血栓內微泡聯(lián)合尿激酶介導的超聲溶栓體外實驗

朱 瓊，高順記，郭夢嬌，高 原，劉 政*，謝 峰

(1.第三軍醫(yī)大學新橋醫(yī)院超聲科，重慶 400037；2.內布拉斯加大學醫(yī)學中心心內科，內布拉斯加 奧馬哈 68198)

·基礎與實驗研究·

血栓內微泡聯(lián)合尿激酶介導的超聲溶栓體外實驗

朱 瓊1，高順記1，郭夢嬌1，高 原1，劉 政1*，謝 峰2

(1.第三軍醫(yī)大學新橋醫(yī)院超聲科，重慶 400037；2.內布拉斯加大學醫(yī)學中心心內科，內布拉斯加 奧馬哈 68198)

目的 探討血栓內微泡聯(lián)合尿激酶介導的超聲溶栓對體外血栓的溶解效果。方法 取牛全血制作血栓樣本50個，隨機平均分為5組后于帶有側支循環(huán)的體外循環(huán)裝置中進行處理。實驗1組為超聲微泡尿激酶組，實驗2組為超聲微泡組，實驗3組為超聲尿激酶組，實驗4組為單純尿激酶組，實驗5組為無處理組。計算并比較各組的溶栓率。并進行HE染色及免疫熒光組織學觀察。結果 實驗1組溶栓率為(73.64±14.16)%，實驗2組為(47.97±11.66)%，實驗3組為(57.33±8.65)%，實驗4組為(50.85±9.63)%，實驗5組為(29.76±18.06)%。其中實驗1組溶栓率高于其余各組，差異均有統(tǒng)計學意義(P均<0.05)；該組HE染色組織學檢查可見明顯多灶狀血栓溶解，邊緣可見血栓崩裂，免疫熒光可見纖維蛋白網斷裂。結論 血栓內微泡聯(lián)合尿激酶介導的超聲溶栓在體外實驗中可提高血栓的溶解率。

血栓形成；微泡；超聲學；溶栓

圖1 體外溶栓實驗循環(huán)裝置示意圖

經靜脈溶栓是血栓的經典治療方法，但溶栓時間窗短[1]，且溶栓效率不理想[2-4]。微泡介導的超聲溶栓技術是一種溶栓新方法[4-6]，其主要機制是微泡降低空化閾值，增加超聲空化強度，從而增強超聲溶栓效果[5，7-8]。但由于臨床多數(shù)為梗阻性血栓，經靜脈注射微泡無法進入血栓內部，僅接觸梗阻性血栓兩端，造成血栓內部的溶栓效應不足，不利于超聲溶栓。本課題組前期設計了血栓內微泡介導的超聲溶栓(intraclot microbubble mediated ultrasound thrombolysis， IMUT)方法，即經導管向血栓內注射尿激酶和微泡，使微泡和尿激酶同時聚集在血栓內部，從而提高體外超聲溶栓的效果[9]。但IMUT法存在不足：①循環(huán)裝置無側支循環(huán)，不能將血栓模型做成梗阻性；②循環(huán)液為單純磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered saline， PBS)，缺乏纖溶酶原，尿激酶無法充分發(fā)揮溶栓作用。本研究采用更符合生理狀態(tài)的梗阻性血栓模型聯(lián)合帶有側支循環(huán)的實驗裝置，并在循環(huán)液中加入血漿以補充纖溶酶原，進行IMUT溶栓實驗，評價溶栓效果。

1 材料與方法

1.1實驗材料

1.1.1血栓制備 取抗凝牛全血(鄭州九龍生物制品有限公司)50份，每份1 ml，至預先加入5%氯化鈣溶液(33 μl)的平底EP管(內徑0.9 cm)中，于37℃恒溫水浴鍋中溫育3 h后取出，以PBS沖洗3次，濾紙吸干后保存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.2體外循環(huán)裝置組裝 體外循環(huán)裝置由KY-100E/TH15微量蠕動泵(重慶杰恒蠕動泵有限公司)和自制模擬體循環(huán)的管道組成，循環(huán)液為含10%牛冰凍血漿(鄭州九龍生物制品有限公司)的PBS液，流速為5 ml/min。血栓放置處兩端有管道以模擬側支循環(huán)，血栓底部放置厚度為2 cm的吸聲海綿。整個循環(huán)裝置置于37℃恒溫水浴鍋中，見圖1。

