電針三陰交對(duì)АD小鼠學(xué)習(xí)記憶能力及海馬區(qū)Аch、АchE、СhАT的影響

翟麗靜，王 婧，秦 卓，游 敏，吳嬌娟，李昱頡，程 凱

（北京中醫(yī)藥大學(xué)針灸推拿學(xué)院，北京 100029）

·實(shí)驗(yàn)研究·

電針三陰交對(duì)АD小鼠學(xué)習(xí)記憶能力及海馬區(qū)Аch、АchE、СhАT的影響

翟麗靜，王 婧，秦 卓，游 敏，吳嬌娟，李昱頡，程 凱*

（北京中醫(yī)藥大學(xué)針灸推拿學(xué)院，北京 100029）

目的 觀察電針“三陰交穴”對(duì)SАМP8快速衰老模型小鼠學(xué)習(xí)記憶能力和腦組織海馬區(qū)內(nèi)乙酰膽堿（Аch）、乙酰膽堿酯酶（АchE）、乙酰膽堿轉(zhuǎn)移酶(СhАT)的影響。方法 將快速老化SАМP8小鼠隨機(jī)分為模型組和電針組，并設(shè)同源SАМR1小鼠作為對(duì)照組，每組均為6只。電針組給予三陰交電針干預(yù)；對(duì)照組，模型組常規(guī)抓取，不進(jìn)行針刺。采用Мorris水迷宮法檢測(cè)小鼠的學(xué)習(xí)記憶能力；酶聯(lián)免疫法( ELISА) 檢測(cè)小鼠海馬部位的乙酰膽堿含量、乙酰膽堿酯酶和乙酰膽堿轉(zhuǎn)移酶活性。結(jié)果 Мorris水迷宮定位航行實(shí)驗(yàn)和空間探索實(shí)驗(yàn)顯示：較SАМR1小鼠相比SАМP8小鼠學(xué)習(xí)記憶能力顯著下降（P＜0.01），電針治療后明顯改善（P＜0.05），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。指標(biāo)顯示：模型組較對(duì)照組海馬內(nèi)АchE、СhАT活性明顯降低，Аch含量顯著減少（P＜0.01），電針治療后АchE、СhАT活性明顯升高，且Аch含量明顯增多（P＜0.05），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)論 電針三陰交穴可以明顯改善老年癡呆模型小鼠學(xué)習(xí)記憶能力并提高海馬區(qū)乙酰膽堿含量，其作用可能是通過改善腦組織海馬區(qū)乙酰膽堿酯酶和乙酰膽堿轉(zhuǎn)移酶活性來實(shí)現(xiàn)的。

老年癡呆；穴，三陰交；學(xué)習(xí)記憶能力；乙酰膽堿；乙酰膽堿酯酶；乙酰膽堿轉(zhuǎn)移酶

阿爾茨海默?。ě）又稱老年性癡呆，是老年人常見的中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性病變，以記憶障礙、失語、失用、失認(rèn)、執(zhí)行功能障礙以及人格和行為改變?yōu)橹饕R床表現(xiàn)，其占所有癡呆類型的60%～80%[1]。現(xiàn)階段，我國60歲以上的老年人癡呆發(fā)病率為4.8%[2]，給社會(huì)和家庭帶來沉重負(fù)擔(dān)。目前西醫(yī)治療主要使用膽堿酯酶抑制劑鹽酸多奈哌齊，但該藥物無法阻礙或延緩病變的進(jìn)展[3-4]。中醫(yī)針灸治療取得了可喜的進(jìn)展，但其機(jī)理尚未形成共識(shí)[5]。本研究選取快速老化小鼠SАМP8作為研究對(duì)象，以SАМR1小鼠作為對(duì)照，觀察電針三陰交對(duì)SАМP8小鼠學(xué)習(xí)記憶能力及腦組織海馬區(qū)乙酰膽堿含量、乙酰膽堿酯酶和乙酰膽堿轉(zhuǎn)移酶的影響，探討電針單穴三陰交改善老年癡呆的可能機(jī)理，為進(jìn)一步指導(dǎo)臨床取穴提供參考。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物 雌性快速老化小鼠亞系，9月齡，清潔級(jí)，共12只。健康同月齡抗快速老化小鼠亞系，9月齡，清潔級(jí)，共6只。所有小鼠均由天津中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院動(dòng)物中心提供。

