不同途徑注射卵蛋白致大鼠過敏性休克的研究

解朝穩(wěn)，陳 陽

(皖南醫(yī)學院 法醫(yī)學院，安徽 蕪湖 241002)

·法醫(yī)學·

不同途徑注射卵蛋白致大鼠過敏性休克的研究

解朝穩(wěn)，陳 陽

(皖南醫(yī)學院 法醫(yī)學院，安徽 蕪湖 241002)

目的：建立不同途徑致大鼠過敏性休克動物模型，找到相對高效的造模方式。 方法：將健康SD大鼠隨機分為正常對照組和致敏1、2、3組,致敏組分別于第 1 天不同部位注射致敏原,第5天加強注射1次,飼養(yǎng)第18天不同部位注射致敏原激發(fā)過敏性休克。 結(jié)果：①致敏組大鼠均出現(xiàn)過敏性休克的典型體征，且尾靜脈注射致敏原激發(fā)過敏性休克致敏組的癥狀比較嚴重；②致敏組與正常對照組比較血清IgE、類糜蛋白酶含量升高，致敏1組血清含量高于其他致敏組，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。結(jié)論：本實驗成功地建立了大鼠過敏性休克動物模型，證明最后一次激發(fā)大鼠過敏性休克的注射途徑，應選擇尾靜脈比較理想。

過敏性休克；免疫球蛋白E；類糜蛋白酶

【DOI】10.3969/j.issn.1002-0217.2017.02.004

過敏性休克(anaphylactic shock)是IgE介導的最為危重的一種Ⅰ型超敏反應性疾病。致敏患者通常在接觸過敏原后數(shù)分鐘內(nèi)出現(xiàn)癥狀，可能引發(fā)突然死亡，其中由藥物、血清等致敏原引起的過敏性休克在臨床上較為常見[1-3]。 然而，通常過敏性休克的法醫(yī)學尸體檢驗所見僅為肺淤血或咽喉部水腫等非特異改變，一直是法醫(yī)學鑒定中的一大難題[4]。Yunginger等[5]認為血清中總IgE和特異性IgE水平可以作為過敏性休克死后較可靠的指標。血清中IgE含量過高，常提示Ⅰ型超敏反應或遺傳過敏體質(zhì)的存在,因此常根據(jù)血清中IgE水平診斷變態(tài)反應疾病[6-7]。肥大細胞類糜蛋白酶是其分泌顆粒中的絲氨酸蛋白酶，平時僅有少量分泌到血液及體液中，但當肥大細胞被激活、脫顆粒時則大量釋放入血液或體液中，導致血液或體液中類糜蛋白酶的含量急劇增高。作為肥大細胞的特異性標記物，肥大細胞類糜蛋白酶已成為學者研究過敏性疾病的敏感指標之一[8]。本文擬建立不同途徑注射卵蛋白致大鼠過敏性休克的動物模型，并檢測IgE、類糜蛋白酶含量作為造模依據(jù),從而找到比較高效的造模途徑，這樣在此基礎上可以使動物過敏性休克的實驗數(shù)據(jù)更加準確，為法醫(yī)學鑒定提供參考。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 20只SD雄性大鼠，清潔級，體質(zhì)量(190± 10)g,蘇州工業(yè)園區(qū)愛爾麥特科技有限公司提供，批號為SCXK(蘇)2014-0007;實驗前適應性喂養(yǎng)1周，而后定時定量喂養(yǎng)。

1.2 實驗器材與試劑 常規(guī)手術(shù)器械和包埋、切片及HE染色所需材料；雞卵蛋白 OVA ( Grade Ⅱ )、氟氏完全佐劑(美國Sigma 公司)，大鼠 IgE、類糜蛋白酶ELISA 試劑盒 48孔(蘇州卡爾文生物科技有限公司),酶標儀。

1.3 動物分組及模型建立 將20只SD雄性大鼠隨機分為四組(每組5只)：正常對照組及致敏1、2、3組。致敏組大鼠分別于 第1、5天注射20 mg卵蛋白(溶于 0.5 mL 生理鹽水，與佐劑等體積混合)，自首次給藥后第 18 天，不同部位注射100 mg卵蛋白(溶于 1 mL 生理鹽水，不含佐劑)，激發(fā)大鼠過敏性休克[11-12]，觀察大鼠行為，記錄休克反應；正常對照組給予相同劑量的生理鹽水替代致敏原。具體方法見表1。

表1 不同途徑注射方法

組別第1、5天第18天正常對照組腹腔注射尾靜脈注射致敏1組腹腔注射尾靜脈注射致敏2組腹腔注射后肢皮下注射致敏3組后肢皮下注射腹腔注射

1.4 ELISA 法檢測 IgE、類糜蛋白酶水平 大鼠過敏性休克后觀察2 h頸椎脫臼處死，立即取頸動脈血液，取離心后上清液，分裝 4℃ 冷藏。第2天采用ELISA試劑盒檢測樣本中 IgE、類糜蛋白酶的水平，方法按說明書進行。 最后15 min 內(nèi)在波長 450 nm 的酶標儀上測定各孔的光密度值( OD 值)，以此計算樣本濃度，計算的樣本濃度X5即為樣本實際濃度(按說明書規(guī)定)。

