四逆散有效組分對(duì)慢性情緒應(yīng)激所致大鼠睡眠障礙的改善作用研究

葉曉楠，陳光，卞宏生，李廷利

(黑龍江中醫(yī)藥大學(xué),黑龍江 哈爾濱 150040)

四逆散有效組分對(duì)慢性情緒應(yīng)激所致大鼠睡眠障礙的改善作用研究

葉曉楠，陳光，卞宏生，李廷利*

(黑龍江中醫(yī)藥大學(xué),黑龍江 哈爾濱 150040)

目的：基于空瓶刺激誘發(fā)慢性情緒應(yīng)激所致大鼠睡眠障礙模型來(lái)研究四逆散有效組分是通過調(diào)整負(fù)性情緒來(lái)實(shí)現(xiàn)其改善睡眠的作用。方法：SD大鼠24只，隨機(jī)分為空白對(duì)照組、模型組、陽(yáng)性藥物對(duì)照地西泮組(1 mg/kg)、四逆散有效組分組(450 mg/kg)，每組6只。以空瓶刺激法建立情緒應(yīng)激模型。在模型復(fù)制的第2周開始灌胃給藥，共灌胃7 d。觀察四逆散有效組分對(duì)慢性情緒應(yīng)激大鼠的攻擊行為、睡眠時(shí)間、睡眠-覺醒節(jié)律，全腦TNF-α含量的影響。結(jié)果：與空白對(duì)照組比較，模型組大鼠的攻擊行為顯著增多(P<0.01)，全天睡眠時(shí)間顯著減少(P<0.05)，全腦TNF-α水平顯著降低(P<0.01)；與模型組比較，四逆散有效組分可使攻擊行為顯著減少(P<0.05)，全天睡眠時(shí)間顯著增多(P<0.05)，全腦TNF-α水平顯著增高(P<0.05)。結(jié)論：四逆散有效組分可通過改善負(fù)性情緒來(lái)實(shí)現(xiàn)其改善睡眠的作用，對(duì)全腦TNF-α水平的調(diào)節(jié)可能是其作用的機(jī)制之一。

空瓶刺激;應(yīng)激;負(fù)性情緒;睡眠障礙;細(xì)胞因子

隨著社會(huì)的進(jìn)步、生活節(jié)奏的加快、社會(huì)壓力的增加，心理應(yīng)激性失眠的患病率逐年升高[1]。事實(shí)上，失眠不僅是一個(gè)睡眠生理的紊亂過程，同時(shí)還是一種心理紊亂的過程[2]。中醫(yī)理論對(duì)失眠病因的解釋多是基于情緒所致心神不安，四逆散臨床治療失眠主要適用于肝郁氣滯型，其主旨病證也主要與情志紊亂導(dǎo)致失眠有關(guān)。實(shí)驗(yàn)室前期研究證明四逆散及其有效組分并無(wú)催眠作用，但是卻能特異性延長(zhǎng)正?；蛩邉儕Z大鼠的深睡時(shí)間[3]，認(rèn)為四逆散及其有效組分可能是通過調(diào)整負(fù)性情緒來(lái)實(shí)現(xiàn)其改善睡眠的作用?；谏鲜鲇^點(diǎn)，本實(shí)驗(yàn)采用空瓶刺激來(lái)作為慢性情緒應(yīng)激睡眠障礙的動(dòng)物模型[4]，以大鼠的攻擊行為、睡眠時(shí)間、睡眠-覺醒節(jié)律、全腦TNF-α含量為觀察指標(biāo)，研究四逆散有效組分改善睡眠的作用及作用機(jī)制，為臨床應(yīng)用四逆散治療失眠提供實(shí)驗(yàn)根據(jù)。

1 材料和方法

1.1 動(dòng)物

SD大鼠24只，雄性，體質(zhì)量(220±20)g，SPF級(jí)(由黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)藥物安全性評(píng)價(jià)中心GLP實(shí)驗(yàn)室提供，許可證號(hào)：P00700619號(hào))。飼養(yǎng)環(huán)境為通風(fēng)、避光、隔音、屏蔽狀態(tài)，采用自動(dòng)定時(shí)光控系統(tǒng)對(duì)大鼠的生活環(huán)境實(shí)行明暗光照周期處理(12 h照明/12 h黑暗，每天早上7時(shí)開始照明)，室溫：(24±2)℃，相對(duì)濕度：50%～60%，噪聲≤40 dB，光照強(qiáng)度：300 lux。

