液質(zhì)聯(lián)用測(cè)定芍藥甘草湯中3種有效成分的含量*

徐 玉 石鎮(zhèn)東 鄭小偉

浙江中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院 浙江 杭州 310053

中藥研究

液質(zhì)聯(lián)用測(cè)定芍藥甘草湯中3種有效成分的含量*

徐 玉 石鎮(zhèn)東 鄭小偉#

浙江中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院 浙江 杭州 310053

目的：采用高效液相色譜聯(lián)用三重四級(jí)桿質(zhì)譜(HPLC-MS/MS)測(cè)定芍藥甘草湯中芍藥苷、甘草酸及甘草次酸三種成分的含量。方法：色譜柱采用Eclipse Plus C18(2.1mm×50mm，1.8mm)；流動(dòng)相為0.1%甲酸乙腈和0.1%甲酸水溶液，流速設(shè)定為0.3mL·min-1，柱溫為35℃，進(jìn)行梯度洗脫。根據(jù)待檢測(cè)化合物的性質(zhì)，優(yōu)化相關(guān)定量分析的質(zhì)譜參數(shù)，多重反應(yīng)監(jiān)測(cè)（MRM），進(jìn)行數(shù)據(jù)的采集。結(jié)果：芍藥甘草湯中芍藥苷、甘草酸及甘草次酸的含量分別為：160.46±3.82mg·ml-1，115.66±3.13mg·ml-1，8.34±0.34mg·ml-1。結(jié)論：本實(shí)驗(yàn)精密性良好，重現(xiàn)性高，分析方法準(zhǔn)確，定量數(shù)據(jù)可靠。

HPLC-MS/MS 芍藥甘草湯 芍藥苷 甘草酸 甘草次酸

芍藥甘草湯是《傷寒論》中配伍嚴(yán)謹(jǐn)、藥簡效佳的經(jīng)典方劑，為后世醫(yī)家所推崇。本方僅由芍藥、甘草兩味中藥組成，具有柔肝止痙、緩急止痛的功效[1]。對(duì)芍藥甘草湯入血原型成分進(jìn)行測(cè)定，發(fā)現(xiàn)芍藥甘草湯的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)為芍藥苷、甘草酸、甘草次酸[2]。本文采用高效液相色譜聯(lián)用三重四級(jí)桿質(zhì)譜(HPLC-MS/MS)同時(shí)測(cè)定芍藥甘草湯中芍藥苷、甘草酸和甘草次酸的含量，為芍藥甘草湯藥效物質(zhì)研究提供理論基礎(chǔ)。

1 實(shí)驗(yàn)儀器及材料

1.1 實(shí)驗(yàn)儀器：1290 HPLC-6460 QQQ/MS(Agilent，美國)；BS124S電子分析天平(賽利多斯科學(xué)儀器有限公司)；Milli-Q Biocel純水儀(美國Millipore公司)；SHB-Ⅲ循環(huán)水式多用真空泵(鄭州長城科工貿(mào)有限公司)；RV10旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(德國IKA公司)；Freezone 6L冷凍干燥機(jī)(英國Labconco公司)。

1.2 實(shí)驗(yàn)材料：甲酸（色譜級(jí)）購于阿拉丁公司；甲醇和乙腈（均為色譜級(jí)）均購于美國Tedia公司；白芍、炙甘草來自浙江中醫(yī)藥大學(xué)飲片廠；芍藥苷、甘草酸和甘草次酸標(biāo)準(zhǔn)品均購于中國藥品生物制品檢定所。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 供試品制備：將白芍、炙甘草各12g，打碎后，加以500ml水侵泡1h，煎煮2h，重復(fù)煎煮2次，合并濾液，濃縮至150ml，－20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2 對(duì)照品溶液配制：精密稱取對(duì)照品芍藥苷2.42mg、甘草酸1.97mg、甘草次酸2.36mg分別置于2ml容量瓶中，制成對(duì)照品母液；所得芍藥苷濃度為1.21mg·ml-1，甘草酸0.985mg·ml-1，甘草次酸1.18mg·ml-1。

2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制：精密吸取不同比例的對(duì)照品母液，混合得到對(duì)照品混合溶液，然后將對(duì)照品混合溶液定容至2ml，得到系列濃度對(duì)照品溶液，用于標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制，所得對(duì)照品濃度見表1。

表1 對(duì)照品濃度(g·ml-1)

2.4 供試品前處理：取芍藥甘草湯提取藥液20ml，采用冷凍干燥后，殘留物使用10ml色譜級(jí)甲醇超聲溶解0.5h，溶液5000r·min-1×5min離心，取上清液使用0.22μm有機(jī)濾膜過濾，濾液可進(jìn)行液質(zhì)分析。

