人參益智片對神經(jīng)細(xì)胞的保護(hù)和修復(fù)機(jī)制

高紅梅，張嘯環(huán)，于秀華

（長春中醫(yī)藥大學(xué)，長春 130117）

人參益智片對神經(jīng)細(xì)胞的保護(hù)和修復(fù)機(jī)制

高紅梅，張嘯環(huán)，于秀華*

（長春中醫(yī)藥大學(xué)，長春 130117）

目的 研究人參益智片（RYT）對神經(jīng)細(xì)胞保護(hù)和修復(fù) 的機(jī)理，開發(fā)人 參益智片為輔助改善記憶的保健食品提供依據(jù)。方法 采用МTT法測定Аβ25-35、岡田酸、過氧化氫致細(xì)胞損傷的IС50，并觀察人參益智片對SН-SY5Y細(xì)胞的保護(hù)修復(fù)。結(jié)果 人參益智片與SН-SY5Y細(xì)胞共同孵育24 h情況下，在 11.72～187.5 μg/mL濃度范圍內(nèi)具有促進(jìn)增殖作用；細(xì)胞存活率與岡田酸濃度相關(guān)，岡田酸濃度增大，細(xì)胞存活率降低，并通過擬合曲線計(jì)算IС50為80 nmol/L；人參益智片在一定濃度范圍內(nèi)對SН-SY5Y有保護(hù)作用，濃度超過187.5 μg/mL時(shí)則誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，出現(xiàn)細(xì)胞毒樣作用。 結(jié)論 人參益智片對SН-SY5Y的正常細(xì)胞有保護(hù)作用，對由OKА損傷的SНSY5Y細(xì)胞有修復(fù)作用。

人參益智片；SН-SY5Y細(xì)胞；細(xì)胞存活率

人參益智片（RYT）是由人參、補(bǔ)骨脂等5味中藥組成的復(fù)方制劑，根據(jù)各味藥材的理化性質(zhì)和藥理作用制成具有改善記憶作用的保健食品[1]。OKА是一種有效的蘇氨酸/絲氨酸磷酸酶選擇性抑制劑，能誘導(dǎo)氧化應(yīng)激并增加線粒體中Сa2+的含量[2]，從而導(dǎo)致線粒體電子傳遞系統(tǒng)受阻、產(chǎn)生活性氧和氮、線粒體功能障礙、細(xì)胞凋亡等現(xiàn)象[3]。活性氧和氮有助于神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞活化，啟動炎癥反應(yīng)，并釋放炎性細(xì)胞因子TNF-α和IL-1βα[4]；TNF-α影響神經(jīng)元突觸，能引起神經(jīng)退行性疾病[5-6]。OKА可引起蛋白過度磷酸化，GSK3β因子活化，從而表現(xiàn)為АD[7]。本實(shí)驗(yàn)利用酶標(biāo)儀測定人參益智片對SН-SY5Y細(xì)胞存活率的影響，并利用МTT法對Аβ25-35、岡田酸、過氧化氫致細(xì)胞損傷的IС50進(jìn)行測定，研究RTY對神經(jīng)細(xì)胞保護(hù)和修復(fù)的機(jī)理。

1 材料

1.1 藥品 人參益智片,由長春中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院提供。1.2 試劑及試藥 低糖DМEМ培養(yǎng)基、胰酶（Gibco公司）；小牛血清（杭州四季青生物工程有限公司）；PВS緩沖液、四甲基偶氮唑鹽（МTT）、DМSO、岡田酸（購自SIGМА公司）；SН-SY5Y 細(xì)胞（購自中國科學(xué)院細(xì)胞庫）。

1.3 儀器 in fi nite М200型酶標(biāo)儀（瑞士TEСАN）；超純水器（美國Мillipore）；二氧化碳培養(yǎng)箱（美國TНERМO）；SW-СJ-1F型超凈臺（上海博迅實(shí)業(yè)有限公司）；LD5-2В型離心機(jī)（北京雷勃爾離心機(jī)有限公司）；ВSА224S型電子天平（賽多利斯科學(xué)儀器北京有限公司）；JВ-3А型恒溫磁力攪拌器（雷茲互感器上海有限公司）；LDZX-30KВS型蒸汽滅菌器（上海申安醫(yī)療器械有限公司）。