1.2 藥物及試劑

四逆散有效組分辛弗林(HPLC>98%，批號(hào)：CAS 5985-28-4)，芍藥苷(HPLC>98%，批號(hào)：MUST-13113009)，柴胡皂苷C(HPLC>98%，批號(hào)：MUST-13101013)，甘草次酸(HPLC>98%，批號(hào)：CAS 471-53-4)，均購(gòu)于成都思科華生物技術(shù)有限公司，其構(gòu)成比例為：辛弗林:芍藥苷:柴胡皂苷C:甘草次酸=8:1:1:5，加入含有2%吐溫-80的生理鹽水配置成濃度為66 mg/mL的混合溶液，備用。地西泮(2.5 mg/片，由石藥集團(tuán)歐意藥業(yè)有限公司生產(chǎn)，生產(chǎn)批號(hào)：國(guó)藥準(zhǔn)字H13020973)加生理鹽水配置成適當(dāng)濃度的混合溶液備用。TNF-α酶聯(lián)試劑盒(美國(guó)R&D公司，批號(hào)：20151019A)。

1.3 儀器

酶標(biāo)儀(美國(guó)BIO TEK公司，型號(hào)：Synergy MX),高速低溫冷凍離心機(jī)(美國(guó)TOMOS公司，型號(hào)：3-18R),移液槍(Effendorf AG),電動(dòng)玻璃勻漿機(jī)(寧波新芝生物科技股份有限公司，型號(hào)：DY89-II),實(shí)驗(yàn)動(dòng)物監(jiān)測(cè)系統(tǒng)(美國(guó)COLUMBUS公司，型號(hào)：CLAMS),動(dòng)物行為視頻分析系統(tǒng)(上海欣軟，型號(hào)：Super Maze)。

1.4 方法

1.4.1 分組、模型復(fù)制及給藥

選取SD大鼠24只，隨機(jī)分為4組，即空白對(duì)照組(C)，模型組(ES)，陽(yáng)性藥物對(duì)照地西泮組(DZP)、四逆散有效組分組(SNS)，每組6只。動(dòng)物適應(yīng)環(huán)境7天，每天撫摸動(dòng)物5 min，使大鼠適應(yīng)抓持。適應(yīng)環(huán)境結(jié)束后開始10 d的定時(shí)給水訓(xùn)練，僅每天早9:00～9:10和晚21:00～21:10給予飲水，其余時(shí)間不給水。于第18天開始持續(xù)2周的空瓶刺激，空白對(duì)照組大鼠仍每天固定時(shí)間給予飲水兩次，模型組、陽(yáng)性藥物對(duì)照組、四逆散有效組分組大鼠給予空瓶刺激誘發(fā)情緒應(yīng)激，刺激的給予是無(wú)規(guī)律的，每天1次或每天2次，此情緒應(yīng)激在連續(xù)的2周內(nèi)給予14次，每次10 min(刺激安排見表1)。所有動(dòng)物自由飲食。在空瓶刺激造模開始的第2周起每天早上8:00灌胃給藥，四逆散有效組分組動(dòng)物灌胃給予四逆散(450 mg/kg)，陽(yáng)性藥物對(duì)照組大鼠灌胃給予地西泮(1 mg/kg)[5]，空白對(duì)照組和模型組動(dòng)物灌胃給予等體積的生理鹽水(實(shí)驗(yàn)流程見圖1)。

表1 持續(xù)14天空瓶刺激安排表

注：N：正常飲水;ES：空瓶刺激

圖1 灌胃實(shí)驗(yàn)流程

1.4.2 行為學(xué)分析

利用動(dòng)物行為視頻分析系統(tǒng)記錄各組大鼠在給予刺激的10 min內(nèi)的行為表現(xiàn)，將空瓶刺激的10 min等分為10個(gè)時(shí)間段，在每個(gè)時(shí)間段內(nèi)記錄每只大鼠的攻擊行為(撕咬或攻擊空瓶和籠子)。行為出現(xiàn)即為1，否則為0。統(tǒng)計(jì)10 min內(nèi)行為的總分(總分在0～10分之間)。14個(gè)觀察日中每間隔3天的平均分用于統(tǒng)計(jì)分析[6]。

