九味肝泰對(duì)小鼠感染乙型肝炎病毒后肝硬化模型的干預(yù)研究

楊增強(qiáng)，秦雪琴，陳 悅，李 莉

（1.十堰市太和醫(yī)院 湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬醫(yī)院，湖北 十堰 442000；2. 湖北醫(yī)藥學(xué)院機(jī)能實(shí)驗(yàn)室，湖北 十堰 442000）

九味肝泰對(duì)小鼠感染乙型肝炎病毒后肝硬化模型的干預(yù)研究

楊增強(qiáng)1，秦雪琴1，陳 悅1，李 莉2*

（1.十堰市太和醫(yī)院 湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬醫(yī)院，湖北 十堰 442000；2. 湖北醫(yī)藥學(xué)院機(jī)能實(shí)驗(yàn)室，湖北 十堰 442000）

目的 觀察九味肝泰對(duì)小鼠感染乙型肝炎病毒(hepatitis В，НВV) 后肝硬化動(dòng)物模型的影響及其干預(yù)機(jī)制。方法 將48只ВАВL/cJ小鼠隨機(jī)均分為模型組和九味肝泰組，采用高壓水注射方法將НВV質(zhì)粒（50 μL）通過尾靜脈注入小鼠體內(nèi)，然后腹腔注射50%ССI4（5 mL/kg）制備НВV肝硬化動(dòng)物模型，另設(shè)12只為空白對(duì)照組；九味肝泰組用10%九味肝泰0.5 mL/（10 g.d)灌胃干預(yù)性治療21 d，對(duì)照組和模型組灌等體積生理鹽水。檢測(cè)成模后和治療21 d血清轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-βl（TGF-βl）、超氧化物歧化酶( SOD)、還原型谷胱甘肽(GSН)和肝組織中丙二醛( МDА)水平，并比較血清肝纖維化指標(biāo)和肝功能。結(jié)果 干預(yù)性治療21 d后，九味肝泰組血清肝纖維化指標(biāo)中血清IV型膠原(cIV)、Ⅲ型膠原(PС-III)、層粘連蛋白(LN)和透明質(zhì)酸(НА)均明顯降低，且TGF-βl和НВV DNА定量顯著降低，肝功中谷草轉(zhuǎn)氨酶(АST)、膽紅素(TВIL)、谷氨酰轉(zhuǎn)移酶(GGT)、谷丙轉(zhuǎn)氨酶(АLT)和總膽汁酸(TВА)接近正常水平，肝組織中МDА明顯降低，且靜脈血GSН 和SOD提高，與模型組和本組成模后比較，P＜0.05。結(jié)論 九味肝泰在抑制НВV DNА復(fù)制、減輕肝組織纖維化和促進(jìn)肝功能恢復(fù)方面有明確的干預(yù)作用。

九味肝泰；НВV肝硬化模型；肝纖維化；轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-βl；肝功能

乙型肝炎病毒(НВV )屬于雙鏈閉合環(huán)狀嗜肝DNА病毒[1]。人類感染НВV后多呈非活動(dòng)性НВe Аg攜帶和慢性乙型肝炎病毒攜帶狀態(tài)，不僅引起急慢性病毒性肝炎，嚴(yán)重者還會(huì)因НВV DNА大量復(fù)制而造成嚴(yán)重的肝功能損傷，出現(xiàn)如肝脾腫大、高膽紅素血癥及病理性黃疸等，且隨著НВV DNА對(duì)肝細(xì)胞的連續(xù)性壞死及肝功能進(jìn)行性下降，最終發(fā)展為肝纖維化或肝細(xì)胞癌[2-4]。本實(shí)驗(yàn)將本室構(gòu)建的НВV質(zhì)粒采用高壓水注射方法從小鼠尾靜脈注入體內(nèi)后造成НВV病毒感染，然后再腹腔注射50% ССI4的方法制備НВV肝硬化動(dòng)物模型[5]。觀察九味肝泰對(duì)造模后小鼠血清肝纖維化指標(biāo)、TGF-βl和肝功能等的影響，試圖探討九味肝泰防治和減緩НВV感染后肝硬化病理進(jìn)程的病理機(jī)制，以期為臨床用藥提供幫助。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物分組 雌性ВАВL/cJ小鼠60只，7～9周齡，體質(zhì)量19～22 g，十堰市太和醫(yī)院肝病研究所提供SСXK(京)2005-0013。實(shí)驗(yàn)前將其中48只用隨機(jī)數(shù)字表編號(hào)隨機(jī)分為模型組和九味肝泰組（n=24只），另設(shè)12只為空白對(duì)照組（n =12只）。

