標(biāo)本因素及保存條件對HCV RNA檢測的影響

莊養(yǎng)林，熊麗紅，張鵬飛，王芳，陳丹，施橋發(fā)

(1、南昌大學(xué)醫(yī)學(xué)院，江西南昌330006；2、江西省血液中心，江西南昌330077；3、江西省職業(yè)病防治研究院，江西南昌330006)

標(biāo)本因素及保存條件對HCV RNA檢測的影響

莊養(yǎng)林1，2，熊麗紅2，張鵬飛2，王芳2，陳丹3，施橋發(fā)1

(1、南昌大學(xué)醫(yī)學(xué)院，江西南昌330006；2、江西省血液中心，江西南昌330077；3、江西省職業(yè)病防治研究院，江西南昌330006)

目的探討溶血、脂肪血、保存溫度和保存時(shí)間對HCV RNA檢測的影響，確認(rèn)用于核酸檢測的標(biāo)本正確采集、處理及保存的關(guān)鍵控制點(diǎn)。方法應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光PCR法，采用混樣檢測+單檢的檢測模式，對在不同濃度的血紅蛋白或甘油三脂下以及在不同溫度條件下保存不同時(shí)間后的HCV RNA標(biāo)本進(jìn)行檢測，對檢測的Ct值進(jìn)行分析。結(jié)果小于7．93mmol/L的不同濃度甘油三脂對HCV RNA檢測沒有影響（P＞0．05），血紅蛋白濃度為97g/L、34g/L、17g/L以及8g/L時(shí)，其對HCV RNA檢測均有影響（P＜0．05），當(dāng)血紅蛋白濃度小于5g/L時(shí)，其對HCV RNA檢測均無影響（P＞0．05）；保存溫度在－30℃下4周內(nèi)，其檢測Ct值差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0．05）。在低于37℃條件下，4h內(nèi)保存的HCV RNA標(biāo)本檢測Ct值差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0．05）。在4℃的條件下保存72h內(nèi)，HCV RNA標(biāo)本檢測Ct值差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0．05），25℃的條件下能保存48h（P＞0．05）。結(jié)論甘油三脂濃度小于7．93mmol/L對HCV RNA的檢測沒有影響，血紅蛋白濃度大于8g/L時(shí)會(huì)影響HCV RNA的檢測，用于HCV RNA檢測的標(biāo)本在4℃保存時(shí)最好在72h內(nèi)完成檢測。

核酸檢測技術(shù)；Ct值；溶血；脂肪血；保存條件

核酸檢測（nucleic acidtest，NAT）技術(shù)因其靈敏度高，其縮短病毒檢測的“窗口期”遠(yuǎn)大于血清學(xué)方法，我國采供血機(jī)構(gòu)已將血液部分或全部進(jìn)行核酸檢測。然而在核酸檢測工作中，標(biāo)本的質(zhì)量，如標(biāo)本的溶血、脂肪血等因素及運(yùn)輸、保存條件如何會(huì)直接關(guān)系到檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性。國外較早的研究表明，血紅蛋白可通過其卟啉環(huán)與Taq酶的不可逆結(jié)合而抑制Taq酶活性，從而影響PCR測定[1]。此外，檢測標(biāo)本中的核酸降解同樣也是影響核酸檢測的重要因素。細(xì)胞破碎時(shí)，RNA酶釋放出來則會(huì)降解RNA，影響檢測的靈敏度。國外有報(bào)道，受標(biāo)本保存方式的影響，可使病毒核酸檢測結(jié)果的陽性率偏低，因此，如果標(biāo)本的采集、處理、保存不當(dāng)，就會(huì)造成病毒核酸的降解，進(jìn)而影響NAT檢測本身的靈敏度，造成檢測結(jié)果不準(zhǔn)確，給血液安全帶來潛在的風(fēng)險(xiǎn)。所以確認(rèn)用于NAT檢測的標(biāo)本正確采集、處理及保存的關(guān)鍵控制點(diǎn)，進(jìn)而確保本地區(qū)高效、高質(zhì)量地完成NAT檢測工作，降低HBV、HCV、HIV經(jīng)血傳播風(fēng)險(xiǎn)顯得尤為重要。本文對含HCV RNA的標(biāo)本模擬采集、運(yùn)輸、處理以及檢測、保存的全過程，探討溶血、脂肪血、保存溫度和保存時(shí)間對HCV RNA檢測的影響。

