PKM剪接體在伊馬替尼敏感及耐藥慢粒細(xì)胞中的差異表達(dá)

張靜，李書琪，姜鈺環(huán)，黃波，劉靜，徐顏美，林晉，王小中

(南昌大學(xué)第二附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科，江西南昌330006)

·論著·

PKM剪接體在伊馬替尼敏感及耐藥慢粒細(xì)胞中的差異表達(dá)

張靜，李書琪，姜鈺環(huán)，黃波，劉靜，徐顏美，林晉，王小中

(南昌大學(xué)第二附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科，江西南昌330006)

目的探討丙酮酸激酶剪接體M1型（PKM1）和M2型（PKM2）在不同慢性粒細(xì)胞白血?。╟hronic myeloid leukemia，CML）細(xì)胞中的表達(dá)情況及意義。方法收集南昌大學(xué)第二附屬醫(yī)院確診的伊馬替尼(Imatinib，IM)敏感（n=23）和IM耐藥（n=7）CML患者外周血或骨髓，采用逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)（reverse transcription-polymerase chain reaction，RT-PCR）的方法檢測IM敏感CML細(xì)胞系K562、IM耐藥CML細(xì)胞系K562/G01及30例臨床樣本中PKM1和PKM2表達(dá)水平。結(jié)果與K562細(xì)胞相比，K562/G01細(xì)胞中PKM2/PKM1的比值明顯升高；IM耐藥CML患者PKM2/PKM1的比值較IM敏感者顯著上調(diào)。結(jié)論P(yáng)KM發(fā)生異常剪接可能與CML細(xì)胞IM耐藥相關(guān)。

丙酮酸激酶；剪接體；慢性粒細(xì)胞白血?。灰榴R替尼

伊馬替尼(Imatinib，IM)耐藥是CML治療失敗的主要原因之一，其耐藥機(jī)制十分復(fù)雜，主要包括bcr-abl融合基因的表達(dá)上調(diào)，藥理學(xué)改變等[1，2]。近年來，腫瘤細(xì)胞能量代謝異常導(dǎo)致化療抵抗的現(xiàn)象引起了研究熱點(diǎn)[3-5]。與正常細(xì)胞不同，腫瘤細(xì)胞即使是在氧氣供應(yīng)充足的條件下也采用糖酵解的方式來分解葡糖糖并獲得能量的現(xiàn)象被稱之為有氧糖酵解。由于腫瘤細(xì)胞發(fā)生代謝重塑這一特殊表型是由德國生理學(xué)家Warburg教授首次發(fā)現(xiàn)，因此也被稱作Warburg效應(yīng)。近期，研究者應(yīng)用代謝組學(xué)技術(shù)對IM敏感與耐藥的CML細(xì)胞株進(jìn)行代謝分析，發(fā)現(xiàn)升高的糖酵解活性與IM耐藥有關(guān)[6]，提示糖酵解可能在CML細(xì)胞IM耐藥形成中發(fā)揮了重要的作用。付偉等[7]應(yīng)用GEO數(shù)據(jù)庫下載K562細(xì)胞和IM處理的K562細(xì)胞基因表達(dá)芯片數(shù)據(jù)，篩選得到重要差異表達(dá)核心基因包括PKM，表明PKM可能與CML細(xì)胞對IM抵抗密切相關(guān)。

