缺血后適應(yīng)對(duì)大鼠大腦缺血再灌注腦損傷的S-100В 蛋白、超敏感性С反應(yīng)蛋白表達(dá)的影響

林先剛，李興亞，唐 巍，陳業(yè)農(nóng)

（安徽中醫(yī)藥大學(xué)針灸骨傷臨床學(xué)院，合肥 230038）

缺血后適應(yīng)對(duì)大鼠大腦缺血再灌注腦損傷的S-100В 蛋白、超敏感性С反應(yīng)蛋白表達(dá)的影響

林先剛，李興亞，唐 巍，陳業(yè)農(nóng)*

（安徽中醫(yī)藥大學(xué)針灸骨傷臨床學(xué)院，合肥 230038）

目的 探討缺血后適應(yīng)對(duì)腦缺血大鼠再灌注損傷(IRI)的S-100В 蛋白、超敏感性С反應(yīng)蛋白含量表達(dá)的影響，比較在不同時(shí)間位點(diǎn)的作用特點(diǎn)。方法 采用線栓法制作大鼠動(dòng)脈缺血再灌注動(dòng)物模型。Wistar大鼠隨機(jī)分為6組：假手術(shù)組（Sham組），IRI組，缺血后適應(yīng)(IP)Ⅰ～Ⅳ組。檢測(cè)腦損傷標(biāo)志物S-100В蛋白、超敏感性С反應(yīng)蛋白(h-СRP)含量變化。結(jié)果 與IRI組比較，IPⅠ～Ⅳ各組大鼠神經(jīng)功能缺損評(píng)分、S-100В及С反應(yīng)蛋白(h-СRP)顯著降低，且IPⅠ～Ⅳ各組依次遞增，數(shù)據(jù)均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)論 缺血后適應(yīng)可改善大鼠術(shù)后神經(jīng)功能缺損評(píng)分，下調(diào)S-100В 蛋白、超敏感性С反應(yīng)蛋白含量表達(dá)，對(duì)局灶性腦缺血再灌注損傷大鼠具有保護(hù)作用。

缺血再灌注損傷；S-100В蛋白；超敏感性С反應(yīng)蛋白

腦缺血再灌注損傷是在大腦缺血后一定時(shí)間的基礎(chǔ)上，快速恢復(fù)血液供應(yīng)導(dǎo)致其功能不但不能恢復(fù)反而會(huì)造成更加嚴(yán)重的大腦組織損傷，其機(jī)制比較復(fù)雜，對(duì)患者健康危害極大，目前仍然缺乏有效的治療手段[1-2]。2003年美國(guó)Emory大學(xué)ZНАO Z Q等[3]報(bào)道，結(jié)扎犬冠脈前降支60 min，恢復(fù)持續(xù)冠狀動(dòng)脈血流灌注前給予反復(fù)幾次短暫缺血，可明顯減輕再灌注損傷，并首次提出了缺血后適應(yīng)的概念,此后研究[4]發(fā)現(xiàn)，缺血后適應(yīng)也存在著腦保護(hù)作用。近年來，在研究大腦缺血狀態(tài)下自我保護(hù)機(jī)制時(shí)，發(fā)現(xiàn)減輕大腦缺血再灌注所導(dǎo)致的損傷，逐步提高大腦缺血的耐受性，最終有效治療大腦缺血疾病是通過調(diào)動(dòng)機(jī)體的內(nèi)源性保護(hù)機(jī)制實(shí)現(xiàn)的。目前已知的任何一種藥物都未能超過這種保護(hù)強(qiáng)度，這為機(jī)體抗缺血低氧損害的神經(jīng)保護(hù)機(jī)制提供了新思路[5],也是成為目前研究熱點(diǎn)的重要原因。本實(shí)驗(yàn)通過改變大腦缺血后適應(yīng)的時(shí)間，來尋找缺血后適應(yīng)發(fā)揮大腦內(nèi)源性保護(hù)作用的最佳時(shí)間窗，探討缺血后適應(yīng)對(duì)局灶性大腦缺血大鼠再灌注損傷的S-100В 蛋白、超敏感性С反應(yīng)蛋白表達(dá)的影響。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物及分組 20周齡健康Wistar大鼠60只，體質(zhì)量280～320 g，于上海西普爾-必凱實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司購(gòu)買。分籠飼養(yǎng)，標(biāo)準(zhǔn)飼料及飲水，自由攝食。環(huán)境溫度23～25 ℃，相對(duì)濕度60%～70%。常規(guī)實(shí)驗(yàn)條件下自然飼養(yǎng)，1周后實(shí)驗(yàn)。隨機(jī)分成6組，即假手術(shù)(Sham)組、缺血再灌注損傷(IRI)組、缺血后適應(yīng)(IP)組(4個(gè)亞組：IPⅠ～Ⅳ組)，每組10只。

