MRP—1、MDR1、GST—π mRNA在CD133+腫瘤干細(xì)胞中的表達(dá)分析

陳獻(xiàn)東　　陳茂華　　巴華君　　林群　　戴君俠

[摘要] 目的 分離鑒定CD133+腫瘤干細(xì)胞，初步分析MRP-1、MDR1、GST-π在CD133+膠質(zhì)瘤干細(xì)胞多藥耐藥性中的作用。 方法 采用膠質(zhì)瘤U251細(xì)胞系，磁珠分離、培養(yǎng)CD133+膠質(zhì)瘤干細(xì)胞，RT-PCR技術(shù)分析MRP-1、MDR1、GST-π在CD133+膠質(zhì)瘤干細(xì)胞中的表達(dá)。 結(jié)果 培養(yǎng)的膠質(zhì)母細(xì)胞瘤干細(xì)胞表達(dá)干細(xì)胞標(biāo)記物Nestin，分化后細(xì)胞表達(dá)GFAP、β-tubulin；MRP-1、MDR1、GST-π在CD133+膠質(zhì)瘤干細(xì)胞中呈高表達(dá)，與CD133-膠質(zhì)瘤干細(xì)胞比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。 結(jié)論 培養(yǎng)、鑒定膠質(zhì)母細(xì)胞瘤腫瘤干細(xì)胞，MRP-1、MDR1、GST-π在CD133+膠質(zhì)瘤干細(xì)胞中呈高表達(dá)，為下一步研究奠定基礎(chǔ)。

[關(guān)鍵詞] 膠質(zhì)母細(xì)胞瘤；腫瘤干細(xì)胞；CD133；耐藥

[中圖分類(lèi)號(hào)] R739.4 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A [文章編號(hào)] 1673-9701（2017）05-0012-03

腦膠質(zhì)瘤是常見(jiàn)的原發(fā)中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤，約占中樞神經(jīng)系統(tǒng)惡性腫瘤的78%，占成人中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤的50%，是惡性程度最高也是最具侵襲性的腫瘤之一[1，2]。目前腦膠質(zhì)瘤治療主要以最大限度切除實(shí)體腫瘤，術(shù)后輔以替莫唑胺化療。化療是目前治療膠質(zhì)瘤及改善預(yù)后的重要手段，但目前的治療效果仍達(dá)不到滿意，其中主要原因是腫瘤細(xì)胞的耐藥性[3]。CD133是腫瘤干細(xì)胞和神經(jīng)干細(xì)胞的特異性標(biāo)志物，相關(guān)研究顯示CD133+細(xì)胞具有較強(qiáng)的致瘤能力，CD133+細(xì)胞的多藥耐藥性明顯增強(qiáng)[4]。而MRP-1、MDR1在異質(zhì)性膠質(zhì)瘤的腦腫瘤干細(xì)胞中的高表達(dá)是臨床內(nèi)在性耐藥和個(gè)體耐藥的主要原因之一[5]。而GST-π作為腫瘤轉(zhuǎn)化的標(biāo)志物之一，能夠催化谷胱甘肽與親電性的抗癌藥物結(jié)合，通過(guò)活性將抗癌藥物排出細(xì)胞，增強(qiáng)腫瘤的耐藥性[6]。本研究初步分析MRP-1、MDR1及GST-π在CD133+腫瘤干細(xì)胞中的表達(dá)，為進(jìn)一步研究確切的耐藥機(jī)制及逆轉(zhuǎn)耐藥提供前期基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1材料與試劑

U251細(xì)胞系（廣州賽業(yè)生物科技公司，貨號(hào)：HCGUI-30001），DMEM/F12培養(yǎng)基、胎牛血清（FBS）購(gòu)自Hyclone公司，胰蛋白酶（Gibco公司）、免疫磁珠（CD133+）細(xì)胞分選試劑盒、免疫磁珠分選儀購(gòu)自Miltenyi Biotec公司，CO2恒溫培養(yǎng)箱、-80℃超低溫冰箱。

