益腎排毒方對(duì)腺嘌呤致慢性腎衰竭大鼠腎間質(zhì)纖維化的影響

栗 睿，王鵬飛，楊秀煒

（遼寧省中醫(yī)藥研究院 遼寧中醫(yī)藥大學(xué)附屬第 二醫(yī)院腎病科，沈陽(yáng) 110034）

益腎排毒方對(duì)腺嘌呤致慢性腎衰竭大鼠腎間質(zhì)纖維化的影響

栗 睿，王鵬飛，楊秀煒*

（遼寧省中醫(yī)藥研究院 遼寧中醫(yī)藥大學(xué)附屬第 二醫(yī)院腎病科，沈陽(yáng) 110034）

目的 探討益腎排毒方抗腎纖維化的機(jī)制，為中藥復(fù)方防治腎纖維化提供依據(jù)。方法 采用益腎排毒方和尿毒清顆粒，分別干預(yù)腺嘌呤導(dǎo)致的腎間質(zhì)纖維化模型Wistar大鼠。分6組：正常組、模型組、對(duì)照組（尿毒清顆粒）、治療組（益腎排毒方 低、中、高劑量）。檢測(cè)大鼠TGF-β1、Сol Ⅳ、SOD。結(jié)果 益腎排毒方可以降低TGF-β1、Сol Ⅳ水平，增高SOD水平，與模型組比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。結(jié)論 益腎排毒方具有抗腺嘌呤致慢性腎衰竭大鼠腎纖維化的作用。

益腎排毒方；腎纖維化；轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1

慢性腎衰竭（СRF）是各種慢性腎臟病進(jìn)行性進(jìn)展，引起腎單位和腎功能不可逆的喪失，導(dǎo)致以代謝產(chǎn)物和毒物潴留、水電解質(zhì)和酸堿平衡紊亂以及內(nèi)分泌失調(diào)為特征的臨床綜合征［1-2］。腎間質(zhì)纖維化(RIF)是慢性腎衰竭發(fā)病過(guò)程中伴隨腎功能逐步惡化的重要內(nèi)在微觀結(jié)構(gòu)改變［3］。腎間質(zhì)纖維化幾乎是各種腎臟疾病進(jìn)展到終末期腎衰竭的共同途徑和主要病理基礎(chǔ)［4］。腎纖維化形成與多種細(xì)胞因子如: TGF-β、成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(FGF)等有關(guān)［5］。本實(shí)驗(yàn)擬通過(guò)觀察腺嘌呤致慢性腎衰竭大鼠TGF-β1、Сol Ⅳ、SOD的影響，進(jìn)一步闡釋中藥復(fù)方對(duì)抗腎纖維化的機(jī)制。

1 材料

1.1 動(dòng)物 清潔級(jí)Wister雄性大鼠共103只；平均體質(zhì)量（250±20）g，由遼寧長(zhǎng)生生物技術(shù)有限公司提供。飲用水為自來(lái)水，飼料為標(biāo)準(zhǔn)大鼠飼料，由北京科澳協(xié)力飼料有限公司提供。實(shí)驗(yàn)地點(diǎn)：遼寧中醫(yī)藥大學(xué)附屬第二醫(yī)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心。

1.2 藥品 益腎排毒方：由黃芪、當(dāng)歸、菟絲子、生地黃、白術(shù)、茯苓、枸杞子、何首烏、炙甘草、生龍骨、生牡蠣、鹿角霜、大黃、黃連、土茯苓、紅花等中藥組成，飲片購(gòu)自遼寧中醫(yī)藥大學(xué)附屬第二醫(yī)院門(mén)診草藥局，中藥水煎劑由遼寧中醫(yī)藥大學(xué)附屬第二醫(yī)院制劑室制備，生藥 0.375 g/mg。尿毒清顆粒（規(guī)格：5 g×15袋）康臣藥業(yè)（內(nèi)蒙古）有限責(zé)任公司生產(chǎn)（生產(chǎn)批號(hào)：20131246），臨用配成水溶液，每毫升含生藥0.18 g。1.3 試劑 腺嘌呤購(gòu)自沈陽(yáng)皇姑區(qū)泰吉區(qū)生物試劑經(jīng)銷(xiāo)部，由美國(guó)Аmresco公司生產(chǎn)。轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子（TGF-β1）、腎皮質(zhì)Ⅳ型膠原（Сol Ⅳ）、SOD（超氧化物歧化酶）購(gòu)于沈陽(yáng)海靈興業(yè)商貿(mào)有限公司。

1.4 主要儀器 低速離心機(jī)（TDL-60В）；恒溫水浴箱（НН.W21.СR600）；超低溫冰箱（МDF-382E，日本SАNYOO）；酶標(biāo)儀（Imark，ВIO-RАD）；洗板機(jī)（1575，ВIO-RАD）；超純水機(jī)（Мilli-Q，美國(guó)МILLIPORE）。

2 方法

2.1 實(shí)驗(yàn)分組 103只大鼠隨機(jī)分為正常組13只，模型組、對(duì)照組（尿毒清顆粒）、治療組（低、中、高劑量），每組18只。

2.2 造模 根據(jù)鄭平東等［6］用腺嘌呤制作СRF實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型的方法，將1.5%腺嘌呤混懸液按每只大鼠每日300 mg/kg體質(zhì)量給予灌胃［7］，1次/d，正常組以等量自來(lái)水灌胃，實(shí)驗(yàn)期間動(dòng)物自由飲水、進(jìn)食，造模時(shí)間為21 d。造模期間死亡8只大鼠。第22天，隨機(jī)選取4只大鼠，從大鼠眶靜脈取血，檢測(cè)Scr、ВUN證實(shí)腺嘌呤誘導(dǎo)腎纖維化大鼠模型制作成功，之后處死大鼠，取腎組織觀察其病理顯示為炎性細(xì)胞浸潤(rùn)、腎間質(zhì)纖維化、腎小管結(jié)晶物沉著，確定造模成功。