1 材料與方法

1.1 研究標(biāo)本的來源人CML細(xì)胞系K562細(xì)胞和IM耐藥細(xì)胞株K562/G01均為本實(shí)驗(yàn)室保存。由于急變期CML幾乎對所有常規(guī)化療藥物均有抗性，因此我們選擇急變CML患者標(biāo)本作為耐藥CML研究對象。根據(jù)《慢性髓性白血病治療專家共識（2010版）》[8]作為IM耐藥診斷標(biāo)準(zhǔn)，IM治療3個(gè)月未能達(dá)到完全血液學(xué)緩解，治療6個(gè)月未能達(dá)到細(xì)胞遺傳學(xué)緩解或治療12個(gè)月未能達(dá)到主要細(xì)胞遺傳學(xué)緩解，失去已經(jīng)獲得的完全血液學(xué)緩解或細(xì)胞遺傳學(xué)緩解，疾病進(jìn)展或出現(xiàn)耐藥的Bcr－Abl激酶突變。選取2016年6月至2016年12月期間于南昌大學(xué)第二附屬醫(yī)院確診的IM敏感的CML樣本23例和IM耐藥的CML標(biāo)本7例。所有標(biāo)本的使用符合南昌大學(xué)第二附屬醫(yī)院倫理委員會的倫理要求。

1．1．1主要試劑PrimeScriptTMRT Master Mix逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（日本Takara公司），2×Taq PCR Master Mix（北京全式金生物技術(shù)有限公司）。

1．1．2儀器PCR基因擴(kuò)增儀（美國BIO－RAD公司）

1．2方法

1．2．1 RT－PCR檢測PKM1和PKM2表達(dá)水平收集南昌大學(xué)第二附屬醫(yī)院確診的23例IM敏感和7例耐藥患者的外周血或者骨髓，提取RNA，逆轉(zhuǎn)錄生成cDNA，根據(jù)PKM1、PKM2、GAPDH基因設(shè)計(jì)特異引物，采用2×Taq PCR Master Mix試劑盒檢測PKM1、PKM2的相對表達(dá)。引物序列見表1。

表1 PCR反應(yīng)引物的序列

表2 IM敏感和IM耐藥CML細(xì)胞中PKM1、PKM2 mRNA灰度值

反應(yīng)條件為：95℃5min；（95℃35s；退火溫度見表30s；72℃30s）35個(gè)循環(huán)；72℃5min；以GAPDH作為內(nèi)參。反應(yīng)結(jié)束后，取PCR產(chǎn)物10μl進(jìn)行2%瓊脂糖凝膠電泳檢測，確認(rèn)PCR產(chǎn)物的大小是否與預(yù)測值相符合。

1．3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法應(yīng)用SPSS 22．0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析，正態(tài)計(jì)量數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）形式表示，兩組間比較采用t檢驗(yàn)，以P＜0．05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2．1比較不同CML細(xì)胞株中PKM2/PKM1比值變化為了檢測IM敏感（NO．25）和耐藥CML細(xì)胞株（NO．24）中PKM1和PKM2 mRNA表達(dá)情況，采用RT－PCR方法對K562和K562/G01細(xì)胞中PKM2/ PKM1比值進(jìn)行檢測。結(jié)果顯示，與K562細(xì)胞相比，K562/G01細(xì)胞中PKM2/PKM1比值呈上升趨勢（圖1）。

2．2比較IM敏感和耐藥的CML樣本中PKM2/ PKM1比值差異為了進(jìn)一步驗(yàn)證這一表達(dá)差異，我們收集了23例（NO．1－23）IM敏感CML樣本和7例（NO．26－32）IM耐藥的CML標(biāo)本為研究對象，對其PKM1和PKM2 mRNA表達(dá)水平進(jìn)行了灰度半定量檢測與分析，見表2。結(jié)果同樣發(fā)現(xiàn)，PKM2在IM耐藥CML患者中高表達(dá)，PKM2/PKM1比值較IM敏感CML患者顯著上調(diào)。