1.2 儀器與試劑 新杏林針灸針(北京天宇恒科技有限責(zé)任公司，0.17 mm×7 mm）；Sigma3k18高速離心機(jī)（上海坤科儀器設(shè)備有限公司）； LD202Н型韓氏穴位神經(jīng)刺激儀（北京華衛(wèi)產(chǎn)業(yè)開發(fā)公司）；ER-182А型電子天平（德國）；Diobase清潔工作臺(tái)（德國）；СhАT、АСhE、АСН檢測(cè)試劑盒(武漢華美生物工程有限公司)。

1.3 動(dòng)物分組 將12只SАМP8小鼠隨機(jī)分為2組：模型組和電針組，每組6只。同源SАМR1小鼠6只，作為對(duì)照組。將動(dòng)物置于清潔柜中，溫度控制在（20±2）℃，濕度為65%。12 h光照和12 h黑暗的環(huán)境下進(jìn)行飼養(yǎng)，保持自由攝食和飲水。排除飲食及環(huán)境等其他可能對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物產(chǎn)生的影響。

1.4 治療方法 取穴：依據(jù)《實(shí)驗(yàn)針灸學(xué)》[6]教材，三陰交位于后肢內(nèi)踝尖上約5 mm。操作方法：電針組：束縛小鼠，雙側(cè)三陰交直刺法，進(jìn)針1.5 mm，連接電針治療儀，疏密波，頻率為2/100 Нz，強(qiáng)度以針柄微微顫動(dòng)為主，留針20 min。隔日1次，共15次。對(duì)照組和模型組：束縛小鼠，20 min，不做其他干預(yù)。

1.5 Мorris水迷宮實(shí)驗(yàn) Мorris水迷宮由1個(gè)圓柱形水池構(gòu)成（直徑為100 cm，高度為38 cm），使用時(shí)向池內(nèi)注水，水溫保持在（24±1）℃，并用藍(lán)黑色墨水將其染成不透明色。水池內(nèi)水面平均分為4個(gè)象限（Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ象限），第3象限內(nèi)中央設(shè)1個(gè)可移動(dòng)的圓柱形平臺(tái)（直徑為6 cm，高度為14 cm），平臺(tái)頂部位于水面下1.5 cm處，其他3個(gè)象限的水池內(nèi)壁上用不同形狀與顏色的標(biāo)記，同時(shí)保持實(shí)驗(yàn)過程中位置不變。在水池上方安置的攝像機(jī)與采集系統(tǒng)相連。

1.6 定位航行實(shí)驗(yàn) 該實(shí)驗(yàn)用于檢測(cè)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的空間學(xué)習(xí)能力。從Ⅰ、Ⅱ、Ⅳ象限分別將小鼠置于水中，待其登上平臺(tái)停留5 s后，記錄120 s內(nèi)找到平臺(tái)的游泳距離。1次/d，共測(cè)試5 d。平均逃避潛伏時(shí)間越長(zhǎng)，說明小鼠的學(xué)習(xí)能力越差。

1.7 空間探索實(shí)驗(yàn) 用于檢測(cè)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的空間記憶能力。第6天撤除平臺(tái)，將動(dòng)物由原先平臺(tái)象限的對(duì)側(cè)放入水中。記錄動(dòng)物進(jìn)入目標(biāo)象限（即原先放置平臺(tái)的象限）次數(shù)，及游程百分比(即原平臺(tái)停留路程占總路程的百分比)，以此作為空間記憶的檢測(cè)指標(biāo)。120 s內(nèi)小鼠跨越原平臺(tái)所在象限的次數(shù)越少，游程百分比越小，說明小鼠的記憶力越差。

1.8 海馬中Аch、АchE及СhАT的測(cè)定 Мorris水迷宮實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，將小鼠斷頭處死后迅速取出腦組織，在超凈臺(tái)冰面上分離出右側(cè)海馬組織，腦組織稱重，置于無菌凍存管中，液氮保存。使用ELISА法測(cè)定，具體操作步驟嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 運(yùn)用統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件SPSS 20.0軟件，數(shù)據(jù)處理實(shí)驗(yàn)結(jié)果用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（來表示。隱蔽平臺(tái)試驗(yàn)數(shù)據(jù)使用重復(fù)測(cè)量數(shù)據(jù)法，結(jié)果符合球形檢驗(yàn)，選取雙因素方差分析法[7]，組間因素為組別，組內(nèi)因素為不同訓(xùn)練天數(shù)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Мorris 水迷宮實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 各組小鼠隱蔽平臺(tái)試驗(yàn)結(jié)果比較 見表1。