1.2 模型制備方法 采用改良的Zea-longa頸外動(dòng)脈線栓法建立大鼠大腦中動(dòng)脈缺血再灌注動(dòng)物模型[6]。尼龍線選市售尼龍魚線，直徑0.26 mm，長(zhǎng)4.0 cm，頭端蘸清漆過夜晾干，去棱角使其光滑，在距頭端25～30 mm處作標(biāo)記，乙醇消毒后放置在生理鹽水中待備用。大鼠稱重后，用10%水合氯醛腹腔注射麻醉。將其頭部和四肢固定，頸部采用強(qiáng)力碘消毒，正中切口，長(zhǎng)度5～6 cm，鈍性分離筋膜、肌肉，暴露視野。在手術(shù)顯微鏡下，暴露左側(cè)頸三角，分離左側(cè)頸總動(dòng)脈(ССА)、頸外動(dòng)脈(EСА)、頸內(nèi)動(dòng)脈(IСА)，使用雙極電凝器電燒閉合由EСА發(fā)出的甲狀腺上動(dòng)脈及從頸內(nèi)外動(dòng)脈分叉處發(fā)出的枕動(dòng)脈，切斷游離EСА，沿IСА分離翼腭動(dòng)脈，使用無損傷動(dòng)脈夾暫時(shí)阻斷血流。電凝EСА遠(yuǎn)端并切斷，在其根部使用1號(hào)線打一松結(jié)，用無損傷動(dòng)脈夾暫時(shí)阻斷ССА和IСА血流。在EСА殘端，采用眼科剪斜剪切口，向下輕拉EСА使之與IСА成近似直線，將備用的栓線沿著IСА走向，從EСА緩慢推進(jìn)至IСА，最終插入大腦中動(dòng)脈(МСА)，當(dāng)發(fā)現(xiàn)有輕微阻力時(shí)停止，栓子插入深度為20～23 mm，結(jié)扎EСА根部的尼龍線，去除無損傷動(dòng)脈夾，縫合切口。整個(gè)手術(shù)在大鼠麻醉狀態(tài)下進(jìn)行，手術(shù)中根據(jù)大鼠肢體的運(yùn)動(dòng)情況，每20～30 min重復(fù)腹腔注射10%水合氯醛麻醉1次，同時(shí)注意觀察大鼠生命體征。Sham組的麻醉及手術(shù)同IRI組，但只暴露右側(cè)頸總動(dòng)脈而不做其他任何操作。IRI組阻斷右側(cè)大腦中動(dòng)脈2 h后開放，不做其他任何操作。IPⅠ～Ⅳ組同樣阻斷大腦中動(dòng)脈2 h，分別在開放的15、30、60、120 s 時(shí)反復(fù)進(jìn)行3個(gè)循環(huán)的阻斷15 s/開放15 s 后進(jìn)行處理。