1.2 U251細(xì)胞復(fù)蘇及培養(yǎng)

將保存人腦 U251 細(xì)胞的凍存管從-80℃冰箱中取出，立即置于37℃恒溫水浴中，輕輕搖動(dòng)凍存管使管內(nèi)凍存液快速融化；將含U251細(xì)胞的凍存液移入15 mL無(wú)菌離心管中，加入約 5 mL含血清培養(yǎng)基，1000 r/min 離心5 min，棄掉上清液；加入約 3 mL含血清培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，無(wú)菌透氣培養(yǎng)瓶中，置于37℃、體積分?jǐn)?shù) 5% CO2飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；觀察細(xì)胞的生長(zhǎng)情況，每3日更換一次培養(yǎng)液；將U251細(xì)胞在含10%的胎牛血清、青霉素 100 U/mL和鏈霉素100 μg/mL的DMEM 完全培養(yǎng)基中進(jìn)行單層培養(yǎng)，置于37℃、5% CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中連續(xù)培養(yǎng)傳代。隔日換液1次，每次添加 4 mL培養(yǎng)基，每隔3 d進(jìn)行細(xì)胞傳代。

1.3 CD133+膠質(zhì)瘤干細(xì)胞分選

收集培養(yǎng)基中連續(xù)培養(yǎng)的球樣U251細(xì)胞，胰酶消化、離心后制備單細(xì)胞懸液，200 μm濾網(wǎng)過(guò)濾并計(jì)數(shù)。參照免疫磁珠（CD133+）細(xì)胞分選試劑盒、免疫磁珠分選儀操作說(shuō)明進(jìn)行。

1.4 CD133+膠質(zhì)瘤干細(xì)胞培養(yǎng)及鑒定

將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的U251細(xì)胞用0.25%胰蛋白酶消化、離心后吹打成單細(xì)胞懸液，分別用無(wú)菌PBS液和DMEM/F12重懸細(xì)胞漂洗1遍，接種到含有EGF （20 ng/mL）、bFGF（20 ng/mL）、LIF（10 ng/mL）、B27（1×）的 DMEM/F12無(wú)血清培養(yǎng)基，置于37℃、5% CO2、飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。細(xì)胞鑒定：取膠質(zhì)瘤干細(xì)胞植入包被有多聚賴氨酸的玻片上，晾干，用PBS沖洗除去殘留培養(yǎng)基；經(jīng)4%多聚甲醛固定，5%山羊血清封閉；分別加入Nestin、β-tubulin 和 GFAP一抗，4℃過(guò)夜，加入FITC標(biāo)記二抗，熒光顯微鏡鏡檢。

1.5 RT-PCR檢測(cè)MRP-1、MDR1、GST-π mRNA的表達(dá)分析

采用Primer Premier v5軟件設(shè)計(jì)MRP-1、MDR1、GST-π引物序列。MRP1 正義鏈：5'-GCAGGGCTACTTCTACACCG-3'，反義鏈：5'-TCATCGCCATCACAGCATTG-3'；MDR1：正義鏈：5'-CCCATCATTGCAATAGCAGG-3'，反義鏈：5'-GTTCAAACTTCTGCTCCTGA-3'；GST-π：正義鏈：5'-CCAATACCATCCTGCGTCAC-3'，反義鏈：5'-TCACTGTTTCCCGTTGCCCAT-3'。后收集細(xì)胞，參照相應(yīng)試劑盒說(shuō)明書(shū)提取總RNA，逆轉(zhuǎn)錄提取cDNA，配制PCR 反應(yīng)體系（20 μL）進(jìn)行PCR反應(yīng)。以相同來(lái)源的β-actin為內(nèi)部參照，相對(duì)基因表達(dá)量=2-△△CT（△Ct=Ct 靶基因-Ct β-actin，△△Ct=△Ct試驗(yàn)組-△Ct 對(duì)照組），每個(gè)檢測(cè)重復(fù)3次，計(jì)算 MRP-1、MDR1、GST-π mRNA表達(dá)量。

