2015年江西省麻疹疫苗株病毒的快速鑒別

龔甜，張艷妮，施勇，李健雄，周珺

(江西省疾病預(yù)防控制中心，江西南昌330029)

2015年江西省麻疹疫苗株病毒的快速鑒別

龔甜，張艷妮，施勇，李健雄，周珺

(江西省疾病預(yù)防控制中心，江西南昌330029)

目的運(yùn)用逆轉(zhuǎn)錄多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)-限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性分析方法(Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction-Restriction Fragment Length Polymorphism，RT-PCR-RFLP)快速鑒別2015年麻疹疫苗株病毒。方法用RT-PCR-RFLP方法檢測(cè)兩例疑似疫苗相關(guān)麻疹病例咽拭子標(biāo)本是否含有AflⅡ酶切位點(diǎn)鑒別麻疹疫苗株病毒，同時(shí)對(duì)標(biāo)本進(jìn)行N基因羧基末端450個(gè)核苷酸進(jìn)行序列測(cè)定分析，在基因?qū)用孢M(jìn)一步證實(shí)，以驗(yàn)證RT-PCR-RFLP方法。結(jié)果RT-PCR-RFLP方法鑒定的結(jié)果為兩例疑似疫苗相關(guān)麻疹病例咽拭子標(biāo)本均能被AflⅡ酶切開，N基因序列測(cè)定結(jié)果為兩例疑似疫苗相關(guān)麻疹病例咽拭子標(biāo)本為麻疹疫苗株病毒A基因型。結(jié)論首次為江西省麻疹疫苗株病毒提供實(shí)驗(yàn)室證據(jù)。

麻疹野病毒；麻疹疫苗株病毒；逆轉(zhuǎn)錄多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)；限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性分析方法

麻疹是一種具有高度傳染性的急性發(fā)熱出疹性疾病，是疫苗可預(yù)防的傳染病[1-3]，通過(guò)進(jìn)行含麻疹成分疫苗（Measles-containing Vaccine，MCV）免疫接種，麻疹可以得到很成功的控制[4-6]。因此，麻疹也已被世界衛(wèi)生組織（WHO）列為繼全球消滅天花和即將消滅脊髓灰質(zhì)炎之后下一個(gè)擬被消除的傳染病。目前，麻疹減毒活疫苗雖已證明是高免疫性、安全有效的疫苗，由于疫苗本身的特性和機(jī)體個(gè)體差異的原因，大約2%的受種者可出現(xiàn)暫時(shí)性皮疹[7]，部分會(huì)發(fā)生減毒活疫苗引起的疫苗相關(guān)麻疹病例（Vaccine-associated Measles Case，VAMC）。在疫苗時(shí)代的麻疹野病毒感染臨床表現(xiàn)缺少典型性，多為輕型麻疹，與VAMC不易區(qū)分。

對(duì)疑似麻疹病例，符合以下5項(xiàng)標(biāo)準(zhǔn)可以診斷為VAMC[8]：⑴病人有出疹癥狀，伴有或不伴有發(fā)熱，無(wú)咳嗽或其他與出疹相關(guān)的呼吸道癥狀；⑵出疹前7～14d曾接種過(guò)MCV；⑶接種MCV后8～56d采集血標(biāo)本，檢測(cè)其麻疹免疫球蛋白（Immunoglobulin，Ig）M陽(yáng)性；⑷現(xiàn)場(chǎng)調(diào)查未發(fā)現(xiàn)任何與此病例相關(guān)的二代麻疹病例；⑸經(jīng)現(xiàn)場(chǎng)流行病學(xué)調(diào)查和實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)無(wú)其他原因可以解釋。

由于麻疹病毒只有一個(gè)血清型，依靠血清學(xué)檢測(cè)無(wú)法區(qū)分是疫苗株，還是野毒株感染。目前，主要還是依靠基因序列分析的方法，來(lái)鑒定麻疹病毒是疫苗株，還是野病毒及其基因型。序列分析對(duì)實(shí)驗(yàn)室設(shè)備及人員要求較高，且需要時(shí)間較長(zhǎng)，因此，建立一種簡(jiǎn)便快速容易操作的鑒別麻疹疫苗株與野毒株的方法非常必要。

逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)-限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性分析（Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction-Restriction Fragment Length Polymorphism，RT-PCR RFLP）經(jīng)AflⅡ酶切作用后，因中國(guó)麻疹病毒疫苗株基因在7666～7671bp位置有AflⅡ（CTTAAG）酶切位點(diǎn)，而其它所有23種基因型麻疹野病毒在此位置均無(wú)此酶切位點(diǎn)，不能被AflⅡ酶切，因此，我們采用本實(shí)驗(yàn)室于2011年引進(jìn)建立的逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)-限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性分析（Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction-Restriction Fragment Length Polymorphism，RT-PCR RFLP）方法[9]檢測(cè)是否含有AflⅡ酶切位點(diǎn)對(duì)2015年江西省出疹前7～14d接種過(guò)MCV的2例疑似麻疹病例咽拭子標(biāo)本進(jìn)行麻疹疫苗株病毒快速鑒別。

在麻疹病毒的基因組中，血凝素（Hemagglutinin，H）蛋白基因和核蛋白（Nucleoprotein，N）基因是變異較大的基因，尤其是N基因羧基(COOH)末端450個(gè)核苷酸是麻疹病毒基因組中變異最大的區(qū)域。世界衛(wèi)生組織(WHO)規(guī)定這450個(gè)核苷酸是鑒定基因型別所需的最少序列，擴(kuò)增并測(cè)定此基因片段，并與WHO推薦的23種基因型參考株的序列做比較，以鑒定基因型[10，11]。因此，我們還對(duì)對(duì)2015年江西省2例疑似VAMC咽拭子標(biāo)本N基因羧基末端450個(gè)核苷酸進(jìn)行序列測(cè)定分析來(lái)驗(yàn)證鑒別結(jié)果。

1 材料與方法

1.1 標(biāo)本采集對(duì)出疹前7～14d接種過(guò)MCV的2例疑似麻疹病例根據(jù)《全國(guó)麻疹監(jiān)測(cè)方案》[12]要求進(jìn)行血清學(xué)和病原學(xué)臨床檢測(cè)標(biāo)本采集和運(yùn)送。血清標(biāo)本采集時(shí)間為接種MCV后8～56d，編號(hào)為2015JXMZX032和2015JXMZX035；咽拭子標(biāo)本編號(hào)為2015JXMZY032和2015JXMZY035。

1.2 麻疹I(lǐng)gM抗體和風(fēng)疹I(lǐng)gM抗體檢測(cè)血清標(biāo)本麻疹I(lǐng)gM抗體和風(fēng)疹I(lǐng)gM抗體檢測(cè)采用捕捉酶聯(lián)免疫吸附（ELISA）方法，具體按照麻疹I(lǐng)gM抗體體檢測(cè)試劑盒（珠海海泰生物有限公司，Lot No：20150203）和風(fēng)疹I(lǐng)gM抗體檢測(cè)試劑盒（珠海海泰生物有限公司，Lot No：20150304）操作說(shuō)明書進(jìn)行。

1.3 病毒RNA提取取咽拭子標(biāo)本200μl，采用Qiagen公司的Reansy Mini kit（Cat No：74106）提取病毒RNA，具體操作步驟參照試劑盒說(shuō)明書。1.4 RT-PCR-RFLP方法鑒別VAMC

1.4.1 RT-PCR反應(yīng)體系和步驟引物擴(kuò)增的靶序列為包含AflⅡ酶切位點(diǎn)（CTTAAG）的麻疹病毒H基因部分片段，見(jiàn)參考文獻(xiàn)[9]，由上海生工合成，擴(kuò)增產(chǎn)物大小為438bp。

采用QIAGEN One Step RT-PCR Kit試劑盒（Cat No：210212），進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄擴(kuò)增，反應(yīng)體系50μl，其中5×Buffer 10μl、10mmol/LdNTP 2μl、Enzyme Mix 2μl、RNA酶抑制劑（40U/μl）0.25μl、上下游引物(50μmol/L)各0.5μl、無(wú)RNA酶水29.75μl、RNA模板5μl。反應(yīng)條件：60℃1min，42℃10min，50℃30mim，95℃15min，PCR循環(huán)如下：94℃30s，50℃30s，72℃1min，30次循環(huán)，72℃10min。