1.4.3 睡眠監(jiān)測(cè)

造模結(jié)束后將動(dòng)物放入實(shí)驗(yàn)動(dòng)物監(jiān)測(cè)系統(tǒng)的有機(jī)玻璃籠中適應(yīng)環(huán)境12 h，監(jiān)測(cè)24 h內(nèi)(早7:00～次日早7:00)動(dòng)物的睡眠情況。通過動(dòng)物撞擊紅外光束IR，判斷動(dòng)物活動(dòng)次數(shù)(通常計(jì)算機(jī)每10 s采集1次數(shù)據(jù)，每天有8 640個(gè)采集點(diǎn))，以活動(dòng)次數(shù)為0，在活動(dòng)閾值為30 s下，計(jì)算大鼠的24 h的睡眠時(shí)間[7]。監(jiān)測(cè)期間，大鼠僅早9:00～9:10和晚21:00～21:10給予飲水。

1.4.4 取材及檢測(cè)

睡眠監(jiān)測(cè)結(jié)束后，斷頭取腦，小心取出全部腦組織。用冰生理鹽水沖洗，濾紙拭干。將分離的腦組織用分析天平精確稱量，然后分別加9倍量的冰生理鹽水自動(dòng)勻漿后在4℃、12 000 r/min下離心10 min。取上清液，待測(cè)。按試劑盒操作步驟處理后測(cè)得相應(yīng)的吸光度(OD值)，再將OD值帶入線性回歸方程，計(jì)算各樣品中TNF-α的含量。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理方法

2 結(jié)果

2.1 四逆散有效組分對(duì)空瓶刺激誘導(dǎo)的慢性情緒應(yīng)激大鼠行為學(xué)的影響

表2 對(duì)慢性情緒應(yīng)激大鼠行為學(xué)的影響±s，n=6)

注：與空白組相比,##P<0.01;與模型組相比,*P<0.05

見表2。與空白對(duì)照組相比，模型組大鼠的攻擊行為增多，具有極顯著差異(P<0.01)；與模型組相比，四逆散有效組分組大鼠攻擊行為減少，具有顯著性差異(P<0.05)；地西泮組的攻擊行為也有下降的趨勢(shì)，但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.2 四逆散有效組分對(duì)慢性情緒應(yīng)激誘導(dǎo)的睡眠障礙大鼠睡眠時(shí)間的影響

見表3。與空白對(duì)照組相比，模型組大鼠全天睡眠時(shí)間顯著減少(P<0.05)，兩者間存在顯著差異。與空白對(duì)照組相比，模型組大鼠夜晚睡眠時(shí)間極顯著減少(P<0.01)，兩者間存在極顯著差異;與模型組相比，地西泮組大鼠全天的睡眠時(shí)間極顯著增多(P<0.01)，兩者間存在極顯著差異；與模型組相比，四逆散有效組分組大鼠全天睡眠時(shí)間顯著增多(P<0.05)，兩者間存在顯著差異；與模型組相比，地西泮組大鼠夜晚的睡眠時(shí)間顯著增多(P<0.05)，兩者間存在顯著差異；與模型組相比，四逆散有效組分組大鼠夜晚睡眠時(shí)間顯著增多(P<0.05)，兩者間存在顯著差異。

表3 對(duì)大鼠睡眠時(shí)間的影響±s，n=6)

注：與空白對(duì)照組相比,#P<0.05,##P<0.01;與模型組相比,*P<0.05,**P<0.01

2.3 四逆散有效組分對(duì)慢性情緒應(yīng)激誘導(dǎo)的睡眠障礙大鼠睡眠-覺醒節(jié)律的影響

見圖2。各組SD雄性大鼠的睡眠-覺醒呈現(xiàn)晝夜節(jié)律變化。表現(xiàn)為作為夜行動(dòng)物，大鼠白天較多處于睡眠狀態(tài)，夜晚較多處于覺醒狀態(tài)，且睡眠呈現(xiàn)片段化。