1.2實驗方法 采用Excel隨機數(shù)字法將前期制備的50個血栓樣本隨機分為5組，每組10個樣本：實驗1組(超聲微泡尿激酶組)、實驗2組(超聲微泡組)、實驗3組(超聲尿激酶組)、實驗4組(單純尿激酶組)、實驗5組(無處理組)。

對實驗1組采用帶側孔的乙醇注射針(日本八光醫(yī)療)向血栓內注入稀釋后的自制微泡(全氟丙烷脂質微泡“脂氟顯”)0.02 ml(相當于0.9×107～1.7×107MB)和尿激酶0.1 ml(2萬U)[10]，對實驗2組以同樣方法注射0.02 ml微泡，對實驗3組和實驗4組注射0.1 ml尿激酶，對實驗5組不做處理。以濾紙吸干血栓表面后以YP3102型電子天平(上海光正醫(yī)療儀器有限公司)稱量血栓的初始質量(W0)，而后植入循環(huán)管道內備用。根據分組情況，對實驗1～3組采用SL-10型超聲空化治療儀(深圳市威爾德醫(yī)療電子有限公司)，在距離血栓正上方5 cm處給予超聲輻照，超聲頻率2 MHz，聲壓708 kPa，工作占空比5%，輻照時間10 min。對實驗4組和實驗5組不予超聲輻照。

處理10 min后，取出血栓，以PBS沖洗3次后用濾紙吸干表面液體，再次應用電子天平稱量溶栓后血栓質量(W1)。而后根據公式計算血栓溶栓率，溶栓率=(W0-W1)/W0×100%。

將血栓置于4%多聚甲醛中固定，制做石蠟切片，并進行HE染色和免疫熒光觀察。于Leica TCS SP5熒光顯微鏡下觀察處理后各組血栓中細胞及纖維分布情況。于Olympus BX63激光共聚焦顯微鏡下觀察牛纖維蛋白原抗體(北京博奧森生物技術有限公司)標記的纖維蛋白骨架結構。

表1 各組溶栓前后血栓質量和溶栓率

2 結果

2.1溶栓率 處理前各組血栓質量W0差異無統(tǒng)計學意義(χ2=4.16，P=0.39)。實驗1組溶栓率為(73.64±14.16)%，實驗2組為(47.97±11.66)%，實驗3組為(57.33±8.65)%，實驗4組為(50.85±9.63)%，實驗5組為(29.76±18.06)%。各組溶栓率差異有統(tǒng)計學意義(F=19.23，P<0.01)，且實驗1組與其余各組間差異均有統(tǒng)計學意義(P均<0.05)，實驗2組與實驗3組間、實驗5組與其余各組間溶栓率差異亦有統(tǒng)計學意義(P均<0.05)，實驗2組與實驗4組間、實驗3組與實驗4組間溶栓率差異無統(tǒng)計學意義(P均>0.05)。見表1。

2.2組織學表現(xiàn)

2.2.1HE染色 實驗1組較其余各組血栓內紅細胞分布更稀疏，血栓內可見較多島狀溶解灶，其內未見紅細胞，且血栓邊緣可見多處血栓裂解。實驗3組可見

少量的溶解灶，其余各組血栓仍較致密，未見明顯血栓溶解區(qū)。見圖2。

2.2.2免疫熒光 實驗1組中網狀結構疏松，大量纖維蛋白網斷裂，僅見少量綠色熒光標記的纖維蛋白，綠色熒光強度弱，表明大量纖維蛋白溶解。其余各組纖維蛋白結構仍較致密，無明顯斷裂溶解區(qū)域。見圖3。

3 討論

經血管介入的導管溶栓方法是臨床常用的介入溶栓方法，廣泛應用于下肢深靜脈血栓[11]、冠狀動脈血栓[12]和腦血栓的治療[8]。該方法將溶栓藥直接注射入血栓的同時，也為超聲微泡注入血栓內部提供通道，從而解決超聲溶栓治療中微泡無法進入梗阻性血栓內部的局限性。本課題組在前期研究中采用單通道閉合循環(huán)裝置，如采用梗阻血栓模型則可能因循環(huán)壓力不斷增高而導致爆管或沖走血栓[9-10]，因而只能選擇非梗阻性血栓以防止循環(huán)液壓力過高；此外，前期研究中循環(huán)液為單純PBS，使尿激酶激活纖溶酶原形成纖溶酶的反應中的底物纖溶酶原較少，可能未充分發(fā)揮尿激酶在溶栓過程中的作用[13]。

