養(yǎng)血行血方抗大鼠實驗性外傷性視神經(jīng)損傷的形態(tài)學(xué)觀察

肖家翔，文婷，姚瑩

養(yǎng)血行血方抗大鼠實驗性外傷性視神經(jīng)損傷的形態(tài)學(xué)觀察

肖家翔，文婷，姚瑩

目的觀察養(yǎng)血行血方對實驗性外傷性視神經(jīng)損傷的保護作用。方法將實驗SD大鼠60只隨機抽取15只為空白對照組，其余45只造模后隨機分為模型對照組、生理鹽水組及中藥治療組，每組15只?？瞻讓φ战M及模型對照組造模24小時后，生理鹽水組及中藥治療組（養(yǎng)血行血方）用藥4周后取左眼觀察視網(wǎng)膜視神經(jīng)的形態(tài)變化。結(jié)果大鼠造模后大量RGC腫脹變形，胞核腫脹明顯，神經(jīng)纖維層顯著水腫；生理鹽水組大量RGC胞體變形，呈空泡樣變性脫落，數(shù)量顯著減少，核皺縮，神經(jīng)纖維層顯著變??；而中藥治療組只有少量RGC輕度腫脹，少量變性，數(shù)量略減少，胞核可見，神經(jīng)纖維層輕度變薄。結(jié)論養(yǎng)血行血方能抗RGC損傷，降低其凋亡，促進視神經(jīng)纖維的修復(fù)而保護視神經(jīng)。

養(yǎng)血行血方；視神經(jīng)/外傷；疾病模型；動物

視神經(jīng)萎縮（optic atrophy，OA）是視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞（RGC）及其軸突、視神經(jīng)纖維由于各種原因受損害的結(jié)果，是眼科主要致盲性眼病之一[1-2]。本病以外傷性、炎癥性居多[3]。外傷性視神經(jīng)損傷導(dǎo)致的視神經(jīng)萎縮的研究既往主要集中在解除視神經(jīng)受壓方面，而“神經(jīng)保護”未得到足夠的重視。臨床上相當(dāng)多的患者在視神經(jīng)解壓后已存在視功能的損害，表明在視神經(jīng)受壓時需及時對視神經(jīng)進行保護性治療，故本研究采用臨床治療視神經(jīng)萎縮行之有效，以養(yǎng)血行血為法組方制成的雙芍護睛散用于實驗性外傷性視神經(jīng)損傷的治療，通過對視網(wǎng)膜視神經(jīng)的形態(tài)學(xué)觀察，以驗證養(yǎng)血行血方抗視神經(jīng)損傷的作用，為有效治療視神經(jīng)萎縮提供實驗數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

實驗動物：選用健康3月齡SD大鼠60只，雌雄不限，體重200-250 g，由貴州醫(yī)科大學(xué)動物實驗中心提供（合格證號：SCXK（黔）2013-017）。購進大鼠經(jīng)手持裂隙燈檢查雙眼角膜透明，虹膜血管清晰，瞳孔對光反射靈敏，晶狀體無混濁者納入實驗。將60只大鼠抽取15只為空白對照組，其余45只造模后隨機分為模型對照組、生理鹽水組及中藥治療組，每組15只。

藥物及儀器：雙芍護睛散（白芍、赤芍、茺蔚子、桑葚、澤蘭、牛膝、雞血藤、川芎等），按現(xiàn)代中藥制劑工藝制成散劑，由貴陽中醫(yī)學(xué)院中藥制劑室制備。儀器：瑞典產(chǎn)LKBⅢ型超薄切片機；日本產(chǎn)JEM-1200EX透射電鏡。

1.2 方法

參照李云琴[4]的方法進行造模：將需造模的45只大鼠于造模前3 d用0.25%氯霉素滴眼液滴眼，每日3次。造模時以3.5%水合氯醛右下腹腔注射麻醉，并以1%鹽酸丙美卡因?qū)Υ笫笞笱圻M行表面麻醉。麻醉后，將大鼠固定于動物手術(shù)臺上，沿左眼顳側(cè)角膜緣將球結(jié)膜環(huán)形剪開，分離球結(jié)膜和鞏膜，分離時避開外直肌，然后繼續(xù)向后分離，打開肌錐后將視神經(jīng)暴露出來，用視神經(jīng)鉗夾器夾于球后視神經(jīng)2 mm處，鉗夾力相等，30 s后松開鉗夾器，用8-0尼龍線縫合球結(jié)膜，造模完成后以慶大霉素做球結(jié)膜下注射，以0.3%妥布霉素眼膏涂于結(jié)膜囊內(nèi)，然后將大鼠保溫至蘇醒。觀察造模眼的瞳孔情況，以瞳孔直接對光反射消失，間接對光反射存在者作為造模成功的實驗動物納入實驗。