圖1 比較不同CML細(xì)胞中PKM2/PKM1比值變化

3 討論

IM已成為CML治療的一線治療選擇，然而伴隨出現(xiàn)的IM耐藥已成為CML治療的最主要障礙，其耐藥形成的具體機(jī)制仍不清楚。研究發(fā)現(xiàn)，IM抵抗與CML細(xì)胞的代謝途徑密切相關(guān)[7，9]。因此，能量代謝可能在CML耐藥機(jī)制中起著重要作用。腫瘤細(xì)胞在缺氧情況下進(jìn)行糖酵解產(chǎn)能可使其適應(yīng)缺氧環(huán)境，保持生長優(yōu)勢。此外，腫瘤細(xì)胞糖酵解產(chǎn)生大量乳酸，可使腫瘤微環(huán)境改變，從而促進(jìn)腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移[10-12]。丙酮酸激酶（PK）是腫瘤進(jìn)行有氧糖酵解的必要條件，其不同的剪接產(chǎn)物PKM1和PKM2活性與腫瘤糖酵解緊密相關(guān)，但PKM剪接產(chǎn)物的表達(dá)水平與血液腫瘤化療抵抗間的關(guān)系仍少見報(bào)道。

我們的研究結(jié)果顯示：PKM2在IM耐藥CML細(xì)胞中高表達(dá)，且PKM2/PKM1比值較IM敏感的CML細(xì)胞顯著上調(diào)。提示PKM2表達(dá)升高，促進(jìn)CML糖酵解，進(jìn)而導(dǎo)致CML耐藥現(xiàn)象。腫瘤細(xì)胞在缺氧條件下表現(xiàn)出葡萄糖利用增加，糖酵解增強(qiáng)的現(xiàn)象，通常認(rèn)為該效應(yīng)與缺氧誘導(dǎo)因子-1（HIF-1）相關(guān)，保證腫瘤細(xì)胞在無氧條件下的生存與增殖。研究報(bào)道，PKM2作為HIF-1的靶基因促進(jìn)葡萄糖利用，降低氧耗；而PKM1缺乏缺氧反應(yīng)元件，不能與HIF-1靶基因相互作用，難以滿足缺氧條件下CML細(xì)胞快速增殖需求[13-15]。綜上所述，PKM2促進(jìn)了白血病細(xì)胞的代謝重編程，適應(yīng)了白血病細(xì)胞過度增殖后能量代謝和合成代謝的需求，可能是IM耐藥CML細(xì)胞中PKM2增加而PKM1減少的原因之一。因此，PKM2/PKM1比值有望成為預(yù)測CML細(xì)胞是否對IM耐藥的潛在指標(biāo)。

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Differencial expression of PKM spliceosomes in Imatinib sensitive and resistant CML cells

ZHANG Jing，LI Shuqi，JIANG Yuhuan，etal.Department of Clinical Laboratory，The Second Affiliated Hospital of Nanchang University，Nanhcang 330006，China.

Objective To explore the expression levels and effects of the pyruvate kinase spliccesome PKM1 and PKM2 in different chronic myeloid leukemia(CML)cells.Methods CML patients diagnosed as imatinib(IM)sensitive(n=23)and IM resistant(n=7)were enrolled from the second affiliated hospital of Nanchang university，respectively.PKM1 and PKM2 mRNA levels were detected by reverse transcription-polymerase chain reaction(RT-PCR)in IM sensitive cell line(K562)，IM resistant cell line (K562/G01)and 30 clinical samples.Results PKM2/PKM1 ratio was significantly higher in K562/G01 compared with that in k562；the PKM2/PKM1 ratio in IM resistant patient was also obviously higher than that in IM sensitive patient.Conclusion Aberrant splicing of PKM is probably related to Imatinib resistance in CML cells.

Pyruvate kinase；Splicesome；Chronic myeloid leukemia；Imatinib

R733.7，R446.62

A

1674-1129(2017)02-0140-03

10.3969/j.issn.1674-1129.2017.02.002

2017-03-06；

2017-03-21)

國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(編號81271912)

張靜，1990年生，女，南昌大學(xué)碩士研究生，主要從事血液病機(jī)制研究；李書琪，1993年生，女，南昌大學(xué)碩士研究生，主要從事血液病機(jī)制研究。張靜和李書琪為共同第一作者。

王小中，1973年生，男，教授，博士研究生導(dǎo)師，主要從事血液病機(jī)制研究；E-mail：wangxzlj@126.com。