1.5 病理組織學檢查 取大鼠肺組織，用10%甲醛固定兩天，對其進行石蠟包埋連續(xù)切片，HE染色，光鏡下觀察變化。

2 結(jié)果

2.1 過敏性休克動物表現(xiàn) 過敏性休克大鼠致敏原激發(fā)后，活動減少，搔抓腹部，呼吸困難，趴伏，致敏2組和3組大鼠輕度抽搐，約10 s,致敏1組抽搐時間較長，約20 s,觀察2 h 內(nèi)未死亡(致敏大鼠過敏性休克率為 100%);對照組無異常表現(xiàn)。

2.2 大鼠過敏性休克血清中IgE、類糜蛋白酶水平 不同組的血清中IgE、類糜蛋白酶水平見表2，差異有統(tǒng)計學意義(P<0．05)。致敏1組與正常對照組比較IgE升高、類糜蛋白酶含量升高(P<0．01)，致敏2、3組與正常對照組比較IgE、類糜蛋白酶含量升高(P<0．05)；尾靜脈注射致敏原激發(fā)過敏性休克致敏組中的血清IgE、類糜蛋白酶含量高于其他致敏組，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；所測值見表2。

組別IgE類糜蛋白酶正常對照組3.1716±0.67741.9528±0.2099致敏1組6.0314±1.0068*5.2299±0.4772*致敏2組4.4140±0.5609*#4.0674±0.2703*#致敏3組4.4197±0.5185*#4.1569±0.2823*#F值13.37088.642P值<0.01<0.01

*與正常對照組比較，P<0.05；#與致敏1組比較，P<0.05。

2.3 各組肺組織HE鏡下改變 對照組(圖1a)肺泡無異常；解剖見致敏組死亡大鼠肺組織水腫、淤血，對照組無異常；HE鏡下見致敏1組(圖1b)肺泡淤血較嚴重，中度淤血；致敏2、3組(圖1c、d)肺泡淤血較輕，輕度淤血。

a:正常對照組;b:致敏1組;c:致敏2組;d:致敏3組。

圖1 肺組織鏡下改變 (HE×400)

3 討論

過敏性休克死亡在法醫(yī)學鑒定中比較常見，但由于缺乏特異的病理學改變[9]，為鑒定帶來一定的困難。目前的鑒定實踐中，診斷過敏性休克通常在排除暴力性死亡、中毒及其他自然性疾病的基礎上，結(jié)合過敏原接觸史、解剖發(fā)現(xiàn)、死后血清IgE水平等進行綜合判斷[10]。一直以來，尋找敏感可信的生化診斷指標成為臨床醫(yī)學和法醫(yī)學領域努力探索的方向。所以過敏性休克動物模型的建立可為尋找敏感可信的診斷指標提供基礎。本實驗通過借鑒[11-12]的造模方法及劑量，采用不同途徑注射卵蛋白致大鼠過敏性休克，并用血清IgE、類糜蛋白酶水平進行判斷，希望找到比較高效的造模途徑。實驗證實首次注射及加強注射致敏原選擇腹腔或皮下對造模是否成功沒有多大影響，但最后一次激發(fā)過敏性休克選擇靜脈比較合適，例如大鼠尾靜脈，這樣可以提高造模成功率。雖然最后一次激發(fā)過敏性休克選擇皮下或腹腔也能造模成功，其血清IgE、類糜蛋白酶水平與正常對照組差異有統(tǒng)計學意義；但是尾靜脈注射時，其過敏性休克癥狀更嚴重，比較其血清IgE、類糜蛋白酶水平也較其他兩組高，具有統(tǒng)計學意義。

綜上所述，過敏性休克動物造模應選擇最后一次靜脈注射致敏原的注射途徑，這樣比較理想，例如尾靜脈；并且其血液生化指標 IgE、類糜蛋白酶可以作為診斷造模成功率的依據(jù)，但應及時取血冷藏保存，防止樣本溶血，并及時提取檢材。

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Development of anaphylactic shock rat models induced by ovalbumin injected via different routes

XIE Chaowen,CHEN Yang

School of Forensic Medicine,Wannan Medical College,Wuhu 241002,China

Objective：To verify a relatively efficient modeling technique for anaphylactic shock in rats induced by different routes of administration of ovalbumin.Methods:Healthy SD rats were randomly divided into normal control group and sensitized group 1,2 and 3.Rats in the three sensitized groups were sensitized by injection of the allergen via different routes in the day 1,and additional dose in the day 5.Then the rats were fed for 18 days,and challenged for the anaphylactic shock in the 18th day by ovalbumin administration in different routes.Results：①Rats in the sensitized group showed typical signs of anaphylactic shock in general,yet the symptoms appeared severer in rats sensitized by injection of the allergen via tail vein;②Rats in the sensitized group had higher levels of IgE and chymase than the control group,and higher serum IgE and chymase levels were observed in sensitized group 1(P<0.05).Conclusion:Anaphylactic shock model was successfully developed in rats.However,the trials indicate that injection of the allergen via tail vein will result in optimal modeling in such animals.

anaphylactic shock;immunoglobulin E;chymase

1002-0217(2017)02-0114-03

2016-08-26

解朝穩(wěn)(1987-)，男，2014級碩士研究生，(電話)18895327802，(電子信箱)906572990@qq.com； 陳 陽，男，副教授，碩士生導師，(電子信箱)chy5454@163.com，通信作者。

R 593.1;R 363

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