給藥方法：中藥治療組及生理鹽水組造模成功24 h后開始每日給藥，劑量參照徐叔云[5]關(guān)于人和動物間按體表面積折算的等效劑量比值表擬定，治療組以雙芍護睛散混懸液（每100 ml含散劑30 g）灌胃，劑量為5 ml/Kg·d，2次/d；生理鹽水組以等劑量生理鹽水灌胃，2次/d。2周為1個療程，停藥2 d后繼續(xù)第2個療程，共2個療程。

標(biāo)本制作及觀察：空白對照組及模型對照組在造模成功24 h后；中藥治療組以及生理鹽水組給藥2個療程后采用完全隨機法隨機抽取各組中的10只大鼠以10%水合氯醛過量腹腔注射處死，取左眼視網(wǎng)膜作光鏡觀察，重點觀察視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞及神經(jīng)纖維層的組織結(jié)構(gòu)。各組剩余5只大鼠同法處死后取左眼視網(wǎng)膜作透射電鏡觀察，主要觀察視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞的超微結(jié)構(gòu)。

光鏡標(biāo)本制作：摘取左眼眼球，置于4%多聚甲醛磷酸緩沖液（pH7.4）內(nèi)，4℃固定24 h，去除眼前節(jié)，梯度酒精脫水和二甲苯透明后，常規(guī)石蠟包埋。將包埋好的眼球標(biāo)本以平行于視盤矢狀位且以其為平面的視網(wǎng)膜進行連續(xù)切片，厚約5 μm，置于預(yù)先用多聚賴氨酸處理的載玻片上，60℃溫箱烤片過夜，HE染色。

電鏡標(biāo)本制作：摘取左眼眼球，在冰上沿角膜緣剪開眼球后，去除晶狀體、玻璃體，翻轉(zhuǎn)眼球套在臺柱上，用生理鹽水由切口邊緣向中心沖洗，視網(wǎng)膜即可完整脫落懸在視盤上，用眼科顯微鑷夾取視網(wǎng)膜，取包含視盤的一段約2 mm×2 mm的全層視網(wǎng)膜，立即放于2.5%的戊二醛溶液中固定1 h，磷酸鹽緩沖液沖洗2 h，用1%鋨酸固定2 h，系列乙醇脫水，Epon環(huán)氧樹脂812包埋，聚合35℃、40℃、55℃各12 h，半薄切片（1 μm）光學(xué)定位，以超薄切片機切片（70 nm），醋酸雙氧鈾枸櫞酸鉛染色。

2 結(jié)果

2.1 光鏡下各組大鼠視網(wǎng)膜的組織結(jié)構(gòu)

光鏡下空白對照組視網(wǎng)膜各層結(jié)構(gòu)形態(tài)及排列分布正常，界限清楚。RGC排列整齊，胞漿均質(zhì)豐富，神經(jīng)纖維層結(jié)構(gòu)清晰（圖1A）。模型對照組視網(wǎng)膜組織結(jié)構(gòu)可見，大量RGC腫脹，排列不規(guī)則，神經(jīng)纖維層顯著水腫（圖1B）。生理鹽水組視網(wǎng)膜組織結(jié)構(gòu)輕度異常，大量RGC明顯腫脹、空泡樣變性、脫落，排列不規(guī)則，數(shù)量顯著減少，神經(jīng)纖維層顯著變?。▓D1C）。中藥治療組視網(wǎng)膜組織結(jié)構(gòu)基本正常，可見少量RGC輕度腫脹，數(shù)量略減少，神經(jīng)纖維層輕度變?。▓D1D）。

2.2 電鏡下各組大鼠視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞的超微結(jié)構(gòu)

電鏡下空白對照組RGC胞體呈卵圓形，見較長的突起，輪廓清晰，核仁明顯，染色質(zhì)均，核膜清晰，胞漿均勻，可見散在粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，線粒體豐富（圖2A）。模型對照組RGC胞體變形，細胞核腫脹明顯，核周間隙增大，線粒體腫脹（圖2B）。生理鹽水組RGC胞體變形，核皺縮，染色質(zhì)邊聚，線粒體空泡化，微絲數(shù)量減少（圖2C）。中藥治療組可見少量RGC變性，細胞核可見，細胞染色質(zhì)輕度不均，線粒體輕度腫脹，微絲數(shù)量略減少（圖2D）。

