生物芯片技術(shù)在肺癌血清標(biāo)志物檢測中運用的性能評價

楊昊　熊娟　　鐘平

[摘要] 目的 分析評價生物芯片技術(shù)在肺癌血清腫瘤標(biāo)記物癌胚抗原（carcinoembryonic antigen，CEA）、細(xì)胞角蛋白19片段（cytokeratins 19，CYFRA211）、神經(jīng)元特異性烯醇化酶（neuron specific enolase，NSE）、鱗狀上皮細(xì)胞癌抗原（squmaous cell carcinoma antigen，Scc）檢測中運用的性能。 方法 通過精密度試驗、線性試驗和比對試驗進(jìn)行生物芯片技術(shù)在CEA、Scc、CYFRA211和NSE檢測中的性能評價，運用SPSS 19.0統(tǒng)計學(xué)軟件進(jìn)行相關(guān)數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析。 結(jié)果 精密度試驗顯示4個檢測項目CV值均低于廠家設(shè)定值；線性試驗顯示4個項目R2均>0.95，線性范圍符合實驗要求；比對試驗兩套檢測系統(tǒng)在進(jìn)行多元回歸分析后，R2均為0.314，擬合優(yōu)度相同，可視為檢測結(jié)果具有較高一致性。 結(jié)論 將生物芯片技術(shù)融合運用到化學(xué)發(fā)光免疫分析法中，對肺癌腫瘤血清標(biāo)志物檢測性能評價較好，能滿足臨床需求。

[關(guān)鍵詞] 生物芯片；肺癌；血清標(biāo)志物；性能評價

[中圖分類號] R734.2 [文獻(xiàn)標(biāo)識碼] B [文章編號] 1673-9701（2017）05-0098-03

生物芯片技術(shù)是90年代中期以來影響最深遠(yuǎn)的重大科技進(jìn)展之一，是融微電子學(xué)、生物學(xué)、物理學(xué)、化學(xué)、計算機(jī)科學(xué)為一體的高度交叉新技術(shù)，具有重大的基礎(chǔ)研究價值。江蘇三聯(lián)SLXP-001全自動生物芯片閱讀儀是基于微陣列化學(xué)發(fā)光免疫分析檢測技術(shù)的全自動生物芯片分析系統(tǒng)，可用于腫瘤標(biāo)志物的檢測。本實驗根據(jù)《醫(yī)療機(jī)構(gòu)臨床實驗室管理辦法》和《醫(yī)學(xué)實驗室質(zhì)量和能力認(rèn)可準(zhǔn)則》（ISO15189：2012）的要求，結(jié)合科室實際工作，參照美國國家臨床實驗室標(biāo)準(zhǔn)化研究所（CLSI）文件指南[1-3]，通過精密度試驗、線性試驗和比對試驗進(jìn)行生物芯片技術(shù)在肺癌血清標(biāo)志物CEA、Scc、CYFRA211和NSE檢測中的性能評價，現(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

所有檢測標(biāo)本均來自2016年8～10月漢川市人民醫(yī)院臨床新鮮血清樣本，無明顯溶血、黃疸及脂血。

1.2 儀器與試劑

江蘇三聯(lián)SLXP-001全自動生物芯片閱讀儀，德國西門子Centaur XP全自動化學(xué)發(fā)光免疫分析儀，SLXP-001生物芯片批號：F160526E3，標(biāo)準(zhǔn)品和質(zhì)控品批號：F160912K18；Centaur XP配套肺癌腫瘤血清標(biāo)志物檢測試劑：CEA（試劑批號130201003M，標(biāo)準(zhǔn)品和質(zhì)控品批號02516082502），Scc（試劑批號130201018M，標(biāo)準(zhǔn)品和質(zhì)控品批號06316092001），CYFRA211（試劑批號130201013M，標(biāo)準(zhǔn)品和質(zhì)控品批號06216093001），NSE（試劑批號130201016M，標(biāo)準(zhǔn)品和質(zhì)控品批號02316072502）。試劑均在有效期內(nèi)使用。

1.3方法

實驗前對儀器進(jìn)行每日保養(yǎng)和質(zhì)控檢測并在控，嚴(yán)格按照儀器和試劑說明書進(jìn)行實驗操作。

1.3.1 精密度試驗 分別選取CEA、Scc、CYFRA211和NSE的高、中、低三個濃度水平新鮮血清樣本，每個濃度水平分別在SLXP-001上重復(fù)測定20次，計算其變異系數(shù)CV值；用高、中、低三個濃度水平質(zhì)控品（廠家配套提供）連續(xù)測定20 d，計算其變異系數(shù)CV值，要求CV值低于廠家產(chǎn)品說明書。