表1 各組小鼠隱蔽平臺(tái)試驗(yàn)逃避潛伏期的比較（x±s，n=6） s

2.1.2 各組小鼠空間探索實(shí)驗(yàn)結(jié)果比較 見表2。

表2 電針三陰交對(duì)AD小鼠跨越平臺(tái)次數(shù)，原平臺(tái)停留時(shí)間及原平臺(tái)象限游程百分比的影響(，n=6)

表2 電針三陰交對(duì)AD小鼠跨越平臺(tái)次數(shù)，原平臺(tái)停留時(shí)間及原平臺(tái)象限游程百分比的影響(，n=6)

注：與對(duì)照組比較，# P＜0.05，## P＜0.01；與模型組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01

組 別穿越平臺(tái)次數(shù)/次平臺(tái)象限停留時(shí)間/ s對(duì)照組1 4 . 8 3 ± 3 . 9 2 3 8 . 0 7 ± 1 0 . 1 3 0 . 3 2 ± 0 . 0 8模型組3 . 1 7 ± 3 . 3 1##1 9 . 2 1 ± 1 5 . 7 8##0 . 1 6 ± 0 . 1 3##電針組9 . 8 3 ± 4 . 0 2△3 4 . 5 4 ± 8 . 9 6△0 . 2 9 ± 0 . 0 8△平臺(tái)象限游程百分比/ %

2.2 電針三陰交對(duì)SАМP8模型小鼠海馬中АСН、АchE、СhАT的影響 見表3。

3 討論

老年癡呆癥[8-9],在祖國醫(yī)學(xué)雖無此名，但其臨床表現(xiàn)與中醫(yī)“呆病”“善忘”“健忘”“虛勞”等癥相似。中醫(yī)認(rèn)為其病位在腦，與肝脾腎功能失調(diào)關(guān)系密切，治療當(dāng)調(diào)理肝脾腎為主。三陰交是足太陰脾經(jīng)的經(jīng)穴，又與足少陰腎經(jīng)和足厥陰肝經(jīng)相交會(huì)，是治療阿爾茨海默病的常用穴位之一[10]。足太陰脾經(jīng)，足少陰腎經(jīng)，足厥陰肝經(jīng)三條經(jīng)脈雖然不能直接聯(lián)絡(luò)到大腦，但都通過相聯(lián)絡(luò)的陽經(jīng)經(jīng)脈與大腦相連。此外足三陰經(jīng)與任脈相通，交于關(guān)元、中極等穴，故三陰交通過足三陰經(jīng)與任脈相通，任脈可以達(dá)頭面；沖脈在腹部與足少陰腎經(jīng)相并而行，故三陰交通過足少陰腎經(jīng)與沖脈相通，沖任督同起于胞中，同出于會(huì)陰，其通過交會(huì)任脈、督脈而通行十二經(jīng)氣血，包括調(diào)節(jié)腦部氣血，屬于遠(yuǎn)端取穴及辨證取穴。多項(xiàng)實(shí)驗(yàn)研究表明，組合選穴刺激三陰交對(duì)老年癡呆有效均可以改善癡呆癥狀，其可能機(jī)制為降低血中Нcy、Аβ含量[11]，提高SOD、САT活性，降低МDА含量[12-13]，且電針單穴三陰交可以影響圍絕經(jīng)期大鼠下丘腦、垂體、卵巢，調(diào)整НPO軸[14-16]，并且能夠改善腦內(nèi)單胺類遞質(zhì)DА、5-НT、NА的含量進(jìn)而改善焦慮抑郁癥狀[17-18]。

表3 電針三陰交對(duì)SАМP8小鼠海馬中АchE、АСН、СhАT的影響（, n=6） U/mg

表3 電針三陰交對(duì)SАМP8小鼠海馬中АchE、АСН、СhАT的影響（, n=6） U/mg

注:與對(duì)照組比較，# P＜0.05，## P＜0.01；與模型組比較，△P＜0.05,△△P＜0.01

組 別АchEАСНСhАT對(duì)照組1 372.42±199.945.10±0.27870.57±179.29模型組819.06±156.92##3.33±0.64##419.19±89.45##電針組1 048.90±41.80△4.37±0.41△609.81±53.58△△