圖1 視網(wǎng)膜光鏡照片（HE染色×400）。圖1A為空白對照組，視網(wǎng)膜RGC排列整齊，邊界清楚，神經(jīng)纖維層結(jié)構(gòu)清晰。圖1B為模型對照組，視網(wǎng)膜RGC腫脹，神經(jīng)纖維層顯著水腫。圖1C為生理鹽水組，視網(wǎng)膜大量RGC明顯腫脹，變性脫落，數(shù)量顯著減少，神經(jīng)纖維層顯著變薄。圖1D為中藥治療組，視網(wǎng)膜少量RGC輕度腫脹，數(shù)量略減少，神經(jīng)纖維層輕度變薄。

圖2 視網(wǎng)膜透射電鏡照片（醋酸雙氧鈾枸櫞酸鉛染色×20000）。圖2A為空白對照組，RGC胞體可見較長的突起，細胞核明顯，核膜清晰，染色均勻，線粒體豐富；圖2B為模型對照組，RGC胞體變形，細胞核腫脹明顯，線粒體腫脹；圖2C為生理鹽水組，RGC胞體變形，核皺縮，染色質(zhì)邊聚，線粒體空泡化；圖2D為中藥治療組，少量RGC變性，細胞核可見，線粒體輕度腫脹。

3 討論

視神經(jīng)萎縮不是一種單純的眼科疾病，是各種病因累及RGC及其軸突等損害后造成視神經(jīng)纖維變性喪失的最終結(jié)局。當(dāng)視神經(jīng)受損時，神經(jīng)纖維會出現(xiàn)部分變細或者全部變細的形態(tài)學(xué)改變。外傷性視神經(jīng)損傷引起視功能損害主要為視神經(jīng)血流灌注不良而缺血，導(dǎo)致RGC細胞凋亡，軸突數(shù)量減少，視神經(jīng)軸索運輸受阻，導(dǎo)致神經(jīng)纖維受損，甚至萎縮。

視神經(jīng)萎縮一度被認(rèn)為是視神經(jīng)嚴(yán)重損傷的最終結(jié)局，近年的研究改變了這種認(rèn)識，有研究顯示采用適當(dāng)而積極治療對視神經(jīng)萎縮的視功能可以起到一定的改善作用，并提出了殘余視覺激活理論[6]。對視神經(jīng)萎縮的治療，中西醫(yī)均進行了較為廣泛的探索。相關(guān)實驗證明[7]，受損的軸突在某些條件下，可得到一定程度的修復(fù)，從而促進神經(jīng)纖維的再生?？紫槊返萚8]通過實驗觀察了甲鈷胺治療視神經(jīng)鉗夾傷后SD大鼠，光鏡和電鏡下可見視神經(jīng)軸突和RGC異形改變明顯減少，能有效減少視神經(jīng)的退變及喪失。鄭幼平等[9]用銀杏內(nèi)脂B對視神經(jīng)鉗夾傷后大鼠進行腹腔注射，結(jié)果顯示其能有效改善視神經(jīng)鉗夾傷后RGC存活數(shù)量和存活時間，具有一定的視神經(jīng)保護作用。徐朝偉等[10]以明目復(fù)元湯聯(lián)合中藥穴位貼敷治療急性視神經(jīng)萎縮，結(jié)果顯示顯效及總有效率優(yōu)于口服肌苷片、腺苷鈷胺片及維生素B12者。

由于治療視神經(jīng)萎縮目前尚無確切有效療法，本研究以中醫(yī)理論為基礎(chǔ)，結(jié)合現(xiàn)代對外傷性視神經(jīng)損傷的認(rèn)識，即主要為視神經(jīng)血流灌注不良而缺血，導(dǎo)致視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞凋亡引發(fā)視神經(jīng)萎縮的發(fā)病機制，提出目絡(luò)瘀阻，目系（指視神經(jīng)及其周圍血管組織）失養(yǎng)的立法依據(jù)。針對外傷性視神經(jīng)損傷有“血虧滯”的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，采用治血一要養(yǎng)，二要行的指導(dǎo)原則。故本研究選用臨床有效治療視神經(jīng)萎縮，以養(yǎng)血行血為法組成的雙芍護睛方制成散劑，用于實驗性外傷性視神經(jīng)損傷模型，通過對視網(wǎng)膜神經(jīng)組織形態(tài)學(xué)觀察以證實養(yǎng)血行血方對外傷性視神經(jīng)損傷的作用。研究結(jié)果顯示，大鼠造模后大量RGC腫脹變形，胞核腫脹明顯，線粒體腫脹，神經(jīng)纖維層顯著水腫；應(yīng)用生理鹽水者大量RGC胞體變形，呈空泡樣變性脫落，數(shù)量顯著減少，核皺縮，神經(jīng)纖維層顯著變?。欢兴幹委熃M只有少量輕度腫脹，少量變性，數(shù)量略減少，細胞核可見，線粒體輕度腫脹，神經(jīng)纖維層輕度變薄。提示養(yǎng)血行血方有抗RGC損傷，降低其凋亡，促進視神經(jīng)纖維修復(fù)從而保護視神經(jīng)的作用。本研究的不足之處是只作了定性觀察，未作視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞數(shù)目等量化指標(biāo)方面的檢測，希望在以后的實驗中能同時進行定性和定量的觀察。