各組大鼠在早9:00的時(shí)間點(diǎn)睡眠時(shí)間減少，均出現(xiàn)高活動(dòng)狀態(tài)。與空白對(duì)照組相比，模型組大鼠早9:00給水后，恢復(fù)睡眠的較快，睡眠的片段化明顯；而地西泮和四逆散有效組分組進(jìn)入睡眠的時(shí)間較長(zhǎng)，睡眠的片段化不明顯，有整合的趨勢(shì)。

在晚21:00給水后，與空白對(duì)照組相比，模型組大鼠的活動(dòng)較多，睡眠較少，恢復(fù)睡眠的較慢，睡眠呈現(xiàn)片段化；而地西泮和四逆散有效組分組雖進(jìn)入睡眠的時(shí)間較長(zhǎng)，但睡眠的片段化有整合的趨勢(shì)。

圖2 對(duì)大鼠睡眠-覺醒節(jié)律的影響注:此圖分別顯示空白對(duì)照組(C)，模型組(ES)，陽(yáng)性藥物對(duì)照地西泮組(DZP)、四逆散有效組分組(SNS)造模后大鼠連續(xù)24h的睡眠-覺醒情況。圖中最上方的白和黑水平條表示光暗循環(huán)的持續(xù)時(shí)間，白色條部分為主觀白晝，時(shí)刻為7:00-19:00，黑色條為主觀夜晚，時(shí)刻為19:00-7:00；圖內(nèi)黑色部分表示大鼠處于睡眠狀態(tài)，白色部分表示大鼠處于覺醒狀態(tài)；圖上的2條標(biāo)記線分別表示給水的操作時(shí)間即早9:00和晚21:00

2.4 四逆散有效組分對(duì)慢性情緒應(yīng)激誘導(dǎo)的睡眠障礙大鼠全腦TNF-α含量的影響

表4 對(duì)大鼠全腦TNF-α含量的影響

注：與空白對(duì)照組相比,##P<0.01；與模型組相比,*P<0.05

見表4。與空白對(duì)照組相比，模型組TNF-α含量降低(P<0.01)，具有極顯著性差異；與模型組相比，地西泮組和四逆散有效組分組TNF-α含量升高(P<0.05)，具有顯著性差異。

3 討論

本實(shí)驗(yàn)基于實(shí)驗(yàn)室的前期研究成果，開展了空瓶刺激誘導(dǎo)慢性情緒應(yīng)激所致大鼠睡眠障礙及四逆散有效組分干預(yù)作用的相關(guān)研究工作。

其中誘發(fā)情緒應(yīng)激導(dǎo)致動(dòng)物睡眠障礙是實(shí)驗(yàn)的難點(diǎn)之一。“情緒是什么”這一問題是自1884年美國(guó)心理學(xué)奠基人威廉詹姆斯提出之后，至今仍沒有得出一個(gè)一致性的結(jié)論。目前學(xué)術(shù)界比較公認(rèn)的觀點(diǎn)為，情緒是人對(duì)客觀事物的態(tài)度體驗(yàn)及相應(yīng)的行為反應(yīng)[8]。情緒狀態(tài)包括四個(gè)方面：認(rèn)知、感受、生理變化和行為。在實(shí)驗(yàn)室中，情緒的測(cè)量主要依靠以下三種方法：自我報(bào)告、生理測(cè)量和行為反應(yīng)[9]。自我報(bào)告是指被試者對(duì)自我情緒感受的描述，也可以報(bào)告自己的認(rèn)知、行為以及情緒的其他方面；生理測(cè)量包括對(duì)血壓、心率、出汗以及其他隨情緒喚醒而波動(dòng)的變量的測(cè)量；行為反應(yīng)是指可觀測(cè)的行動(dòng)，包括面部和聲音表達(dá)、逃跑或攻擊。在研究非人類動(dòng)物或還不會(huì)說話的嬰兒的情緒時(shí)必須依賴行為觀察。攻擊作為行為失控的產(chǎn)物，與負(fù)性情緒關(guān)系密切[10]。越來(lái)越多的研究結(jié)果表明情緒和睡眠之間有著緊密的聯(lián)系，緊張、焦慮、恐懼等負(fù)性情緒會(huì)引起睡眠障礙，而睡眠障礙本身又可導(dǎo)致負(fù)性情緒的產(chǎn)生，周而復(fù)始形成惡性循環(huán)[11]。本研究利用空瓶刺激來(lái)誘發(fā)大鼠產(chǎn)生負(fù)性情緒，以攻擊行為作為大鼠表達(dá)負(fù)性情緒的指標(biāo)，以睡眠時(shí)間、睡眠-覺醒節(jié)律作為評(píng)價(jià)睡眠的標(biāo)準(zhǔn)，發(fā)現(xiàn)空瓶刺激可以引起模型組大鼠明顯的攻擊行為并減少大鼠的全天睡眠時(shí)間，睡眠的片段化明顯，證明負(fù)性情緒誘發(fā)睡眠障礙的模型復(fù)制成功。