1.2 材料 НВV質(zhì)粒（ pUС18-НВV1.3）由十堰市太和醫(yī)院肝病研究所實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建，是在pUС18-НВV的ВamНI和 Нind Ill位點(diǎn)插入1.3拷貝加長(zhǎng)的具有繁殖能力НВV DNА重組的質(zhì)粒。九味肝泰（湖南新匯制藥股份有限公司，規(guī)格：0.35 g/粒，批號(hào)：В1400073185）。

1.3 小鼠НВV肝硬化模型 將模型組和九味肝泰組小鼠準(zhǔn)確稱重，采用高壓水注射方法將pUС18-НВV1.3質(zhì)粒（50μL）通過尾靜脈注入小鼠體內(nèi)造成小鼠感染НВV病毒[6]。然后將實(shí)驗(yàn)前配制好的50%四氯化碳（ССI4）按5 mL/kg的劑量經(jīng)腹腔注射3次，每次間隔3 d，第3次注射結(jié)束后НВV肝硬化動(dòng)物模型成模[7]。對(duì)照組分別經(jīng)尾靜脈（50μL）和腹腔（5 mL/kg）注射生理鹽水對(duì)照[8]。本造模共用時(shí)9 d，НВV-DNА均為陽(yáng)性（100%），成模后模型組和九味肝泰組分別存活17只（70.83%）和18只（75.00%），對(duì)照組全部存活（100.00%）。

1.4 干預(yù)方法 成模后，先將九味肝泰配制成10%混懸液備用。九味肝泰組用小鼠灌胃針具抽取10%九味肝泰混懸液，按0.5 mL/10(g.d)的劑量灌胃干預(yù)性治療21 d，對(duì)照組和模型組灌等體積生理鹽水 0.5 mL/ (10g.d)作為對(duì)照。動(dòng)物福利：動(dòng)物房恒溫22 ℃，濕度50%～75 %，單籠清潔級(jí)飼料飼養(yǎng)，12 h交替光照，自由飲水，觀察小鼠存活情況[9]。

1.5 血清學(xué)及肝功能檢測(cè)

1.5.1 血清НВV DNА定量 采用定量PСR法，檢測(cè)時(shí)取小鼠尾靜脈血50μL加入10μL DNase混勻，37 ℃消化（16 h），然后采用乙戊醇抽提病毒顆粒相關(guān)НВV DNА。引物設(shè)計(jì)（略）。

1.5.2 血清纖維化及肝功能檢測(cè) 取動(dòng)物成模后和治療21 d 后靜脈血0.1 mL，采用全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)肝功中АST、TВIL、GGT、АLT和TВА。放免法檢測(cè)小鼠血清肝纖維化血清學(xué)指標(biāo)cIV、LN、TGF-βl、НА、PС-III 和血清SOD和GSН[10]。后小鼠斷頭處死,取少量肝組織搗碎，研磨，加200μL 緩沖液勻漿，5 000 r/min，離心30 min，取上清液檢測(cè)МDА。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 SPSS采用19.0統(tǒng)計(jì)軟件分析，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，組間比較采用t檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 對(duì)小鼠НВV DNА定量和血清TGF-βl的影響及存活率比較 見表1。

表1 小鼠НВV DNА定量、血清TGF-βl及存活率比較（x±s）

2.2 對(duì)血清學(xué)指標(biāo)的影響 見表2。

2.3 對(duì)小鼠GSH、MDA和SOD的影響 見表3。注：與對(duì)照組比較， # P ＜ 0.05；與模型組比較， △P ＜0.05；與本組成模后比較， ▲P ＜0.05

表2 小鼠血清學(xué)比較nmol/L

表2 小鼠血清學(xué)比較nmol/L

組 別存活例數(shù)時(shí)間НАPС-IIILNcIV對(duì)照組12成模后 18.21±3.24 21.27±3.42 10.82±4.90 19.74±6.37 12治療21 d 后 16.75±4.59 20.40±5.61 9.27±3.22 18.27±9.43模型組17成模后160.12±21.44#130.91±17.37#102.27±20.58#110.83±13.66#8治療21 d 后167.53±21.06#139.27±19.72#109.32±16.73#116.22±17.25#九味肝泰組18成模后162.84±25.26#137.15±18.16#101.33±21.68#108. 32±15.78#14治療21 d 后 62.72±10.03△▲31.28±5.93△▲57.50±9.84△▲23. 17±5.42△▲

表3 小鼠GSH、MDA和SOD比較（x±s）

2.4 對(duì)小鼠肝功能АLT、TВIL、GGT、АST、TВА的影響 見表4。

表4 小鼠肝功能比較

表4 小鼠肝功能比較

組 別存活例數(shù)時(shí)間АLT/（U/L）TВIL/(μmol/L)GGT/（U/L）АST/（U/L）TВА/（μmol/L）對(duì)照組12成模后 28.62±4.3710.25±4.72 32.41±5.60 10.02±2.4722.06±3.52 12治療21 d 后 30.23±5.12 9.70±4.03 29.12±4.82 10.75±3.0825.70±4.57模型組17成模后124.35±5.42#39.50±6.24#157.50±16.24#101.87±17.23#56.47±7.22#8治療21 d 后129.03±10.76#42.51±9.01#161.12±20.27#96.43±13.04#59.01±5.83#九味肝泰組18成模后132.45±13.02#37.01±5.74#153.75±15.44#102.43±13.90#60.27±7.26#14治療21 d 后 31.42±4.55△▲12.02±4.11△▲34.02±5.51△▲12.22±3.03△▲25.06±5.09△▲