1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

應(yīng)用SPSS19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料以（x±s）表示，多組樣本均數(shù)比較先進(jìn)行正態(tài)分布及方差齊性檢驗(yàn)，呈正態(tài)分布及方差齊性組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，呈正態(tài)分布但方差不齊組間比較采用近似t檢驗(yàn)，P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1膠質(zhì)瘤干細(xì)胞的鑒定

膠質(zhì)瘤U251干細(xì)胞經(jīng)過(guò)Nestin、β-tubulin和GFAP熒光染色進(jìn)行鑒定，結(jié)果U251干細(xì)胞球顯示綠色熒光，呈強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)。經(jīng)過(guò)行GFAP和β-tubulin檢測(cè)結(jié)果膠質(zhì)瘤干細(xì)胞球未顯示綠色熒光，呈陰性表達(dá)，經(jīng)過(guò)培養(yǎng)基中誘導(dǎo)分化7 d后，膠質(zhì)瘤U251干細(xì)胞GFAP、β-tubulin染色則細(xì)胞均顯示綠色熒光，呈強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)，見(jiàn)封三圖6。

2.2 RT-PCR 檢測(cè)MRP-1、MDR1、GST-π mRNA的表達(dá)分析

RT-PCR研究結(jié)果顯示MRP-1、MDR1、GST-π在CD133+腫瘤干細(xì)胞中呈高度表達(dá)，而在CD133-細(xì)胞中表達(dá)顯著低于CD133+細(xì)胞，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）.

3 討論

膠質(zhì)母細(xì)胞瘤是中樞系統(tǒng)常見(jiàn)原發(fā)性腫瘤，患者雖及時(shí)接受完整的放療和化療聯(lián)合治療，預(yù)后仍較差，生存期僅為12～18個(gè)月。盡管手術(shù)器械和手術(shù)方法已經(jīng)得到極大改進(jìn)，術(shù)后放療和化療等綜合治療措施也有明顯改善，膠質(zhì)母細(xì)胞瘤患者的中位生存時(shí)間仍無(wú)明顯延長(zhǎng)[7，8]。因此對(duì)膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的研究將具有持續(xù)的挑戰(zhàn)性。鑒于膠質(zhì)母細(xì)胞瘤是高度血管化的腫瘤，腫瘤的血管在腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移中起著重要的作用，因此，對(duì)膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的血管及其內(nèi)皮細(xì)胞進(jìn)行研究顯得非常有意義。

以往研究認(rèn)為，惡性腫瘤的生長(zhǎng)依賴于腫瘤的血管生成。據(jù)此，有學(xué)者提出研發(fā)抗腫瘤血管生成藥物達(dá)到治療腫瘤的目的。但是，臨床實(shí)踐證明，這些藥物的抗腫瘤效果非常有限并且容易獲得耐藥性[9-11]。因此，為研發(fā)更有效的抗腫瘤血管藥物，我們需要對(duì)腫瘤的內(nèi)皮細(xì)胞進(jìn)行更深入的研究。研究證實(shí)在多種實(shí)體瘤中均含有極少數(shù)干細(xì)胞樣的細(xì)胞，它們具有無(wú)限增殖、自我更新、多向分化的潛能及高致瘤性，這種干細(xì)胞樣細(xì)胞被稱為腫瘤干細(xì)胞。通過(guò)體外培養(yǎng)膠質(zhì)瘤干細(xì)胞研究發(fā)現(xiàn)，膠質(zhì)瘤干細(xì)胞具有自我增殖、多元分化的潛能。國(guó)外研究人員將膠質(zhì)瘤干細(xì)胞與神經(jīng)干細(xì)胞比較，膠質(zhì)瘤干細(xì)胞的自我更新能力以及增殖能力均明顯強(qiáng)于神經(jīng)干細(xì)胞[12，13]。CD133+細(xì)胞在干細(xì)胞培養(yǎng)基中培養(yǎng)具有不斷增殖、自我更新和分化的能力。我們?cè)赨251細(xì)胞系中分選CD133+細(xì)胞，實(shí)驗(yàn)顯示其在無(wú)血清干細(xì)胞培養(yǎng)基中可以自我更新、無(wú)限增殖。經(jīng)鑒定，分選獲取的 CD133+細(xì)胞為膠質(zhì)瘤干細(xì)胞。