2.5 色譜質(zhì)譜條件優(yōu)化：經(jīng)過對(duì)色譜條件的優(yōu)化，最終確定的色譜條件：色譜柱為Eclipse Plus C18(2.1× 50mm，1.8mm)；柱溫為35℃；流動(dòng)相（A為0.1%甲酸水溶液，B為0.1%甲酸乙腈）；洗脫梯度（起始為5%B，保持1min，6min內(nèi)增加至15%B，在11min內(nèi)增加到22%B，在30min內(nèi)升高到65%B，在32min內(nèi)增加至95%B，保持1min，后運(yùn)行時(shí)間設(shè)定為3min）；流速設(shè)定為0.3ml·min-1；進(jìn)樣量為5ml。質(zhì)譜條件為：氮?dú)飧稍餁饬魉贋?L/min，溫度設(shè)定為350℃，霧化氣壓力為3.1bar，毛細(xì)管電壓設(shè)定為3500V。檢測(cè)方式為多重反應(yīng)監(jiān)測(cè)（MRM），數(shù)據(jù)采集速率為2spectrum/s，優(yōu)化后的質(zhì)譜參數(shù)見表2。

表2 優(yōu)化后的化合物質(zhì)譜參數(shù)

3 方法學(xué)考察和結(jié)果

3.1 色譜質(zhì)譜條件優(yōu)化：使用乙腈-水二元系統(tǒng)，使用優(yōu)化的梯度洗脫程序，良好分離了芍藥甘草湯中復(fù)雜成分。質(zhì)譜條件優(yōu)化過程中，主要優(yōu)化了干燥氣流速，毛細(xì)管電泳，碎裂電壓以及碰撞能等，對(duì)于離子相應(yīng)有較大影響的質(zhì)譜參數(shù)。以芍藥苷為例說明優(yōu)化程中，首先是使用全掃面(Scan)模式找到芍藥苷離子峰[M+COOH]-：m/z 525.2，使用負(fù)離子選擇離子檢測(cè)(SIM)和子離子掃描(PS)優(yōu)化m/z525.2的碎裂電壓和碰撞能為120V和8eV；再分析子離子掃描得到的二級(jí)質(zhì)譜結(jié)果(圖1)，確定芍藥苷的定量碎片離子m/z 449.2和m/z 121.0，并建立最終的多重反應(yīng)檢測(cè)(MRM)的定量方法。甘草酸和甘草次酸的質(zhì)樸定量方法通過相同過程建立。

圖1 芍藥苷(A)、甘草酸(B)和甘草次酸(C)二級(jí)質(zhì)譜圖

3.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制：對(duì)照品按“2.3”方法處理，進(jìn)樣分析，所得標(biāo)準(zhǔn)曲線如表3，相關(guān)系數(shù)R2均大于0.997，表明標(biāo)準(zhǔn)曲線線性關(guān)系良好。

表3 線性方程結(jié)果，定量限和檢測(cè)限

3.3 精密度、重復(fù)性及回收率實(shí)驗(yàn)：吸取一定濃度對(duì)照品，按“2.5”條件連續(xù)進(jìn)樣6次，測(cè)定3種對(duì)照品的濃度，分別計(jì)算相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）。其結(jié)果均小于4%，表明方法穩(wěn)定，精密度、重復(fù)性及準(zhǔn)確度良好。見表4。

表4 有效成分定量結(jié)果

3.4 檢測(cè)限和定量限：取已知濃度的標(biāo)樣溶液，按照“2.5”方法進(jìn)樣分析；以10倍信噪比為定量限，以3倍信噪比為檢測(cè)限，得到定量限和檢測(cè)限結(jié)果見表3。

3.5 樣品含量測(cè)定：分別精密吸取芍藥甘草湯供試品，按照“2.4”供試品處理方法處理，進(jìn)樣測(cè)定，平行進(jìn)樣3次。采用外標(biāo)法計(jì)算芍藥苷、甘草次酸及甘草酸的含量，結(jié)果見表4（n=3）。

4 結(jié)論

使用現(xiàn)代分析技術(shù)建立能被廣泛接受的質(zhì)量控制方法，可以使傳統(tǒng)中藥的應(yīng)用變得有理有據(jù)[3]。本文采用HPLC/MS-MS同時(shí)測(cè)定芍藥甘草湯中芍藥苷、甘草酸和甘草次酸的含量。優(yōu)化了毛細(xì)管電壓、霧化器壓力、干燥氣溫度和流速等離子源參數(shù)；使用全掃描找到目標(biāo)化合物母離子，然后使用選擇離子監(jiān)測(cè)、自離子掃描分別優(yōu)化了碎裂電壓和碰撞能等質(zhì)譜參數(shù)，建立了精密性良好、重現(xiàn)性高、準(zhǔn)確的分析方法，定量測(cè)定了芍藥甘草湯中芍藥苷、甘草酸、甘草次酸的含量，這有助于芍藥甘草湯的質(zhì)量控制。

[1]高秀飛,胡嬋娟,陳曉潔.芍藥甘草湯加減治療乳腺癌化療期尿路感染療效觀察[J].浙江中醫(yī)雜志,2013,48(3)：183.

[2]陳梅.芍藥甘草湯入血成分的研究[D].南京：南京中醫(yī)藥大學(xué),2010.

[3]周建良,齊煉文,李萍.色譜指紋圖譜在中藥質(zhì)量控制中的應(yīng)用[J].色譜,2008,26(2)：153-159.

2016-07-24

國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目微小RNAs和長鏈非編碼RNA對(duì)胃潰瘍肝郁脾虛證線粒體低氧調(diào)控機(jī)制的研究，編號(hào):81473596

# 通訊作者：鄭小偉，E-mail：zhxw2103@163.com