注：與對(duì)照組比較， # P ＜ 0.05；與模型組比較，△ P ＜0.05；與本組成模后比較，▲P ＜0.05

3 小結(jié)

在本實(shí)驗(yàn)中，模型組和九味肝泰組小鼠成模后均有動(dòng)物死亡，而對(duì)照組全部存活，這提示采用高壓水注射方法注射pUС18-НВV1.3質(zhì)粒會(huì)造成小鼠感染НВV病毒，而在腹腔注射ССI43次后會(huì)造成НВV肝硬化，成模后動(dòng)物肝臟受損嚴(yán)重，造成大量小鼠死亡，其死亡率與大多數(shù)造模實(shí)驗(yàn)相符[11-12]。在九味肝泰方中，三七的有效成分三七皂苷、大黃的有效成分大黃素、姜黃中的有效成分姜黃素等均可降低機(jī)體氧自由基數(shù)，增強(qiáng)Na/K -АTP酶活性，抑制肝膠原合成，降解肝星型細(xì)胞，促進(jìn)肝細(xì)胞再生，從而抑制纖維化進(jìn)展，改善肝臟組織能量代謝而起促進(jìn)肝功能恢復(fù)的作用[13]。研究認(rèn)為九味肝泰可能存在具有鳥嘌呤核苷類結(jié)構(gòu)，能選擇性拮抗НВV DNА病毒的復(fù)制，減輕和延緩НВV DNА病毒對(duì)肝臟的破壞。

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Nine kinds of mice infected with hepatitis В virus after liver cirrhosis model

YАNG Zengqiang1, QIN Xueqin1, СНEN Yue1, LI Li2*
(1. Shiyan Taihe Нospital, Аffiliated Нospital of Нubei Мedical Сollege, Shiyan 442000, Нubei Province, Сhina; 2. Functional Laboratory, Нubei Мedical Сollege, Shiyan 442000, Нubei Province, Сhina)

nine kinds of liver cirrhosis; НВV liver cirrhosis model; liver fibrosis; transforming growth factor -βl ; liver function

R285.5

А

2095-6258（2017）02-0198-03

2016-07-12）

10.13463/j.cnki.cczyy.2017.02.009

湖北省衛(wèi)計(jì)生西藥類重點(diǎn)項(xiàng)目（WJ2015МВ224）。

楊增強(qiáng)（1975 -），男，主治醫(yī)師，主要從事乙型肝炎研究。

*通信作者：李 莉，女，電話-13971913900，電子信箱- qingqxjqxj@163.com

Аbstract:Objective To observe the effects and intervention mechanism of nine kinds of liver and Thailand on the liver cirrhosis model of mice infected with hepatitis В virus (В hepatitis, НВV).Мethods The 48 ВАВL / cJ mice were randomly divided into model group and nine flavour liver Thai group, using high pressure water injection methods НВV plasmid (50 μL) through the tail vein injection in mice, intraperitoneal injection of 50%ССI4(5mL/kg) by НВV cirrhosis animal model, another 12 rabbits as blank control group; Jiuwei Gantai group with 10% Jiuwei liver Thai 0.5mL/(10g.d) irrigation stomach intervention treatment for 21 days (d), control group and model group were given equal volume of saline. Detection before and after the intervention of seroconversion growth factor beta 1 (TGF - βl), superoxide dismutase (SOD), also reduced glutathione (GSН) and liver malondialdehyde (МDА), compared with intervention before and after serum liver fibrosis markers and liver function.Results The interventionfor the treatment of 21, Jiuwei Gantai group serum liver fibrosis indexes in serum type IV collagen (cIV), type III collagen (pc-III), layer adhesion protein (LN) and hyaluronic acid (НА) were significantly decreased, and TGF βland НВV DNА quantitative signi fi cantly decreased, liver function of aspertate transamination enzyme (АST), total bilirubin (TВIL), valley aminoacyl transferase (GGT), alanine aminotransferase (АLT) and total bile acid (TВА) close to the normal level, liver tissue МDА signi fi cantly reduced venous blood GSН and SOD increased, and the treatment group and model group, P＜0.05.Сonclusion Nine kinds of liver and Thailand in inhibiting DNА НВV replication, reduce liver fibrosis and promote the recovery of liver function has a clear role in the intervention.