1.4.2 限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性分析方法[9]酶切反應(yīng)體系為：PCR產(chǎn)物10μl、AflⅡ酶（Takara公司）1μl和AflⅡ酶自帶緩沖液2μl。每份標(biāo)本均同時(shí)設(shè)陰性對(duì)照管，僅含原標(biāo)本PCR反應(yīng)產(chǎn)物10μl。另外，使用麻疹風(fēng)疹聯(lián)合減毒活疫苗（北京天壇生物制品股份有限公司，Lot No：201501007）作為麻疹疫苗病毒陽(yáng)性對(duì)照。酶切反應(yīng)體系置于37℃水浴1h。將經(jīng)37℃水浴1h后的對(duì)照管和酶切管中的PCR產(chǎn)物在含溴化乙錠的1.5%瓊脂糖凝膠電泳分析。

1.5 麻疹病毒N基因序列測(cè)定

1.5.1 麻疹病毒N基因序列擴(kuò)增及測(cè)定引物擴(kuò)增的靶序列為包含N基因羧基末端450個(gè)核苷酸片段，具體序列為，MeV216：5‘-TGGAGCTATGCC ATGGGAGT-3’和MeV2：145‘-TAACAATGATGG AGGGTAGG-3’，由上海生工合成。

采用QIAGEN One Step RT-PCR Kit試劑盒（Cat No 210212）進(jìn)行RT-PCR反應(yīng)，相關(guān)操作按照試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行。反應(yīng)條件：60℃1min，42℃12min，50℃45mim，95℃15min，PCR循環(huán)如下：94℃30s，50℃30s，72℃1min，30次循環(huán)，72℃10min。擴(kuò)增出的基因片段送上海生工進(jìn)行序列測(cè)定。

1.5.2 N基因序列分析運(yùn)用Bioedit 7.0和MEGA 4.0軟件對(duì)測(cè)定的序列與參比序列做基因序列分析和構(gòu)建進(jìn)化樹。用于構(gòu)建進(jìn)化樹的各參考株和標(biāo)準(zhǔn)株基因序列均從GenBank下載。

2 結(jié)果

2.1 麻疹I(lǐng)gM抗體和風(fēng)疹I(lǐng)gM抗體檢測(cè)2015JXMZX032和2015JXMZX035血清標(biāo)本麻疹I(lǐng)gM抗體均為陽(yáng)性，風(fēng)疹I(lǐng)gM抗體均為陰性。

2.2 RT-PCR-RFLP方法快速鑒別VAMC結(jié)果2份咽拭子標(biāo)本的RT-PCR陽(yáng)性產(chǎn)物經(jīng)Afl II酶切后，均被切成兩個(gè)片段，呈兩條帶，分別為287bp、151bp，與目的酶切片段大小一致，見(jiàn)圖1。

2.3 N基因序列測(cè)定結(jié)果運(yùn)用Bioedit 7.0和MEGA 3.0軟件對(duì)2份標(biāo)本麻疹病毒N基因羧基末端450個(gè)核苷酸序列進(jìn)行分析，并與世界衛(wèi)生組織（WHO）公布的23種基因型30條參考序列以及中國(guó)麻疹疫苗株（滬191株）序列進(jìn)行比較，構(gòu)建基因進(jìn)化樹。結(jié)果顯示，此兩份標(biāo)本與疫苗株代表株滬191株在同一進(jìn)化小分支，Bootstrap值：100，一般認(rèn)為進(jìn)化樹Bootstrap值大于70%具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義[13]；核苷酸同源性均為100%，提示這2份標(biāo)本為麻疹疫苗株病毒A基因型，詳見(jiàn)圖2。序列測(cè)定結(jié)果與RT-PCR-RFLP方法的鑒定結(jié)果一致，2015JXMZY032和2015JXMZY035為麻疹疫苗株病毒。

圖2 N基因羧基末端450個(gè)核苷酸系統(tǒng)進(jìn)化樹

3 討論

2013年，國(guó)務(wù)院《衛(wèi)生事業(yè)發(fā)展“十二五”規(guī)劃》提出了要努力實(shí)現(xiàn)消除麻疹的目標(biāo)[14]。加強(qiáng)適齡兒童含麻疹成分疫苗（Measles-containing Vaccine，MCV）高水平的接種率，是實(shí)現(xiàn)消除麻疹目標(biāo)的首要措施。目前江西省兒童免疫首劑接種使用麻疹風(fēng)疹聯(lián)合減毒活疫苗(Measles and rubella combinedattenuated live vaccine，MR)，復(fù)種使用麻疹流行性腮腺炎風(fēng)疹聯(lián)合減毒活疫苗。隨著麻疹減毒活疫苗的廣泛使用，麻疹野病毒引起的病例會(huì)越來(lái)越少，而由疫苗株引起的麻疹樣病例會(huì)越來(lái)越多，隨著麻疹消除工作的進(jìn)程，減毒活疫苗引起的疫苗相關(guān)麻疹病例會(huì)更加的凸顯。