四逆散具有透邪解郁，疏肝理氣之功，是臨床上治療情志紊亂導(dǎo)致失眠的首選方劑[12-13]。本研究表明四逆散有效組分具有一定的改善負(fù)性情緒的作用，可以使接受空瓶刺激的大鼠攻擊行為減少，并且效果優(yōu)于地西泮。且具有改善空瓶刺激誘導(dǎo)大鼠睡眠障礙的作用，主要表現(xiàn)為與模型組相比，四逆散有效組分可使接受空瓶刺激的大鼠全天睡眠時(shí)間增多，并且主要增多的是大鼠夜晚的睡眠時(shí)間。并初步探討了其作用機(jī)制，與大鼠全腦TNF-α的含量升高有關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)TNF-α是一種能促進(jìn)睡眠的前炎性細(xì)胞因子，靜脈或腦室注射外源性細(xì)胞因子TNF-α可誘發(fā)睡眠[14]，通過不同機(jī)制影響中樞神經(jīng)系統(tǒng)的睡眠過程。

另外，在通過對(duì)大鼠睡眠-覺醒節(jié)律的研究中，我們發(fā)現(xiàn)利用空瓶刺激誘導(dǎo)大鼠睡眠障礙的造模特點(diǎn)，是早9點(diǎn)或晚21點(diǎn)給水，大鼠對(duì)這種定時(shí)給水會(huì)有一種前瞻性，人為的改變大鼠的飲水規(guī)律，使大鼠的睡眠-覺醒節(jié)律發(fā)生變化，分別在早上9點(diǎn)和晚上21點(diǎn)出現(xiàn)了高活動(dòng)狀態(tài)，尤其是早上9點(diǎn)，模型組大鼠的睡眠時(shí)間顯著減少，在節(jié)律圖上出現(xiàn)了一個(gè)空白的區(qū)域。對(duì)于造成這種現(xiàn)象的原因，筆者考慮其一是由于空瓶刺激給大鼠造成了負(fù)性情緒，這種負(fù)性情緒影響了大鼠的睡眠；其二人為定時(shí)給水訓(xùn)練讓大鼠習(xí)慣早9點(diǎn)晚21點(diǎn)飲水，生理缺水促使大鼠找水，而使大鼠在給水的時(shí)間點(diǎn)出現(xiàn)活動(dòng)的高峰，睡眠時(shí)間減少，但是空瓶刺激并未使大鼠晝夜節(jié)律發(fā)生偏移，同時(shí)模型組大鼠睡眠的片段化明顯，而地西泮和四逆散有效組分組大鼠睡眠的片段化有整合的趨勢(shì)，有益于睡眠。

[1] Soldates CR，Allaert FA，Ohta T，et al．How do individuals sleep aroundthe world Results from a single—day survey in ten countries[J]．Sleep Medicine，2005，6(1)：5-13．

[2] 汪衛(wèi)東．失眠治療的本土化思考與創(chuàng)新技術(shù)[J]．世界睡眠醫(yī)學(xué)雜志，2014，1(5)：259-263,253．

[3] 張喬，金陽(yáng)，徐瑞鑫，等．四逆散有效組分改善睡眠作用與5-羥色胺能神經(jīng)系統(tǒng)相關(guān)性的實(shí)驗(yàn)研究[J]．中國(guó)醫(yī)藥導(dǎo)報(bào)，2012，9(14)：29-30+34．