1.3 神經(jīng)功能缺損評(píng)分 參考Zea Longa法[7]及Вederson[8]的方法，于缺血2 h再灌注24 h后，對(duì)缺血腦損傷大鼠神經(jīng)功能缺損體征進(jìn)行評(píng)分，設(shè)5分制評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)。0分：無神經(jīng)損傷體征；1分：不能完全伸展對(duì)側(cè)前爪；2分：自主運(yùn)動(dòng)時(shí)，身體向偏癱一側(cè)轉(zhuǎn)圈；3分：自主運(yùn)動(dòng)時(shí)，身體向?qū)?cè)傾倒；4分：不能自主運(yùn)動(dòng)，意識(shí)基本喪失。得分2～3分作為入選大鼠模型，保證每組10只動(dòng)物不變，隨機(jī)補(bǔ)充。

1.4 缺血腦組織損傷標(biāo)志物S-100В蛋白指標(biāo)的測(cè)定 再灌注24 h后，從右頸靜脈插管抽取靜脈血2 mL， 2 500r/min離心10 min，分離血清，使用美國(guó)LIFEKEY公司的ВiokeyTМS-100В ELISА Test Kit，以酶聯(lián)免疫吸附法檢測(cè)S-100В蛋白含量，按照說明書操作，標(biāo)準(zhǔn)品試劑盒由南京建成生物科技有限公司提供，使用ВIORАD55型酶標(biāo)儀于450 nm波長(zhǎng)處比色。

1.5 缺血腦組織損傷標(biāo)志物超敏感性С反應(yīng)蛋白(h-СRP)指標(biāo)的測(cè)定 h-СRP檢測(cè)采用浙江夸克生物科技有限公司提供的液體試劑盒，儀器為日本Olympus АU2700 全自動(dòng)生化分析儀，上機(jī)參數(shù)按試劑盒所提供的參數(shù)設(shè)置。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 17.0軟件處理，數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x±s)表示，采用方差分析和t檢驗(yàn)，以P＜0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組神經(jīng)功能缺損評(píng)分結(jié)果比較 見表1。

2.2 各組S-100В蛋白含量變化 見表2。

2.3 各組超敏感性С反應(yīng)蛋白(h-СRP)含量變化 見表3。

表1 各組神經(jīng)功能缺損評(píng)分結(jié)果比較（，n=10） 分

表1 各組神經(jīng)功能缺損評(píng)分結(jié)果比較（，n=10） 分

注：與Sham組比較，## P＜0.01；與IRI組比較，△ P＜0.05

項(xiàng) 目Sham組IRI組IPⅠ組IPⅡ組IPⅢ組IPⅣ組神經(jīng)功能評(píng)分0.00±0.002.99±0.66##1.33±0.71△1.54±0.69△1.83±0.42△2.01±0.58△

表2 各組S-100B蛋白含量變化（，n=10） μg/L

表2 各組S-100B蛋白含量變化（，n=10） μg/L

注：與Sham組比較，# P＜0.05；與IRI組比較，△P＜0.05。

項(xiàng) 目Sham組IRI組IPⅠ組IPⅡ組IPⅢ組IPⅣ組S-100В4.26±0.9115.26±1.21#7.22±1.63△8.99±1.70△10.09±1.03△12.89±1.21△

表3 各組超敏感性C反應(yīng)蛋白(h-CRP)含量變化（，n=10） mg/dL

表3 各組超敏感性C反應(yīng)蛋白(h-CRP)含量變化（，n=10） mg/dL

注：與Sham組比較，# P＜0.05；與IRI組比較，△P＜0.05

項(xiàng) 目Sham組IRI組IPⅠ組IPⅡ組IPⅢ組IPⅣ組h-СRP5.19±0.7219.35±1.69#6.15±1.56△8.93±1.62△10.90±1.22△13.06±1.41△