麻疹病毒、風(fēng)疹病毒均可引起人群以發(fā)熱、出疹為主要表現(xiàn)的急性呼吸道傳染病，二者在臨床癥狀上難以區(qū)分，有時(shí)甚至?xí)霈F(xiàn)兩種病毒混合流行的暴發(fā)疫情[15-17]，因此，本研究對(duì)這2例疑似麻疹病例接種MCV后8～56d采集血標(biāo)本血清標(biāo)本同時(shí)進(jìn)行麻疹I(lǐng)gM抗體和風(fēng)疹I(lǐng)gM抗體檢測(cè)，結(jié)果為麻疹I(lǐng)gM抗體陽(yáng)性，風(fēng)疹I(lǐng)gM抗體陰性，排除風(fēng)疹病毒感染，為疑似麻疹病例。由于該2例疑似麻疹病例在出疹前7～14d接種過(guò)MCV，麻疹I(lǐng)gM抗體陽(yáng)性，現(xiàn)場(chǎng)流行病學(xué)調(diào)查也未發(fā)現(xiàn)與此病例相關(guān)的二代麻疹病例，根據(jù)VAMC診斷標(biāo)準(zhǔn)，可以初步判斷為VAMC。

本研究通過(guò)運(yùn)用RT-PCR-RFLP方法快速鑒別了該2例疑似麻疹病例為麻疹疫苗相關(guān)麻疹病例，首次對(duì)我省麻疹疫苗株病毒的證實(shí)提供實(shí)驗(yàn)室證據(jù)。另外，本研究還對(duì)該2例病例咽拭子標(biāo)本進(jìn)行N基因羧基末端450個(gè)核苷酸序列測(cè)定和分析，在基因?qū)用孢M(jìn)一步證實(shí)。兩種實(shí)驗(yàn)方法檢測(cè)結(jié)果一致。

因此，科學(xué)、正確、及時(shí)地鑒別麻疹疫苗株病毒，為判定是否達(dá)到消除麻疹指標(biāo)提供技術(shù)支撐，為我省麻疹預(yù)防與控制工作提供科學(xué)依據(jù)，對(duì)努力實(shí)現(xiàn)消除麻疹目標(biāo)是非常重要的。

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Rapid identification of measles vaccine strain virus in Jiangxi Province in 2015

GONG Tian，ZHANG Yanni，SHI Yong，LI Jianxiong，ZHOU Jun.Jiangxi Provincial Center for Disease Control and Prevention，Nanchang 330029，China.

Objective Using reverse transcription polymerase chain reaction restriction fragment length polymorphism analysis method to identify rapidly the Measles vaccine strain virus in Jiangxi Province，in 2015.Methods We identifyed two cases of suspected vaccine associated measles throat swab specimens by detecting whether they contains Afl II enzyme cutting site with RTPCR-RFLP method.At the same time，the carboxyl terminal 450 nucleotides of N gene was sequenced and analyzed，confirming the result obtained by RT-PCR-RFLP method.Results The identification results of RT-PCR-RFLP method is that two throat swab specimens can be Afl II enzyme incision，and the N gene sequence determination results for measles vaccine strain virus of genotype A.Conclusion Our study provides laboratory evidence for measles vaccine strain in Jiangxi Province for the first time.

Measles wild virus；Measles vaccine strain virus；Reverse transcription-polymerase chain reaction；Restriction fragment length polymorphism

R511.1，R446.62

A

1674-1129(2017)02-0174-03

10.3969/j.issn.1674-1129.2017.02.011

2016-08-17；

2017-03-09)

龔甜，女，1982年生，碩士，副主任技師，主要從事麻疹和風(fēng)疹等病毒的實(shí)驗(yàn)室監(jiān)測(cè)工作。