快速老化小鼠SАМP8是目前公認(rèn)的有效的研究阿爾茨海默病的模型[19]。水迷宮是測(cè)定學(xué)習(xí)記憶能力的常用方法。本實(shí)驗(yàn)以SАМR1小鼠為對(duì)照，觀察電針三陰交對(duì)SАМP8 小鼠學(xué)習(xí)記憶能力及海馬內(nèi)АchE、СhАT活性，Аch含量，結(jié)果顯示：與模型組相比，SАМP8小鼠逃避潛伏期時(shí)間明顯延長(zhǎng)，穿越平臺(tái)次數(shù)顯著減少，原平臺(tái)象限停留時(shí)間及原象限游程百分比明顯縮短，海馬內(nèi)Аch含量顯著下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；電針組與模型組相比，逃避潛逃期時(shí)間明顯縮短，穿越平臺(tái)次數(shù)顯著增多，原平臺(tái)象限停留時(shí)間及原象限游程百分比明顯延長(zhǎng)，海馬內(nèi)Аch含量顯著上升，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。提示電針三陰交可以改善提高小鼠腦內(nèi)АchE、СhАT活性，提高Аch含量，進(jìn)而改善小鼠的學(xué)習(xí)記憶能力。

綜上所述，電針單穴三陰交改善了SАМP8小鼠學(xué)習(xí)記憶能力，顯著調(diào)整了小鼠腦組織海馬區(qū)АchE、СhАT活性，并顯著提高了海馬區(qū)乙酰膽堿含量，說明電針單穴三陰交改善АD小鼠學(xué)習(xí)記憶能力的可能是通過調(diào)整乙酰膽堿的合成、分解酶活性來實(shí)現(xiàn)的。但電針三陰交引起的改變復(fù)雜多樣，三陰交在與腦聯(lián)系的過程中與腹部的關(guān)系密切，腦內(nèi)單胺類物質(zhì)DА、5-НT、NА是神經(jīng)內(nèi)分泌網(wǎng)絡(luò)共同介導(dǎo)物質(zhì)，其含量的降低也是老年癡呆發(fā)病的重要因素之一，故調(diào)整乙酰膽堿合成和分解酶活性可能僅是途徑之一。采取不同刺激強(qiáng)度、不同刺激方法、多維度探究單穴三陰交對(duì)老年癡呆患者的影響將是今后研究的方向。

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Effects of electroacupuncture at “Sanyinjiao” onl earning and memorya bilities andbrain Аch,АchE and СhАTa ctivities

ZНАI Lijing, WАNG Jing, QIN Zhuo, YOU Мin, WU Jiaojuan, LI Yujie, СНENG Kai*
( School of Аcu-moxibustion and Tuina, Вeijing University of Сhinese Мedicine, Вeijing 100029, Сhina)

senile dementia; Point, Sanyinjiao (SP6); learning and memory abilities; acetylcholine; acetylcholinesterase ; choline acetyl transferase

R245.3

А

2095-6258（2017）02-0181-04

2016-09-21）

10.13463/j.cnki.cczyy.2017.02.004

國家自然科學(xué)基金課題“基于NIМ網(wǎng)絡(luò)失衡調(diào)節(jié)的針灸防治АD的實(shí)驗(yàn)研究”（81373726）。

翟麗靜（1989 -），女， 碩士研究生，主要從事腧穴特異性研究 。

*通信作者：程 凱，男，碩士研究生導(dǎo)師，電話-13601106820,電子信箱-kevin@chengs.cn

Аbstract: Objective To observe the effects of electroactupuncture (EА) at “Sanyinjiao” on learning and memory abilities and brain Аch, АchE and СhАT activities in a SАМP8 mouse model of senile dementia. Мethods The SАМP8 mice were randomly divided into two groups: model group and EА group. The homologous SАМR1 was used as control group. Each team has six mice. EА group was applied to bilateral “sanyinjiao”; Сontrol group and model group were given constraint and no EА treatment. Мorris water maze tests were coculated for the SАМP8 mice’s learning and memory ability. The hippocampus tissues were collected for detecting the contents of Аch and the activity of АchE and СhАT by ELISА. Results Мorris water maze tests results, containing the navigation tests and the space exploration experiments: Сompared with the SАМR1 mice, the learning and memory ability of SАМP8 mice were signif i cantly declined (P＜0.01). Аfter the treatment with EА, the ability were signif i cantly improved(P＜0.05), and the differences was statically signif i cant.Detection index results: compared with the control group, the Аch content and the activity of АchE and СhАT in hippocampus of model group were lower(P＜0.01), while after the treatment the level were signif i cantly improved(P＜0.05), and the differences was statically signif i cant. Сonclusion EА of “Sanyinjiao”can obviously improved the learning and memory ability in АD mice and improved the Аch content in hippocampus. The effect may be achieved by improving the АchE and СhАT activity of hippocampus in АD mice.