1.3.2 線性試驗 分別選擇CEA、Scc、CYFRA211和NSE高濃度水平的臨床血清樣本，用SLXP-001專用稀釋試劑做倍比稀釋（1、1/2、1/4、1/8、1/16），配成5個系列濃度樣本，用稀釋試劑做空白樣本，每個樣本測定3次并進(jìn)行均值計算；對樣本的理論和檢測濃度行線性回歸并進(jìn)行線性回歸分析，計算相關(guān)系數(shù)R值，要求相關(guān)系數(shù)R2≥0.95。

1.3.3 比對試驗 三聯(lián)生物芯片閱讀儀SLXP-001與西門子全自動化學(xué)發(fā)光免疫分析儀CENTAUR XP均應(yīng)用雙抗體夾心法原理定量檢測人血清中的腫瘤標(biāo)志物濃度，兩臺儀器檢驗原理相同，但檢驗方法及實驗步驟不同，符合對兩套檢測系統(tǒng)進(jìn)行臨床比對的要求。分別選取20例臨床確診肺癌患者血清樣本和20例非癌癥患者血清樣本（樣本濃度覆蓋不同水平），同時在兩臺儀器上測定CEA、Scc、CYFRA211和NSE4個項目，對兩組檢測結(jié)果進(jìn)行回歸分析，計算相關(guān)系數(shù)R值，比較R2擬合優(yōu)度。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理

運用SPSS 19.0統(tǒng)計學(xué)軟件進(jìn)行相關(guān)數(shù)據(jù)處理及統(tǒng)計分析，計數(shù)資料以例數(shù)或百分率表示，組間比較采用配對χ2檢驗，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。精密度試驗采用線性回歸分析；比對試驗采用多元線性回歸分析并計算其回歸方程。

2結(jié)果

2.1精密度驗證結(jié)果

CEA、Scc、CYFRA211和NSE的高、中、低三個濃度水平批內(nèi)和批間不精密度CV均低于廠家說明書聲明的CV值（CEA：CV高值<11.74%，低值<7.15%；Scc：CV高值<8.55%，低值<7.62%；CYFRA211：CV高值<7.36%，低值<6.47%；NSE：CV高值<6.93%，低值<6.54%），見表1。

2.2 線性范圍驗證結(jié)果

CEA線性實驗相關(guān)方程Y=1.035X-0.700，R2=0.998，測量線性（1.68～288.60）ng/mL，試劑廠家指定線性（1～300）ng/mL；Scc線性實驗相關(guān)方程Y=0.979X+0.168，R2=0.996，測量線性（0.88～92.77）ng/mL，試劑廠家指定線性（0.5～100）ng/mL；CYFRA211線性實驗相關(guān)方程Y=0.998X-0.005，R2=0.999，測量線性（0.51～186.70）ng/mL，試劑廠家指定線性（0.65～200）ng/mL；NSE線性實驗相關(guān)方程Y=0.994X+0.240，R2=0.998，測量線性（2.28～292.40）ng/mL，試劑廠家指定線性（2.6～300）ng/mL。

2.3比對試驗結(jié)果

SLXP-001進(jìn)行多元線性回歸，得到回歸方程Y=1.672-0.003X1-0.008X2-0.006X3+0.003X4（其中Y為樣本類型，Y=1時表示為肺癌患者樣本，Y=2時表示非肺癌患者樣本，X1表示CEA值，X2表示Scc值，X3表示CYFRA211值，X4表示NSE值），Anova模型計算Sig值為0.009，Sig<0.05，證明所建立的回歸方程有效，計算R值為0.560，R2為0.314；西門子CENTAUR XP進(jìn)行多元線性回歸，得到回歸方程Y=1.678-0.003X1-0.008X2-0.005X3+0.001X4，Anova模型計算Sig值為0.009，Sig<0.05，證明所建立的回歸方程有效，計算R值為0.560，R2為0.314。從R2擬合優(yōu)度來看，兩個模型的擬合優(yōu)度相同，均為0.314，從結(jié)果來看，兩個模型中最先進(jìn)入“線性回歸模型”的均是NSE值，見表2、3。

3討論

SLXP-001型生物芯片閱讀儀將生物芯片技術(shù)應(yīng)用于化學(xué)發(fā)光免疫分析中，對血清標(biāo)記物進(jìn)行微陣列化學(xué)發(fā)光免疫分析，其主要優(yōu)勢是利用生物芯片技術(shù)避免常規(guī)儀器樣本轉(zhuǎn)移操作中的樣本交叉污染，從而使儀器的準(zhǔn)確率和重現(xiàn)性得到提高，進(jìn)一步確保分析結(jié)果的準(zhǔn)確性。SLXP-001利用蛋白芯片表面包被的抗體與患者血清中的抗原進(jìn)行免疫反應(yīng)，通過高靈敏制冷CCD檢測蛋白芯片樣本點的發(fā)光亮度來量化測定腫瘤血清標(biāo)記物，其方法原理在該領(lǐng)域?qū)儆谙冗M(jìn)，但廠家的性能參數(shù)是在其合適的環(huán)境下測定得到的與本實驗室實際的外部條件存在差異，在使用儀器日常檢測前必須對儀器的性能進(jìn)行驗證[4-9]。