圖2 血栓體外實驗HE染色組織學表現(xiàn) A、B.實驗1組，200倍(A)及400倍(B)鏡下血栓內見大量腔隙樣血栓溶解，邊緣血栓崩解(箭)； C.實驗2組，200倍鏡下血栓內未見明顯溶解； D.實驗3組，200倍鏡下可見少量灶狀溶解； E.實驗4組，200倍鏡下未見明顯溶解灶； F.實驗5組，200倍鏡下未見明顯溶解灶，血栓結構較其余各組均更致密 (右下方圖像為400倍鏡下圖像)

圖3 血栓體外實驗免疫熒光組織學表現(xiàn) A、B.實驗1組，800萬倍(A)及1 600萬倍(B)鏡下纖維蛋白網結構最疏松，可見大量島狀無纖維蛋白結構區(qū)域，熒光強度較弱； C.實驗2組，800萬倍鏡下未見明顯纖維蛋白網斷裂，熒光強度較強； D.實驗3組，800萬倍鏡下可見部分纖維蛋白網斷裂，熒光強度較弱； E.實驗4組，800萬倍鏡下未見明顯纖維蛋白網斷裂，熒光強度較強； F.實驗5組，800萬倍鏡下未見明顯纖維蛋白網斷裂，熒光強度較強 (綠色代表熒光標記的纖維蛋白；藍色代表紅細胞)

本實驗的循環(huán)裝置新增加了側支循環(huán)，模擬在體血栓發(fā)生后開放的側支循環(huán)，降低了血流對血栓的沖擊，可更好地模擬臨床梗阻性血栓，也更符合在體溶栓時的生理情況；同時，本實驗將循環(huán)液更換為含有10%血漿的PBS液，提高了循環(huán)液中的纖溶酶原含量，進而在尿激酶催化作用下，可有更多的纖溶酶原轉化為纖溶酶，從而有望加速纖維蛋白的降解，加快血栓溶解。本研究采用前期實驗優(yōu)化后的超聲輻照參數(shù)，即聲壓708 kPa，占空比大于2%[10]。該參數(shù)下的能量低，輸出功率為0.75 W/cm2，接近診斷超聲能量水平。

本實驗結果顯示，實驗1組的溶栓率高達 (73.64±14.16)%，明顯高于其余各組(P均<0.05)；且HE染色和免疫熒光組織學檢查結果也與溶栓率結果相符，實驗1組HE染色可見大量不規(guī)則島狀血栓溶解灶，血栓邊緣崩解明顯，免疫熒光見少量綠色熒光蛋白，表明尿激酶在超聲和微泡的作用下使大量纖維蛋白結構降解。本研究結果提示超聲輻照聯(lián)合微泡對尿激酶溶栓具有增強作用，超聲輻照、微泡、尿激酶3個治療因素的聯(lián)合，較任意2個因素或單因素產生的溶栓作用更大。

盡管本課題組前期研究[10]采用聲壓708 kPa和占空比10%的超聲參數(shù)實施超聲聯(lián)合微泡和尿激酶溶栓，其占空比(即超聲能量發(fā)射密度)較本實驗高一倍(本實驗占空比為5%)，其溶栓率僅為46.19%，而本實驗中實驗1組的溶栓率卻高達(73.64±14.16)%。本實驗中不利于溶栓率提高的因素有兩個方面：①循環(huán)裝置增設了側支循環(huán)，血流對血栓的直接沖擊力較無側支循環(huán)時減?。虎谶x用血栓為梗阻性血栓，與前期研究中所用的不完全梗阻性血栓[10]相比，其與循環(huán)液的接觸面積更小。而最終本研究可獲得較高的溶栓率，這主要得益于在循環(huán)液中加入血漿，增加了纖溶酶原，使尿激酶的作用發(fā)揮更充分。但由于本實驗采用抗凝牛血制備血栓，而本課題組的前期研究[10]采用健康志愿者血液制備血栓，溶栓率不同是否是由于動物源性血栓和人源性血栓成分和結構不同所致，有待進一步驗證。

總之，本實驗改進了循環(huán)裝置和循環(huán)液成分，結果表明血栓內微泡聯(lián)合尿激酶介導的超聲溶栓可有效提高溶栓率，獲得較好的溶栓效果。本研究為IMUT技術的臨床應用提供了理論依據?；诒緦嶒灲Y果，筆者設想，借助臨床常用的導管，將微泡注入血栓內部，同時體外給予超聲輻照，實現(xiàn)體內的IMUT，是否有望提高溶栓效率，從而實現(xiàn)血管的快速再通，今后本課題組將進一步在在體實驗基礎上進行臨床試驗加以驗證。

[1] Emberson J, Lees KR, Lyden P, et al. Effect of treatment delay, age, and stroke severity on the effects of intravenous thrombolysis with alteplase for acute ischaemic stroke: A meta-analysis of individual patient data from randomized trials. Lancet,2014,384(9958):1929-1935.