1 對象與方法

1．1標(biāo)本的收集與處理收集2016年1月1日－2016年9月30日江西省血液中心獻(xiàn)血者經(jīng)血清學(xué)檢測HBsAg、抗－HCV、抗－HIV均為陰性以及NAT檢測均為陰性的透亮血漿標(biāo)本。收集上述時(shí)間段內(nèi)的HCV RNA檢測陽性的血漿，制備12～30倍檢出限（LOD）濃度的HCV RNA標(biāo)本，分別放置于4℃、25℃、37℃、－30℃環(huán)境下進(jìn)行保存（各5份），4h、1d、2d、3d、1周、4周后對所有標(biāo)本進(jìn)行NAT檢測（其中37℃組考慮到細(xì)菌污染等問題保存4周不納入研究）。

收集上述時(shí)間段內(nèi)血清學(xué)及NAT檢測均為陰性的嚴(yán)重乳糜血漿、紅細(xì)胞懸液。將收集的紅細(xì)胞懸液放置－80℃制成全溶血樣本，經(jīng)3000g，15min離心，取上層液體，加入血清學(xué)及NAT檢測均為陰性的透亮血漿標(biāo)本分別制成倍比稀釋的溶血樣本（1：1至1：32稀釋共6組溶血樣本）。將收集的嚴(yán)重乳糜血漿樣本，經(jīng)3000g，15min離心，取上層液體，加入血清學(xué)及NAT檢測均為陰性的透亮血漿標(biāo)本分別制成倍比稀釋的脂肪血標(biāo)本（1：1至1：8稀釋共4組脂肪血樣本）。

1．2主要儀器美國羅氏公司Cobas s 201核酸檢測系統(tǒng)，瑞士Hamlton全自動(dòng)STAR加樣儀，邁瑞全自動(dòng)細(xì)胞分析儀BC－3000Plus，貝克曼庫爾特全自動(dòng)生化分析儀AU680，長沙湘麓DL－6M大容量低溫離心機(jī)。

1．3主要試劑核酸檢測試劑盒：COBAS

1．4．2混樣標(biāo)本血紅蛋白及甘油三脂濃度的測定由倍比稀釋的脂肪血或溶血標(biāo)本制成混樣標(biāo)本的甘油三脂及血紅蛋白濃度的測定分別采用甘油磷酸氧化酶法和氰化高鐵血紅蛋白（HiCN）測定法在貝克曼庫爾特全自動(dòng)生化分析儀AU680、邁瑞全自動(dòng)細(xì)胞分析儀BC－3000Plus上進(jìn)行檢測。

1．5統(tǒng)計(jì)學(xué)方法運(yùn)用SSPS軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，組間比較采用方差分析，P＜0．05差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。兩組數(shù)據(jù)間比較采用t檢驗(yàn)，P＜0．05差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。TaqScreen MPX V2．0 test核酸檢測試劑盒（瑞士Roche公司，批號：210761、215155），甘油三脂試劑盒（上?？迫A，批號：20160812），血細(xì)胞分析用溶血?jiǎng)ㄟ~瑞南京生物技術(shù)有限公司，批號：2016080808）。