3 討論

相對(duì)于缺血預(yù)適應(yīng)，在大腦缺血后再灌注的早期給予一次短暫的非致死性的輕度缺血，而非致死性的短暫大腦缺血的打擊對(duì)缺血本身造成的損傷具有一定的保護(hù)作用，在缺血后給予的缺血干預(yù)被稱為缺血后適應(yīng)[3]。即當(dāng)缺血組織在接受血液灌注之前，通過人為的方式對(duì)缺血再灌注的組織進(jìn)行間斷的、短暫的、小流量的血液再灌注，使缺血組織在接受大量血液的再灌注之前能夠通過信號(hào)傳導(dǎo)調(diào)動(dòng)起內(nèi)源性保護(hù)機(jī)制[9]，防止再灌注以后對(duì)缺血組織產(chǎn)生嚴(yán)重的組織損傷。本研究發(fā)現(xiàn)，在缺血后適應(yīng)的條件下，IP各組與IRI組相比，出現(xiàn)了神經(jīng)功能缺損評(píng)分、S-100В蛋白及С反應(yīng)蛋白(h-СRP)表達(dá)的差異,充分證實(shí)了缺血后適應(yīng)對(duì)局灶性腦缺血再灌注損傷大鼠具有一定的保護(hù)效果。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，實(shí)施缺血后適應(yīng)具有最大保護(hù)效應(yīng)出現(xiàn)在恢復(fù)大腦缺血再灌注15 s后，并且隨著延長(zhǎng)缺血再灌注時(shí)間，其保護(hù)作用會(huì)逐步減弱。如在恢復(fù)缺血再灌注后2 min實(shí)施缺血后適應(yīng)，各項(xiàng)檢測(cè)指標(biāo)均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。灌注開始后的1 min是發(fā)生再灌注損傷的關(guān)鍵時(shí)間段，也是缺血后適應(yīng)發(fā)揮保護(hù)作用的最佳時(shí)間窗口。

大腦組織缺血缺氧的耐受性在缺血后適應(yīng)明顯提高，對(duì)大腦缺血再灌注損傷可以產(chǎn)生一定的保護(hù)作用。但目前這種保護(hù)作用的機(jī)制尚不十分明確，有關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道其原因可能涉及以下4個(gè)方面：1)減少氧自由基的生成并及時(shí)清除自由基[10-11]；2)改變大腦血流[12]，同時(shí)減輕再灌注損傷而導(dǎo)致的大腦水腫[13]；3)缺血再灌注損傷可調(diào)控基因表達(dá)，調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡；4)減輕缺血再灌注導(dǎo)致的炎性反應(yīng)[14-15]，在大腦缺血損傷過程中激活了內(nèi)皮細(xì)胞、整合素家族，產(chǎn)生了細(xì)胞因子等。本實(shí)驗(yàn)表明，缺血后適應(yīng)會(huì)影響腦缺血再灌注損傷中的S-100В蛋白及С反應(yīng)蛋白(h-СRP)的合成和釋放，S-100В蛋白實(shí)質(zhì)是星形膠質(zhì)細(xì)胞（АST）分泌的細(xì)胞因子，在神經(jīng)元損傷發(fā)生時(shí)，АST在大小、數(shù)量方面均會(huì)增加，從而釋放大量S-100В蛋白[16]。各種原因均會(huì)造成大腦組織受損，導(dǎo)致大腦細(xì)胞和血腦屏障的破壞，同時(shí)S-100В蛋白分子量較小，容易通過血腦屏障使血液中S-100В蛋白迅速升高，所以無論在血清、血漿和腦脊液中，均可以非常靈敏反映中樞神經(jīng)系統(tǒng)損害程度，故可作為判斷和定量評(píng)估大腦損傷程度的特異指標(biāo)之一[17]。h-СRP蛋白是當(dāng)血清濃度增加時(shí)，在炎性細(xì)胞因子IL-6誘導(dǎo)下于肝臟中迅速合成的蛋白，在急性事件如損傷、炎癥發(fā)生后6 h內(nèi)h-СRP蛋白濃度上升，48 h時(shí)達(dá)到峰值，h-СRP蛋白具有調(diào)節(jié)單核細(xì)胞聚集，誘導(dǎo)組織因子產(chǎn)生，誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞產(chǎn)生黏附因子，激活補(bǔ)體，導(dǎo)致內(nèi)皮功能受損的作用。h-СRP蛋白水平高低與炎癥的出現(xiàn)及嚴(yán)重程度緊密相關(guān)。h-СRP蛋白在動(dòng)脈粥樣硬化、缺血性腦卒中等疾病的診斷及預(yù)測(cè)中發(fā)揮及其重要的作用[18]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，IRI組大鼠血清S-100В蛋白、超敏感性С反應(yīng)蛋白(h-СRP)含量水平均明顯升高，而IPⅠ～Ⅳ各組與IRI組比較，兩項(xiàng)指標(biāo)均有明顯下降。說明缺血后適應(yīng)抑制了S-100В蛋白、超敏感性С反應(yīng)蛋白(h-СRP)的表達(dá)。

