠的指標(biāo)與自然衰老時(shí)大鼠的免疫指標(biāo)基本一致。因此，D-半乳糖致亞急性衰老模型是可行的[13]。

丙二醛(MDA)是氧自由基攻擊生物膜中的多不飽和脂肪酸引發(fā)脂質(zhì)過(guò)氧化作用形成的產(chǎn)物，可間接地反映機(jī)體細(xì)胞受自由基攻擊的嚴(yán)重程度，即細(xì)胞受損程度。它可以作為交聯(lián)劑與多種生物大分子發(fā)生交聯(lián)，被交聯(lián)的物質(zhì)喪失其生物活性。因此，MDA可以作為評(píng)價(jià)衰老的指標(biāo)之一，測(cè)定MDA水平變化能較好地反映脂質(zhì)過(guò)氧化水平[14]。

自由基過(guò)量產(chǎn)生可引起不同程度的細(xì)胞毒性及瞬時(shí)的不可逆損傷，抗氧化防御系統(tǒng)能防止氧及代謝產(chǎn)物的毒性反應(yīng)，維持其平衡，是決定細(xì)胞生存狀態(tài)的重要因素。機(jī)體防御體系包括抗氧化酶類如SOD、GSH-PX等；非酶類抗氧化物質(zhì)如VC、VE、GSH等。這個(gè)防御體系的抗氧化能力的強(qiáng)弱與健康程度存在著密切聯(lián)系。超氧化物歧化酶(SOD)廣泛分布于各種生物體內(nèi)，是目前為止發(fā)現(xiàn)的唯一以自由基為底物的酶，能將 O2-歧化為 H2O2和 O2,是機(jī)體內(nèi)對(duì)抗自由基的第一道防線。且可與 GSH-Px 協(xié)同作用防止脂質(zhì)過(guò)氧化及其代謝產(chǎn)物對(duì)機(jī)體的損害。因此其活力與含量反應(yīng)了機(jī)體清除自由基的能力[15]。

GSH-Px是一種含硒的廣泛存在于細(xì)胞線粒體、胞漿內(nèi)以及生物膜上的水溶性四聚體蛋白酶，可通過(guò)特異性催化還原型谷胱甘肽對(duì)過(guò)氧化氫的還原反應(yīng)，對(duì)由活性氧和羥自由基誘發(fā)的脂質(zhì)過(guò)氧化物及過(guò)氧化氫有極強(qiáng)的清除能力, 從而保護(hù)細(xì)胞免受自由基損害。隨增齡，體內(nèi)自由基增多，GSH-Px 的活性降低,因此可作為評(píng)價(jià)組織細(xì)胞衰老的又一個(gè)重要指標(biāo)[16]。

谷胱甘肽(glutathione，GSH)是一種低分子清除劑，它可清除O2-和H2O2，是組織中重要蛋白的巰基化合物。GSH分子中的巰基容易失氫而氧化，因而消除體內(nèi)的活性氧，具有保護(hù)酶和蛋白質(zhì)免受氧化、臟器免受損傷的功效[17]。

蛋白質(zhì)羰基的產(chǎn)生是蛋白質(zhì)分子被自由基氧化修飾的一個(gè)重要標(biāo)記，可判斷蛋白質(zhì)是否受到氧化損傷。羰基類化合物主要從非酶糖基化、脂質(zhì)過(guò)氧化以及氨基酸的代謝中產(chǎn)生，是非酶糖基化和脂質(zhì)過(guò)氧化的共同中間產(chǎn)物，它們是造成蛋白修飾的直接原因之一[18]。