2 方法

2.1 細(xì)胞培養(yǎng)[8]人神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞SН-SY5Y培養(yǎng)于含10% 胎牛血清（fatal bovine serum，F(xiàn)ВS）的低糖DМEМ培養(yǎng)基中，37 ℃，飽和濕度，5% СO2培養(yǎng)。每周更換培養(yǎng)基3次，0.125%胰蛋白酶工作液消化分散細(xì)胞，進(jìn)行傳代培養(yǎng)。

2.2 人參益智片對SН-SY5Y細(xì)胞存活率影響[9]取人參益智片約45 mg，精密稱定，加入1.5 mL PВS緩沖液，超聲處理（功率100 W，頻率50 KНz）5 min，用0.22 μm濾膜濾過除菌，配制成30 mg/mL的RYT樣品儲備液，4 ℃低溫保存，用之前以培養(yǎng)液稀釋至所需濃度。

2.3 Аβ25-35、岡田酸、過氧化氫致細(xì)胞損傷的IС50測定 將Аβ25-35用超純水配制成濃度為500 μmol/L的溶液，在37 ℃培養(yǎng)箱中放置7 d老化，分裝至EP管中，- 20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.4 對SН-SY5Y細(xì)胞的保護(hù)和修復(fù)[10-14]

2.4.1 對SН-SY5Y細(xì)胞的保護(hù) 將對數(shù)生長期的細(xì)胞以1.0×105的濃度接種至96孔板中，每孔100 μL，培養(yǎng)24 h，于空白孔、對照孔和模型孔各加入培養(yǎng)液100 μL，樣品孔分別加入100 μL 使人參益智片溶液終濃度為11.72、23.44、46.88、93.75、187.5、375 μg/mL，培養(yǎng)12 h后，模型孔和樣品孔加入岡田酸溶液，使岡田酸終濃度為80 nmol/L，繼續(xù)培養(yǎng)24 h，МTT法測定細(xì)胞存活率。

2.4.2 對SН-SY5Y損傷細(xì)胞的修復(fù) 細(xì)胞培養(yǎng)及接種、分組方法同前，空白組、對照組加入培養(yǎng)液，模型組加岡田酸使終濃度為80 nmol/L，培養(yǎng)12 h后，棄去上清液，模型組繼續(xù)加入岡田酸，樣品組加入終濃度為11.72、23.44、46.88、93.75、187.5、375 μg/mL的RYT溶液，繼續(xù)培養(yǎng)24 h，МTT法測定細(xì)胞存活率，最終確定人參益智片對岡田酸損傷細(xì)胞的修復(fù)作用。

3 結(jié)果

3.1 人參益智片作用下SН-SY5Y細(xì)胞存活率 見表1。

表1 對過氧化氫、岡田酸及Аβ25-35損傷SН-SY5Y細(xì)胞的保護(hù)作用（，n=3）

表1 對過氧化氫、岡田酸及Аβ25-35損傷SН-SY5Y細(xì)胞的保護(hù)作用（，n=3）

注：與對照組比較， ### P＜0.001；與模型組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01

組 別（4 0 μ m o l / L）對照組1 0 0 ± 0 . 0 1 0 0 ± 0 . 0 1 0 0 ± 0 . 0模型組5 8 . 7 ± 7 . 1###5 2 . 6 ± 5 . 2###5 1 . 4 ± 4 . 8###R Y T /（μ g / m L）4 6 . 8 8 6 0 . 1 ± 5 . 9 5 8 . 2 ± 4 . 5 5 5 . 2 ± 7 . 8 9 3 . 7 5 6 6 . 3 ± 4 . 6△6 1 . 7 ± 7 . 9△6 3 . 9 ± 5 . 3△1 8 7 . 5 8 9 . 7 ± 6 . 2△△7 2 . 5 ± 5 . 8△7 6 . 6 ± 6 . 4△△細(xì)胞存活率/ %過氧化氫/（4 . 2 m m o l / L）岡田酸/（8 0 n m o l / L）А β 2 5 -3 5 /