MRP基因位于16p13.1染色體上，相關(guān)研究顯示MRP能夠通過(guò)改變胞漿和細(xì)胞器的pH值，降低藥物到達(dá)作用部位的濃度，并且能夠逆濃度梯度減少胞內(nèi)藥物濃度進(jìn)而導(dǎo)致細(xì)胞耐藥的發(fā)生，它同時(shí)也是一種ATP依賴泵，可以通過(guò)促進(jìn)谷胱甘肽結(jié)合藥物排出細(xì)胞外而減少細(xì)胞內(nèi)藥物的濃度，最終導(dǎo)致腫瘤耐藥的發(fā)生[11]。而MRP-1、MRP-3基因在膠質(zhì)瘤干細(xì)胞中的表達(dá)明顯增多，與腫瘤耐藥之間的關(guān)系相對(duì)肯定，已經(jīng)成為研究和解決腫瘤耐藥現(xiàn)象的重要靶位[14-16]。MDR1作為ABC超家族中的轉(zhuǎn)運(yùn)體多藥耐藥蛋白1能夠逃脫藥物的殺傷作用，從而導(dǎo)致化療后腫瘤的復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移[17]。GST是一組與機(jī)體解毒作用有關(guān)的酶類(lèi)，其中以GST-π與惡性腫瘤關(guān)系最為密切。GST-π以催化方式降解藥物，以降低抗腫瘤藥物的細(xì)胞毒作用而產(chǎn)生耐藥性[18-20]。本研究結(jié)果證實(shí)MRP-1、MDR1、GST-π在CD133+細(xì)胞中呈現(xiàn)高表達(dá)，提示CD133+細(xì)胞的耐藥機(jī)制可能與MRP-1、MDR1、GST-π表達(dá)增強(qiáng)有一定的關(guān)系，有可能成為膠質(zhì)瘤干細(xì)胞治療的新靶點(diǎn)，為進(jìn)一步研究腫瘤的耐藥機(jī)制以及腫瘤靶向治療藥物提供支持。

[參考文獻(xiàn)]

[1] Wang XQ，Wei F，Yan S，et al.Innovative fluorescent magnetic albumin microbead-assisted cell labeling and intracellular imaging of glioblastoma cells[J].Biosensors & amp；Bioelectronics：The International Journal for the Professional Involved with Research，Technology and Applications of Biosensers and Related Devices，2014， 54：55-63.

[2] Zhang X，Li W，Wang C，et al.Inhibition of autophagy enhances apoptosis induced by proteasome inhibitor bortezomib in human glioblastoma U87 and U251 cells[J].Molecular and Cellular Biochemistry：An International Journal for Chemical Biology，2014，385（1/2）：265-275.

[3] Wang LZ，Wang Z，Li J，et al. NFATc1 activation promotes the invasion of U251 human glioblastoma multiforme cells through COX-2[J]. International Journal of Molecular Medicine，2015，35（5）：1333-1340.

[4] Xie J，Ma YH，Wan M，et al.Expression of dedifferentiation markers and multilineage markers in U251 glioblastoma cells with silenced EGFR and FGFR genes[J].Oncology Letters，2014，7（1）：131-136.

[5] Wan YY，Zhang JF，Yang ZJ，et al.Involvement of Drp1 in hypoxia-induced migration of human glioblastoma U251 cells[J].Oncology Reports，2014，32（2）：619-626.