表1 血紅蛋白對HCV RNA檢測影響結(jié)果

1．4實(shí)驗(yàn)方法

1．4．1含HCV RNA的不同保存條件、溶血及脂肪血的標(biāo)本的核酸檢測將不同溫度下保存的12～30倍LOD HCV RNA的標(biāo)本保存一定時(shí)間后進(jìn)行核酸檢測，檢測模式為混樣檢測+單檢。先將5份經(jīng)核酸檢測為合格的透亮血漿標(biāo)本與上述每組制備的標(biāo)本(167μl/份)匯集為1份混樣標(biāo)本（1ml），在Cobas s 201全自動(dòng)核酸提取、擴(kuò)增檢測平臺進(jìn)行混樣、提取、擴(kuò)增和檢測：⑴如混樣標(biāo)本結(jié)果無Ct值，則該核酸檢測結(jié)果為陰性，表示該份標(biāo)本HCV RNA未檢出，下一步該標(biāo)本單獨(dú)進(jìn)行核酸檢測（取1ml），如單獨(dú)檢測結(jié)果無Ct值表示該標(biāo)本HCV RNA未檢出，如單獨(dú)檢測結(jié)果檢出Ct值表示該標(biāo)本HCV RNA陽性；⑵如混樣標(biāo)本結(jié)果檢出Ct值，則表示該標(biāo)本HCV RNA陽性。

將制備的1份倍比稀釋的溶血或脂肪血標(biāo)本和1份12～30倍LOD HCV RNA與4份經(jīng)核酸檢測合格的透亮血漿標(biāo)本匯集為1份混樣標(biāo)本（1ml），在Cobas s 201全自動(dòng)核酸提取、擴(kuò)增檢測平臺進(jìn)行混樣、提取、擴(kuò)增和檢測：⑴如混樣標(biāo)本結(jié)果無Ct值，則該核酸檢測結(jié)果為陰性，表示該份標(biāo)本HCV RNA未檢出；⑵如混樣標(biāo)本結(jié)果檢出Ct值，則表示該標(biāo)本HCV RNA陽性。

表2 甘油三脂對HCV RNA檢測影響結(jié)果

2 結(jié)果

2．1血紅蛋白組NAT檢測結(jié)果血紅蛋白對HCV RNA檢測影響見表1。

2．2甘油三脂組NAT檢測結(jié)果甘油三脂對HCV RNA檢測影響見表2。

2．3不同保存條件組NAT檢測結(jié)果保存時(shí)間和保存溫度對HCV RNA檢測影響見表3。

3 討論

本文旨在確認(rèn)用于NAT檢測的標(biāo)本正確采集、處理及保存的關(guān)鍵控制點(diǎn)，進(jìn)而確保本地區(qū)高效、高質(zhì)量地完成NAT檢測工作，降低HBV、HCV、HIV經(jīng)血傳播風(fēng)險(xiǎn)。本結(jié)果顯示，保存溫度在－30℃下4周內(nèi)，其檢測Ct值差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0．05）。在低于37℃環(huán)境下，4h內(nèi)保存的HCV RNA標(biāo)本檢測Ct值差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0．05）。國內(nèi)外有研究報(bào)道顯示，HCV RNA標(biāo)本在－20℃保存保存1～7d檢測結(jié)果無差異[2]，甚至能保存1年[3]。我們的研究和上述的研究一致，因此在實(shí)際工作中，如不能及時(shí)完成HCV RNA的檢測工作，將標(biāo)本血漿短時(shí)凍存在－30℃是可行的。

在保存溫度為4℃的條件下，我們的研究顯示保存72h內(nèi)，HCV RNA標(biāo)本檢測Ct值差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但在保存1～4周后，其檢測Ct值明顯增大，這與HCV RNA開始出現(xiàn)降解導(dǎo)致HCV RNA濃度下降有關(guān)，我們的結(jié)果與Gesson G等[4]發(fā)現(xiàn)HCV RNA血漿標(biāo)本放置1周后下降0．467Log以及陸應(yīng)玉[5]等發(fā)現(xiàn)4℃貯存2周后HCV RNA平均陽性率檢出下降至35%一致。姚鳳蘭等[6]的研究也發(fā)現(xiàn)9份弱陽性HCV RNA標(biāo)本在4℃7d內(nèi)保存，HCV RNA的含量沒有顯著的變化，但在保存2d后其濃度有下降的趨勢。所以，在日常HCV RNA檢測工作中，在采血后72h內(nèi)，應(yīng)盡早完成檢測工作[7]，以免HCV RNA在4℃冰箱長時(shí)間保存過程中出現(xiàn)降解的風(fēng)險(xiǎn)。另外我們還發(fā)現(xiàn)，在常溫25℃環(huán)境下，HCV RNA標(biāo)本在保存48h后即出現(xiàn)降解的情況，在保存4周后甚至出現(xiàn)完全檢測不出HCV RNA，這與國外的Trabaud MA等[8]發(fā)現(xiàn)室溫放置3d，HCV RNA下降0．5Log以及國內(nèi)劉長利[9]等研究發(fā)現(xiàn)的25℃保存48h病毒含量下降至原滴度的72．5%的研究一致。這也提醒我們工作人員，在采集檢測標(biāo)本后應(yīng)及時(shí)將標(biāo)本放置4℃冰箱保存，減少HCV RNA降解的風(fēng)險(xiǎn)。