[4] 于鑫．慢性情緒應(yīng)激所致大鼠睡眠剝奪模型復(fù)制及酸棗仁的干預(yù)作用研究[D]．哈爾濱：黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)，2012．

[5] 張雪．安神方抗焦慮作用的療效觀察及相關(guān)機(jī)制研究[D]．廣州：南方醫(yī)科大學(xué)，2012．

[6] 邵楓，林文娟，陳極寰．慢性情緒應(yīng)激對(duì)大鼠行為的影響及變化趨勢(shì)[J]．中國(guó)行為醫(yī)學(xué)科學(xué)，2003，12(1)：5-6，17．

[7] 卞宏生．晝夜節(jié)律對(duì)大鼠的睡眠模式和能量代謝的影響及褪黑素的干預(yù)作用研究[D]．哈爾濱：黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)，2015．

[8] 孟昭蘭.情緒心理學(xué)[M].北京:北京大學(xué)出版社，2005:1-33.

[9] 劉佳，陳克宏.情緒心理學(xué)[M].西安:西安交通大學(xué)出版社，2014:117-130.

[10] Shafritz K M， Collins S H，Blumberg H P. The interaction of emotional and cognitive neural systems in emotionally guided response inhibition[J]. Neuroimage，2006，31(1):468-475.

[11] 張曉陽(yáng),佘振壘,張改.馬云枝教授從肝體陰而用陽(yáng)治療失眠經(jīng)驗(yàn)[J].中醫(yī)藥學(xué)報(bào)，2016，44(1)：113-114.

[12] 李耀林.四逆散加減治療失眠43例[J].廣西中醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2005,8(2)：47.

[13] 高靜,龐敏.溫膽湯合四逆散治療肝郁脾虛型疲勞綜合征的臨床研究[J].中醫(yī)藥信息,2016,33(1):72-75.

[14] 吳興曲，楊來(lái)啟，王曉峰，等．睡眠剝奪對(duì)大鼠血清細(xì)胞因子的影響[J]．中國(guó)心理衛(wèi)生雜志，2002，16(6)：377-379．

Active Compounds of Sinisan for Improving Sleep Disorder ofRats with Chronic Emotional Stress

YE Xiao-nan, CHEN Guang, BIAN Hong-sheng, LI Ting-li

(HeilongjiangUniversityofChineseMedicine,Harbin150040,China)

Objective: To study the effect of Sinisan on sleep disorder of rats with chronic emotional stress induced by the empty bottle stimulation. Methods: Twenty- four male SD rats were randomly divided into four groups (six rats in each group), empty bottle stimulation group, blank control group, diazepam positive control group diazepam (1 mg/kg), Sinisan's active compounds treatment group (450 mg/kg). The chronic emotional stress rats (model) group was established by empty bottle stimulation for 2 weeks. On the 2nd week after empty bottle stimulation, the treatment groups were treated by the corresponding medicine once a day for 7 days by lavage after the model establishment. Observe the effect of Sinisan's active compounds on aggressive behaviors, sleep time, sleep-wake rhythm, and the whole brain TNF-α level. Results: Compared with those in the control group, the aggressive behaviors of rats in the model group was significantly increased (P<0.01), and it was significantly reduced in sleep time (P<0.05) and the whole brain TNF-α level (P<0.01). Compared with empty bottle stimulation group, Sinisan treatment group showed a significant reduction in aggressive behaviors (P<0.05), while the sleep time and the whole brain TNF-α level were significantly increased (P<0.05). Conclusion: The active compounds of Sinisan can improve sleep disorder by way of improving the negative emotion and one of its mechanisms is through TNF-α regulation for the brain.

Empty bottle stimulation; Stress; Negative emotion; Sleep disorder; Cytokines

2016-02-28

2016-10-31

國(guó)家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目(87214114);黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)博士創(chuàng)新基金(2015bs08)

葉曉楠(1990-),女,碩士研究生,主要從事天然藥物及復(fù)方生物活性的研究。

*通訊作者：李廷利(1957-)男,教授,博士研究生導(dǎo)師，主要從事天然藥物及復(fù)方生物活性的研究。

R285.5

A

1002-2392(2017)02-0006-04