[1]張曉君.進一步提高視神經(jīng)萎縮的診斷水平[J].眼科，2011，20（6）：364-366.

[2]Dahlmann-Noor A H，Vijay S，Limb G A，et al.Strategies for optic nerve rescue and regeneration in glaucoma and other optic neuropathies[J].Drug discovery today，2010，15（7）：287-299.

[3]滕克禹，呂麗萍.視神經(jīng)萎縮病因分析[J].中國中醫(yī)眼科雜志，2013，23（6）：428-430.

[4]李云琴.大鼠外傷性視神經(jīng)損傷模型的建立[J].眼科新進展，2011，31（10）：934-936.

[5]徐叔云.藥理實驗方法學(xué)[M].北京：人民衛(wèi)生出版社，2010：302-303.

[6]魏世輝，張秀蘭.正確認(rèn)識視神經(jīng)萎縮的治療價值[J].中華眼科雜志，2012，48（12）：1057-1058.

[7]張世杰，王傳富，孫為榮，等.視神經(jīng)挫傷軸漿運輸和超微結(jié)構(gòu)變化的實驗研究[J].眼科研究，2003，21（6）：585-587.

[8]孔祥梅，孫興懷.甲鈷胺對鉗夾大鼠視神經(jīng)的保護作用[J].眼視光學(xué)雜志，2004，9（6）：157-164.

[9]鄭幼平，吳小桃，田原，等.銀杏內(nèi)酯B對視神經(jīng)鉗夾傷后大鼠視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞的保護作用[J].中國醫(yī)學(xué)創(chuàng)新，2015，7（12）：13-15.

[10]徐朝偉，潘小玲.明目復(fù)元湯聯(lián)合中藥穴位貼敷治療急性視神經(jīng)萎縮的臨床觀察[J].中國中醫(yī)急癥，2016，25（2）：309-311.

Morphological observation on experimental traumatic optic nerve injury managed by blood-nourishing and circulation-boosting formula

XIAO Jiaxiang，WEN Ting，YAO Ying.
Guizhou Provincial Hospital of Traditional Chinese Medicine，Guiyang 550001，China

OBJECTIVE To observe the morphological changes of protecting effect of blood-nourishing and circulation-boosting formula on experimental traumatic optic nerve injury.METHODS Sixty experimental SD rats were used in this study，and they were randomly and evenly divided into blank control group，model control group，saline group and TCM treatment group（15 cases，30 eyes in each group）.Observed the morphological change of optic nerve tissue in blank control group and the model control group 24 hours after modeling.While changes in the other two groups were observed 4 weeks after administration of saline and blood-nourishing and circulation-boosting formula respectively using left eye tissue.RESULTS After modeling，a large number of retinal ganglion cells（RGC）were in swollen，nuclei were swollen obviously and nerve fiber layers were in edema.In saline group，large scale of RGC deformed in vacuolar degeneration and decrease in the number，nuclear shrunk and nerve fiber layer thinned markedly；while in TCM treatment group，there was only a small amount of slight swelling RGC，mild degeneration，slight decrease in number and the nuclei were intact，nerve fiber layers were mildly thin.CONCLUSIONS The blood-nourishing and circulation-boosting formula prevented RGC from experimental injury，inhibited its apoptosis，and preserved optical nerve through promoting the retinal ganglion cells repairment.

blood-nourishing and circulation-boosting formula；optic nerve/injury；model of disease；animal

R285.5；R779.1

A

1002-4379（2017）01-0011-04

10.13444/j.cnki.zgzyykzz.2017.01.003

貴州省社發(fā)攻關(guān)項目（20123087）

貴陽中醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院，貴陽550001

肖家翔，E-mail：kate-show@163.com