[6] Du HQ，Wang Y，Jiang Y，et al.Silencing of the TPM1 gene induces radioresistance of glioma U251 cells[J].Oncology Reports，2015，33（6）：2807-2814.

[7] Wang XQ，Wang L，Tan XR，et al.Construction of doxorubicin-loading magnetic nanocarriers for assaying apoptosis of glioblastoma cells[J]. Journal of Colloid and Interface Science，2014，436：267-275.

[8] Stepanenko AA，Kavsan VM.Karyotypically distinct U251， U373，and SNB19 glioma cell lines are of the same origin but have different drug treatment sensitivities[J].Gene：An International Journal Focusing on Gene Cloning and Gene Structure and Function，2014，540（2）：263-265.

[9] Chen Z，Li D，Cheng Q，et al.MicroRNA-203 inhibits the proliferation and invasion of U251 glioblastoma cells by directly targeting PLD2[J]. Molecular Medicine Reports，2014，9（2）：503-508.

[10] YasunoT，MatsumuraT，Shikata T，et al.Establishment and characterization of a cisplatin-resistant human neuroblastoma cell line[J]. Anticancer Research：International Journal of Cancer Research and Treatment，1999，19（5B）：4049-4057.

[11] Miao W，Liu XD，Wang HQ，et al.p53 upregulated modulator of apoptosis sensitizes drug-resistant U251 glioblastoma stem cells to temozolomide through enhanced apoptosis[J]. Molecular Medicine Reports，2015，11（6）：4165-4173.

[12] Kobayashi T，F(xiàn)ujiiT，Jo Y，et al.Possible mechanism responsible for the acquisition of resistance to cis-diamminedichloroplatinum（II）by cultured human testicular seminoma cells[J].The Journal of Urology，2004，171（5）：1929-1933.

[13] Minko T，Kopeckova P，Kopecek J，et al.Comparison of the anticancer effect of free and HPMA copolymer-bound adriamycin in human ovarian carcinoma cells[J].Pharmaceutical Research，1999，16（7）：986-996.

[14] Huang M，Xiong C，Lu W，et al.Dual-modality micro-positron emission tomography/computed tomography and near-infrared fluorescence imaging of EphB4 in orthotopicglioblastomaxenograft models[J]. Molecular Imaging and Biology：MIB：The Official Publication of the Academy of Molecular Imaging，2014，16（1）：74-84.

[15] Stephan Fischer，Mirko Pietsch，Kristin Schirmer，et al. Identification of multi-drug resistance associated proteins MRP1（ABCC1）and MRP3（ABCC3）from rainbow trout （Oncorhynchusmykiss）[J]. Marine Environmental Research，2010，69（Suppl）：S7-S10.

[16] Letourneau IJ，Slot AJ，Deeley RG，et al.Mutational analysis of a highly conserved proline residue in MRP1，MRP2，and MRP3 reveals a partially conserved function[J].Drug Metabolism and Disposition：The Biological Fate of Chemicals，2007，35（8）：1372-1379.

[17] Weiss J，Theile D，Ketabi-Kiyanvash N，et al.Inhibition of MRP1/ABCC1，MRP2/ABCC2， and MRP3/ABCC3 by nucleoside，nucleotide，and non-nucleoside reverse transcriptase inhibitors[J]. Drug Metabolism and Disposition：The Biological Fate of Chemicals，2007，35（3）：340-344.

[18] Ren W，Zhong M，Dai J，et al.Phase change memory alloys：GST cell array characterization using picosecond ultrasonics[J]. Microelectronic Engineering，2011，88（5）：822-826.

[19] Faraclas A，Bakan G，Adnane L，et al.Modeling of thermoelectric effects in phase change memory cells[J].IEEE Transactions on Electron Devices，2014，61（2）：372-378.

[20] Kiouseloglou A，Navarro G，Sousa V，et al.A Novel programming technique to boost low-resistance state performance in ge-rich GST phase change memory[J]. IEEE Transactions on Electron Devices，2014，61（5）：1246-1254.

（收稿日期：2016-12-14）