[2] Rha JH, Saver JL. The impact of recanalization on ischemic stroke outcome: A meta-analysis. Stroke, 2007,38(3):967-973.

[3] 急性ST段抬高心肌梗死溶栓治療中國專家共識組.急性ST段抬高心肌梗死溶栓治療的中國專家共識(修訂版).中華內科雜志,2008,47(2):170-174.

[4] Alexandrov AV,Molina CA, Grotta JC, et al. Ultrasound-enhanced systemic thrombolysis for acute stroke. N Engl J Med, 2004,351(21):2170-2178.

[5] Schellinger PD, Molina CA. Sonothrombolysis: Current status. Perspective in Medicine, 2012,1:11-13.

[6] Siegel RJ, Luo H. Ultrasound thrombolysis. Ultrasonics, 2008,48(4):312-320.

[7] Hwang JH, Brayman AA, Reidy MA, et al. Vascular effects induced by combined 1-MHz ultrasound and microbubble contrast agent treatments in vivo. Ultrasound Med Biol, 2005,31(4):553-564.

[8] Chen X, Leeman JE, Wang J, et al. New insights into mechanisms of sonothrombolysis using ultra-high speed imaging. Ultrasound Med Biol, 2014,40(1):258-262.

[9] 郭夢嬌，高順記，屠娟，等.經導管注射微泡介導的體外超聲溶栓實驗.中國介入影像與治療學,2015,12(3):23-27.

[10] 高原，郭夢嬌，高文宏，等.不同聲學參數(shù)對血栓內微泡介導的超聲輔助溶栓效果的影響.中國醫(yī)學影像技術,2016,31(12)：1783-1786.

[11] 中華醫(yī)學會放射學分會介入學組.下肢深靜脈血栓形成介入治療規(guī)范的專家共識.介入放射學雜志,2011,45(7):293-296.

[12] Miao Z, Jiang L, Wu H, et al. Randomized controlled trial of symptomatic middle cerebral artery stenosis: Endovascular versus medical therapy in a Chinese population. Stroke, 2012,43(12):3284-3290.

[13] 楊正浩，周曉紅，朱俊銘.溶血栓藥物的發(fā)展概況.中國生物制品學雜志,2015,28(8):875-879.

Intraclot microbubble combined with urokinase mediated ultrasound thrombolysis: Experiment in vitro

ZHUQiong1,GAOShunji1,GUOMengjiao1,GAOYuan1,LIUZheng1*,XIEFeng2

(1.DepartmentofUltrasound,XinqiaoHospital,ThirdMilitaryMedicalUniversity,Chongqing400037,China； 2.CardiologySectionofInternalMedicine,MedicalCenterofNebraskaUniversity,Omaha68198,USA)

Objective To investigate the efficiency of intraclot microbubbles (MB) combined with urokinase (UK) mediated ultrasound (US) thrombolysis. Methods Fifty clots prepared by bovine whole blood were equally divided into 5 groups and were treated in a circulation system with collateral circulation tube. The clots were treated by US, MB and UK in group 1， by US and MB in group 2， by US and UK in group 3 and by UK in group 4. The group 5 was the control group without any treatment. The thrombolysis rate of each group was measured and compared. Residual clots were histologically observed with hematoxylin-eosin staining and immunofluorescence. Results The thrombolysis rate of group 1 ([73.64±14.16]%) was significantly higher than group 2 ([47.97±11.66]%), group 3 ([57.33±8.65]%), group 4 ([50.85±9.63]%), and group 5 ([29.76±18.06]%, allP<0.05). Histological examination of the clots in group 1 showed multiple thrombolysis foci with clots collapse, and the degradation of fibrin network was further confirmed by immunofluorescence. Conclusion The intraclot MB mediated US thrombolysis combined with UK can enhance the rate of thrombolysis in vitro experiment.

Thrombosis; Microbubbles; Ultrasonics; Thrombolysis

國家自然科學基金科學儀器專項(82227004)。

朱瓊(1990—)，女，重慶人，在讀碩士。研究方向：超聲空化溶栓治療。E-mail: zhuzhu9056@sina.com

劉政，第三軍醫(yī)大學新橋醫(yī)院超聲科，400037。E-mail: liuzhengs@163.com

2016-11-30

2017-03-01

R445.1; R-332

A

1672-8475(2017)04-0242-05

10.13929/j.1672-8475.201611037