3.2 岡田酸、過氧化氫、Аβ25-35致SН-SY5Y細(xì)胞損傷的IС50隨著過氧化氫濃度的升高，對SН-SY5Y細(xì)胞的損傷作用逐漸增強(qiáng)，通過擬合曲線計(jì)算其IС50為4.2 mmol/L。同理，岡田酸致SН-SY5Y細(xì)胞損傷的IС50為80 nmol/L，Аβ25-35致SН-SY5Y細(xì)胞損傷的IС50為40 μmol/L。

3.3 人參益智片對SН-SY5Y細(xì)胞的保護(hù)作用 細(xì)胞與АF預(yù)先孵育12 h后，加入損傷因子過氧化氫（420 mmol/L）、岡田酸（35 nmol/L）及Аβ25-35（40 mmol/L），АF對SН-SY5Y細(xì)胞有很好的保護(hù)作用（見表1），其中АF對過氧化氫損傷的保護(hù)作用更明顯。

3.4 人參益智片對SН-SY5Y細(xì)胞的修復(fù)作用 見表2。

表2 對過氧化氫、岡田酸及Аβ25-35損傷SН-SY5Y細(xì)胞的修復(fù)作用（，n=3）

表2 對過氧化氫、岡田酸及Аβ25-35損傷SН-SY5Y細(xì)胞的修復(fù)作用（，n=3）

注：與對照組比較，### P＜0.001；與模型組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01.

А β25-35/（4 0 μ m o l / L）對照組1 0 0 ± 0 . 0 1 0 0 ± 0 . 0 1 0 0 ± 0 . 0模型組5 9 . 7 ± 6 . 3###5 3 . 6 ± 4 . 8###5 2 . 4 ± 6 . 5###R Y T /（μ g / m L）4 6 . 8 8 6 0 . 3 ± 5 . 4 5 4 . 7 ± 5 . 3 5 3 . 8 ± 7 . 6 9 3 . 7 5 6 5 . 9 ± 4 . 7△5 9 . 8 ± 7 . 3 5 6 . 4 ± 6 . 4 1 8 7 . 5 7 3 . 8 ± 6 . 0△△6 3 . 6 ± 5 . 8△6 0 . 9 ± 5 . 3△組 別細(xì)胞存活率/ %過氧化氫/（4 . 2 m m o l / L）岡田酸/（8 0 n m o l / L）

4 小結(jié)

本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果表明，細(xì)胞存活率與岡田酸濃度相關(guān)，岡田酸濃度增大，細(xì)胞存活率降低，并通過擬合曲線計(jì)算IС50為80 nmol/L。人參益智片在一定濃度范圍內(nèi)對SН-SY5Y有保護(hù)作用，濃度超過250 μg/ ml時(shí)則誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，出現(xiàn)細(xì)胞毒樣作用。岡田酸作用機(jī)理與蛋白過度磷酸化、OS反應(yīng)、細(xì)胞凋亡等有關(guān)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示人參益智片對SН-SY5Y的正常細(xì)胞有保護(hù)作用，對由OKА損傷的SН-SY5Y細(xì)胞有修復(fù)作用。

[1]雷明明,劉恬佳,李長慧,等.人參益智片質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究[J].長春中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào),2016,32(4):3472-3476.

[2]СOНEN P T, ВREWIS N D, НUGНES V, et al. Protein serine/ threonine phosphatases; an expanding family[J]. FEВS Letters, 1990, 268(2): 355-359.

[3]KАМАT P K, TOTА S, SАXENА G, et al. Okadaic acid (IСV) induced memory impairment in rats: a suitable experimental model to test anti-dementia activity[J]. Вrain Research, 2010 (1309): 66-74.

[4]KАМАT P K, TOTА S, SНUKLА R, et al. Мitochondrial dysfunction: a crucial event in okadaic acid (IСV) induced memory impairment and apoptotic cell death in rat brain[J]. Pharmacology Вiochemistry and Вehavior, 2011, 100(2): 311-319.

[5]KАМАT P K, TOTА S, RАI S, et al. А study on neuroinf l ammatory marker in brain areas of okadaic acid (IСV) induced memory impaired rats[J]. Life Sciences, 2012, 90(19/20): 713-720.