在溶血實(shí)驗(yàn)的研究中，我們發(fā)現(xiàn)血紅蛋白濃度在5g/L以下時(shí)，HCV RNA檢測的情況沒有受到影響，但在血紅蛋白濃度在高于8g/L時(shí)，會(huì)出現(xiàn)HCV RNA檢測受影響的情況，李金明[10]的研究也發(fā)現(xiàn)了血紅蛋白影響核酸檢測的情況。這是因?yàn)楸M管目前核酸檢測試劑中加入有蛋白酶，但是對高濃度血紅蛋白去除有限，血紅蛋白仍然可通過卟啉環(huán)與Taq酶不可逆結(jié)合而抑制Taq酶活性，最終影響核酸檢測。通過本次研究，我們確認(rèn)了用于HCV RNA檢測的標(biāo)本接收標(biāo)準(zhǔn)，即標(biāo)本出現(xiàn)溶血現(xiàn)象時(shí)，其血漿血紅蛋白高于8g/L應(yīng)拒收此份標(biāo)本，要求送檢人員重新留取檢測樣本，拒收時(shí)可通過將8g/L的血紅蛋白標(biāo)準(zhǔn)樣本拍照作為比對標(biāo)準(zhǔn)。

脂血標(biāo)本渾濁主要是血液中的低密度脂肪（乳糜微粒等）增多引起的，而人體血漿中乳糜微粒84%～88%是TG，有研究[11]認(rèn)為血脂中的乳糜微粒能同光散射而導(dǎo)致的熒光淬滅作用使熒光信號強(qiáng)度降低，降低了擴(kuò)增效率，然而，在本結(jié)果中，高濃度的TG并沒有影響HCV RNA的檢測，因此我們認(rèn)為高血脂的標(biāo)本原則可以接收，因?yàn)楸緦?shí)驗(yàn)室HCV RNA檢測的模式為6混樣模式，即使是高濃度的血脂標(biāo)本，在最終進(jìn)入提取擴(kuò)增階段，TG濃度已經(jīng)被稀釋了6倍，影響HCV RNA檢測的可能性很小，但要注意的是，在進(jìn)行混樣時(shí)，此份高濃度的標(biāo)本最好與5份透亮的血漿標(biāo)本進(jìn)行混樣。

綜上所述，我們確認(rèn)了用于本實(shí)驗(yàn)室核酸檢測的標(biāo)本正確采集、處理以及保存的關(guān)鍵控制點(diǎn)：高血脂標(biāo)本可以接收，但在檢測時(shí)，此份標(biāo)本應(yīng)與無脂血標(biāo)本進(jìn)行混樣。溶血標(biāo)本在高于8g/L時(shí)應(yīng)通知送檢人員重新留取樣本。在采血后72h內(nèi)應(yīng)盡早完成檢測工作，若在采血后不能及時(shí)送檢標(biāo)本，應(yīng)將標(biāo)本分離出血漿－30℃保存，再進(jìn)行送檢。標(biāo)本解凍后也應(yīng)在72h內(nèi)完成檢查工作。由于本次的標(biāo)本濃度比較低，而且樣本數(shù)較少，因此可能會(huì)有個(gè)別實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)有一定的偏差。

表3 保存時(shí)間和保存溫度對HCV RNA檢測影響

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Q522，R512．91

A

1674－1129(2017)02－0228－03

10．3969/j.issn.1674－1129．2017．02．028

2016-12-21；

2017-03-21)

江西省衛(wèi)生計(jì)生委科技計(jì)劃項(xiàng)目，編號：20165521