本實(shí)驗(yàn)研究表明，衰老模型組大鼠腎組織MDA含量、蛋白質(zhì)羰基含量較正常對(duì)照組均顯著升高，SOD、GSH-PX、GSH活力較正常對(duì)照組呈現(xiàn)明顯的下降趨勢(shì)，表明衰老大鼠腎組織受自由基攻擊損傷，脂質(zhì)過(guò)氧化物的含量增大，抗氧化酶活性降低，導(dǎo)致腎組織氧化損傷。灌服不同劑量的歸芪多糖后，腎組織中MDA和蛋白質(zhì)羰基含量均有不同程度的降低，SOD、GSH-PX、GSH活力均有不同程度的升高。其可能機(jī)制為：①歸芪多糖通過(guò)提高機(jī)體抗氧化防御體系能力，增強(qiáng)對(duì)自由基的清除能力，并能抑制自發(fā)或由羥自由基引發(fā)的脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)；②歸芪多糖可提高機(jī)體內(nèi)抗氧化關(guān)鍵酶如SOD、GSH-PX的活性，上調(diào)抗氧化關(guān)鍵酶的表達(dá)，從而提高了清除自由基的能力，抗氧化活性增加；③歸芪多糖可保護(hù)體內(nèi)還原型物質(zhì)，如GSH，從而增強(qiáng)抗氧化活性。陽(yáng)性藥物組與歸芪多糖高、低劑量組相比無(wú)顯著性差異，說(shuō)明歸芪多糖與維生素E具有相同的保護(hù)衰老大鼠腎組織氧化損傷的作用，且低劑量組優(yōu)于高劑量組，可能的原因是低劑量歸芪多糖與適量的黃酮類化合物和黃芪甲苷之間產(chǎn)生了協(xié)同保護(hù)腎組織的作用。

4 結(jié)論

在歸芪多糖對(duì)衰老大鼠腎組織氧化損傷作用的研究中，不同劑量的歸芪多糖可增強(qiáng)衰老大鼠腎組織中的SOD、GSH-PX活力和GSH含量，顯著降低MDA和蛋白質(zhì)羰基含量。此結(jié)果提示，歸芪多糖可保護(hù)D-半乳糖所致大鼠腎組織的氧化損傷，從而起到保護(hù)腎臟衰老的作用，它可能是通過(guò)提高抗氧化酶及非酶類抗氧化物質(zhì)的活性和抑制脂質(zhì)過(guò)氧化物的產(chǎn)生，使腎組織代謝維持正常并減少了自由基對(duì)其的氧化損傷，這為進(jìn)一步研究抗衰老的藥物提供了有力的科學(xué)依據(jù)。

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Effect of Guiqi Polysaccharide on Oxidative Damageof Kidney Tissue in Aging Rats

PU Xiu-ying, LI Hai-bing, LI Xiao-yue, MA Xiao-long, LIU Lu, REN Jing

(CollegeofLifeScienceandEngineering,LanzhouUniversityofTechnologyTheKeyLabofScreening,EvaluationandAdvancedProcessingofTCMandTibetanMedicine,GansuEducationalDepartment,Lanzhou730050,China)

Objective: To study the effect of Guiqi polysaccharide on oxidative damage of kidney tissue in D- galactose-induced aging rats. Methods: We extracted polysaccharide from a percentage of angelica and astragalus membranaceus through the water extraction and alcohol precipitation method, and determined the content of polysaccharide with phenol sulfuric acid method. D-galactose was subcutaneous injected at a dose of 0.15 g/kg body weight every day except the normal control group. Rats of the low- and high-dose Guiqi polysaccharide (2.0 g/kg and 0.5 g/kg) were orally administrated daily for 42 days, respectively.Then superoxide dismutase (SOD ) activity,the content of glutathione peroxidase (GSH-PX), glutathione (GSH), malondialdehyde (MDA) content, protein carbonyl of kidney were determined, respectively. Results: Guiqi polysaccharides could enhance SOD, GSH-PX, GSH enzyme activity in renal tissue of aging rats,and it could significantly decrease the content of MDA and protein carbonyl . Conclusion: Guiqi polysaccharide can reduce free radical damage to the kidney of aging rats and protect the normal kidney from senescence.

Guiqi polysaccharide; Aging; SOD; GSH-PX; GSH; MDA; Protein carbonyl

2016-03-25

2016-09-12

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(81260070)

蒲秀瑛(1967-)，女，博士，副教授，碩士生導(dǎo)師，研究方向:臨床前藥理學(xué)和毒理學(xué)研究。

R285.5

A

1002-2392(2017)02-0015-04