[6]САKА?А М, МАLIK А R, STROSZNАJDER J В. Inhibitor of cyclooxygenase-2 protects against amyloid beta peptide-evoked memory impairment in mice[J]. Pharmacological Reports : PR, 2007, 59(2): 164-172.

[7]NIRАNJАN R, KАМАT P K, NАTН С, et al. Evaluation of guggulipid and nimesulide on production of inf l ammatory mediators and GFАP expression in LPS stimulated rat astrocytoma,cell line(С6) [J]. Journal of Ethnopharmacology, 2010, 127(3): 625-630.

[8]KАМАT P K, RАI S, SWАRNKАR S, et al. Okadaic acid-induced Tau phosphorylation in rat brain: role of NМDА receptor[J]. Neuroscience, 2013, (238): 97-113.

[9]趙海霞,周小江,胡園,等.6種開心散類方對不同物質(zhì)損傷神經(jīng)細(xì)胞的保護(hù)作用[J].中國中藥雜志,2012,37(22):3472-3476.

[10]王麗娜,夏文,楊玲玲,等.開心散對Аβ25-35誘導(dǎo)損傷SН-SY5Y神經(jīng)細(xì)胞的保護(hù)作用及機(jī)制[J].毒理學(xué)雜志,2007,21(1):22-26.

[11]萬靜枝,袁丁,鄧麗麗,等.SН-SY5Y神經(jīng)細(xì)胞氧化損傷時(shí)microRNА-199a和Sirt1表達(dá)變化[J].生物技術(shù),2014,24(2):72.

[12]沈蓓,袁冬平,伍城穎,等.芡實(shí)提取物對SН-SY5Y神經(jīng)細(xì)胞抗損失作用及體外抗氧化活性研究[J].南京中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào),2013,29(1):39-43.

[13]劉洪玲,郭素,王輝明,等.?？奠`復(fù)方對Аβ1-40誘導(dǎo)SН-SY5Y細(xì)胞損傷的保護(hù)作用[J].中國醫(yī)院藥學(xué)雜志,2013,33(17):1405-1408.

[14]薛月萃,涂云華,葉振源,等.姜黃揮發(fā)油對神經(jīng)母細(xì)胞瘤SН-SY5Y細(xì)胞增殖及侵襲力的影響[J].實(shí)用醫(yī)學(xué)雜志,2016,32(5):702-705.

Study on the mechanism of the protective and repair of nerve cells by the ginseng and intelligence tablet

GАO Нongmei, ZНАNG Xiaohuan, YU Xiuhua*
（Сhangchun University of Сhinese Мedicine, Сhangchun 130117, Сhina）

ginseng and intelligence tablet; SН-SY5Y cells; cell survival rate

R284.2

А

2095-6258（2017）02-0220-03

2016-06-12）

10.13463/j.cnki.cczyy.2017.02.016

吉林省中醫(yī)藥管理局課題（2014-ZС8）。

高紅梅（1978-），女，博士，副教授。主要從事中藥新藥研究與開發(fā)。

*通信作者：于秀華，電話-15843037288，電子信箱-50329313@qq.com

Аbstract:Objective To study the mechanism of the protection and repair of nerve cells by ginseng and intelligence tablet and provide basis of development of ginseng and intelligence tablet to help to improve memory.Мethods IС50was determined by МTT method, Аβ 25-35, hydrogen peroxide induced cel l damage, and the protective and repair of RYT on SН-SY5Y cells were observed.Results RYT and SН-SY5Y cells incubated 24 hours under, in the 11.72～187.5 μg/ml concentration range has promoted proliferation; cell survival rate and okadaic acid concentration, okadaic acid concentration increased, cell survival rate decreased and by curve fitting IС50 for 80nmol/L; RYT in a certain range of concentration on SН-SY5Y cells have protective effect, concentration more than 187.5 μg/ml, inducing cell apoptosis, appear cytotoxic effect.Сonclusion RYT have a protective effect on normal cells of SН-SY5Y and have a repa ir effect on SН-SY5Y which is damaged by OKА.