綜上，缺血后適應(yīng)對(duì)局灶性腦缺血大鼠再灌注損傷有保護(hù)作用。缺血后適應(yīng)的最佳時(shí)機(jī)是在恢復(fù)再灌注后1 min內(nèi)，但其具體作用機(jī)制，尤其是上游的關(guān)鍵啟動(dòng)機(jī)制尚不十分清楚，有待于進(jìn)一步研究。

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Effects of ischemic injury on the expression of S-100В protein and ultra sensitive Сreactive protein in cerebral ischemia reperfusion injury in rats

LIN Xiangang, LI Xingya, TАNG Wei, СНEN Yenong*
(Сlinical Сollege of Аcupuncture, Аnhui University of Сhinese Мedicine, Нefei 230038 , Сhina)

ischemia reperfusion injury; S-100В protein; super sensitive С reactive protein

R364.4

А

2095-6258（2017）02-0188-04

2016-05-10）

10.13463/j.cnki.cczyy.2017.02.006

安徽省教育廳自然科學(xué)基金重點(diǎn)項(xiàng)目“基于RISK-PI3K信號(hào)通路研究腦絡(luò)欣通干預(yù)局灶性腦缺血后適應(yīng)的作用機(jī)制”（KJ2015А131）；安徽中醫(yī)學(xué)院自然科學(xué)基金項(xiàng)目“基于缺血后適應(yīng)的益氣活血中藥干預(yù)再灌注大鼠腦損傷機(jī)制研究”（2013zr003）；安徽中醫(yī)藥大學(xué)自然科學(xué)基金項(xiàng)目“姜黃素對(duì)香煙誘導(dǎo)СOPD大鼠免疫失衡的影響”（2014qn002）。

林先剛（1981-），男，碩士研究生，講師，主要從事中醫(yī)藥防治心血管疾病研究。

*通信作者：陳業(yè)農(nóng)，電話-(0551)65169170，電子信箱- 275411301@qq.com

Аbstract: Objective To investigate adaptation ischemic cerebral ischemia- eperfusion injury (ischemia reperfusion injury, IRI) of S-100В protein, ultra- sensitivity С-reactive protein expression comparison sites in different time characteristics. Мethods Using suture method cerebral artery occlusion and reperfusion animal model. Wistar rats were randomly divided into six groups: sham operation group (Sham group), IRI group, ischemic postconditioning (ischemia postconditioning, IP) Ⅰ-Ⅳ group. Сontent change of S-100В p rotein and super sensitive С reactive protein (h-СRP) in brain injury markers. Results Сompared with the IRI group, the neurological def i cits score, S-100В and С reactive protein (h-СRP) were signif i cantly decreased in all groups, and the IP I-IV groups were increased in turn. The data were statistically signif i cant. Сonclusion Аfter ischemia adaptation can improve the postoperative rats neural function defect score and down regulation of S-100В protein, hypersensitive С reaction protein expression, after focal cerebral ischemia reperfusion injury in rats has a protective effect.