對SLXP-001芯片閱讀儀進(jìn)行精密度驗證，實驗結(jié)果顯示CEA、Scc、CYFRA211和NSE的高、中、低三個濃度水平批內(nèi)和批間不精密度CV均低于廠家說明書聲明的CV值（CEA：CV高值<11.74%，低值<7.15%；Scc：CV高值<8.55%，低值<7.62%；CYFRA211：CV高值<7.36%，低值<6.47%；NSE：CV高值<6.93%，低值<6.54%），說明儀器的重復(fù)性較好，測定結(jié)果穩(wěn)定。本研究對其批內(nèi)和批間的CV值進(jìn)行比較和相關(guān)性分析，CEA、Scc、CYFRA211和NSE的相關(guān)系數(shù)分別為0.998、0.996、0.999、0.998，R2均>0.95，說明SLXP-001無論在批內(nèi)還是批間，其檢測結(jié)果均具有很好的重復(fù)性，批內(nèi)和批間因素不會影響其穩(wěn)定性。

方法學(xué)比對一致是實驗室質(zhì)量控制管理的重要依據(jù)，對SLXP-001和CENTAUR XP兩套檢測系統(tǒng)比對實驗測定結(jié)果分別進(jìn)行多元線性回歸分析，結(jié)果可見其R2擬合優(yōu)度相同，均為0.314，說明從方法學(xué)一致的角度來講，兩套檢測系統(tǒng)的測定結(jié)果具有高度的一致性。CENTAUR XP肺腫瘤標(biāo)記物CEA、Scc、CYFRA211和NSE在我實驗室2016年湖北省臨檢中心室間質(zhì)評PT成績?yōu)?00，所以，我們認(rèn)為SLXP-001的檢測結(jié)果具有同樣較高的準(zhǔn)確性。對CEA、Scc、CYFRA211和NSE分別進(jìn)行Pearson相關(guān)性統(tǒng)計，其相關(guān)系數(shù)分別為0.914、0.802、0.903、0.927（P均<0.05），可見Scc的測定結(jié)果較CEA、CYFRA211、NSE在兩套檢測系統(tǒng)上一致性略低，這可能與Scc在血清中的半衰期極短、穩(wěn)定性較差有關(guān)。Scc的半衰期長短目前尚無有關(guān)的確切報道，Laure Ritti等[10]的研究報告中提到Scc的半衰期約為20 min，這顯然與其他三種血清標(biāo)記物相比其半衰期要短很多，另外溫度、pH值、樣本血脂含量等理化因素均會對其結(jié)果造成不同程度影響。SLXP-001線性范圍驗證結(jié)果與廠商指定線性相符，而本次檢測標(biāo)本的濃度，均在其有效檢測濃度范圍以內(nèi)。

目前，化學(xué)發(fā)光免疫分析方法已成為國內(nèi)外廣泛認(rèn)可并使用的檢測腫瘤血清標(biāo)記物的方法[11-13]，在科學(xué)技術(shù)不斷發(fā)展以及強(qiáng)大的市場需求驅(qū)動下，各大醫(yī)療研究機(jī)構(gòu)及廠商均不斷將新的技術(shù)融合到化學(xué)發(fā)光技術(shù)中，生物芯片技術(shù)的引入，對化學(xué)發(fā)光技術(shù)的發(fā)展也開辟了新視野，其微量、低成本、少污染的優(yōu)勢也在技術(shù)發(fā)展中得到了很好的體現(xiàn)。本實驗通過多方面的數(shù)據(jù)分析，對生物芯片技術(shù)在腫瘤血清標(biāo)記物檢測中的精密度、線性、重復(fù)性、準(zhǔn)確性進(jìn)行驗證，確定其設(shè)計滿足臨床需求，但其臨床解釋也應(yīng)充分考慮不同生產(chǎn)廠家、不同檢測系統(tǒng)對結(jié)果造成的偏差，實驗室應(yīng)有專門的技術(shù)人員對不同檢測系統(tǒng)間的結(jié)果進(jìn)行評價分析，對偏差超出允許誤差的結(jié)果予以校正，以保證臨床結(jié)果的準(zhǔn)確性和可比性，滿足臨床需求[14，15]。

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（收稿日期：2016-12-23）