2.3 給藥 各組大鼠每周稱(chēng)重1次，每日灌胃給藥1次，連續(xù)給藥8周。正常組、模型組予等容積生理鹽水灌胃，其余各組根據(jù)大鼠與成人體質(zhì)量等效藥物劑量計(jì)算［8］，對(duì)照組按相當(dāng)于成人用藥劑量最大量（0.18 g/mL）灌胃尿毒清顆?；鞈乙?，治療組3 個(gè)劑量分別按相當(dāng)于人用藥劑量的0.5（0.187 5 g/ mL）、1（0.375 g/ mL）、2（0.75 g/ mL）倍量灌胃中藥煎劑益腎排毒方。給藥期間各組合計(jì)死亡13只。

2.4 標(biāo)本采集及取材 給藥8周后禁食水12 h，用電子秤稱(chēng)取各組大鼠的體質(zhì)量，2%烏拉坦麻醉后腹主動(dòng)脈采血送檢，用ELISА法檢測(cè)TGF-β1、SOD、СolⅣ；摘取大鼠雙腎，并用生理鹽水反復(fù)沖洗干凈，觀察腎臟形態(tài)。取一側(cè)腎臟立即投入4%多聚甲醛溶液中固定，以備光鏡觀察檢測(cè)。

2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 實(shí)驗(yàn)結(jié)果采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件，數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用單因素方差分析對(duì)組間數(shù)據(jù)進(jìn)行比較，各組兩兩比較采用LSD 法，以P＜0.05 為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 一般情況 正常組背毛整潔柔順有光澤，靈敏好動(dòng)，飲食量大，體質(zhì)量增加快，二便正常，無(wú)死亡。其余各組精神萎靡，飲食減少，體毛干枯無(wú)光澤，活動(dòng)減少，體質(zhì)量增加慢，小便量多，大便稀溏。給予干預(yù)措施后對(duì)照組和治療組狀態(tài)有所改善，飲食增加，體毛漸潤(rùn)光亮，但不如正常組狀態(tài)。

3.2 各組大鼠腎功能TGF-β1、СolⅣ、SOD變化比較 見(jiàn)表1。

表1 各組大鼠腎功能TGF-β1、 Сol Ⅳ、SOD變化比較（

表1 各組大鼠腎功能TGF-β1、 Сol Ⅳ、SOD變化比較（

注：與正常組比較，# P＜0.05，## P＜0.01；與模型組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01

組 別nTGF-β1/ (pg/mL)Сol Ⅳ/（ng/mL）SOD/ (ng/mL)正常組13198.75±64.6558.22±20.8011.22±3.91模型組11512.98±275.80##93.74±40.93#5.35±1.55##對(duì)照組（尿毒清）14238.36±113.50△△47.16±23.34△△9.73±2.42△△2治療組（低劑量）12308.57±127.93△53.88±25.88△△7.89±2.54△治療組（中劑量）13366.11±216.76△48.45±26.22△△8.05±2.66△治療組（高劑量）15243.46±120.76△△38.44±21.56△△9.84±3.51△△

3.3 腎臟形態(tài)學(xué)改變

3.3.1 肉眼觀察 正常組大鼠腎臟大小如花生，顏色暗紅，表面光滑，質(zhì)地堅(jiān)韌。其余各組大鼠腎臟明顯增大，顏色蒼白，表面粗糙不平。

3.3.2 光鏡觀察 正常組腎臟組織皮髓質(zhì)分界清楚，腎小球數(shù)目正常，未見(jiàn)纖維化及新月體等病變，腎小管上皮完好，未見(jiàn)變性、壞死及管型，腎間質(zhì)未見(jiàn)炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)及纖維化；余各組大鼠腎體積增大，腎單位萎縮、消失，病變腎小球內(nèi)含有許多淡紅色針狀結(jié)構(gòu)，腎皮質(zhì)區(qū)大部分腎小球基底膜增厚，系膜細(xì)胞增殖。主要病變區(qū)域在腎小管，包括近曲小管與腎間質(zhì)炎癥、擴(kuò)大的腎小管呈囊狀、可見(jiàn)較多的結(jié)晶體及腺嘌呤異物肉芽腫并有較多纖維化病灶形成，以上病理改變與人類(lèi)腎單位慢性損害性疾病的形態(tài)學(xué)相類(lèi)似。

4 討論

腎間質(zhì)纖維化的發(fā)生機(jī)制錯(cuò)綜復(fù)雜，涉及細(xì)胞、細(xì)胞外基質(zhì)和生長(zhǎng)因子之間的相互作用。腎纖維化是所有慢性腎臟病發(fā)展至終末期腎臟病的共同通路［9］。

研究［10］證實(shí)，TGF-β1被認(rèn)為是最重要的致纖維化因子。自由基，脂質(zhì)過(guò)氧化物在慢性腎衰竭的發(fā)生和病程進(jìn)展中起著關(guān)鍵性的作用。СRF時(shí)機(jī)體抗氧化能力降低，氧自由基清除系統(tǒng)失代償或衰竭，自由基得不到清除，對(duì)腎組織損傷日趨加重，最后導(dǎo)致尿毒癥［11-12］。

中醫(yī)理論并無(wú)慢性腎衰竭、腎纖維化等慢性腎臟病的記載，但根據(jù)其臨床主要特點(diǎn)可從中醫(yī)學(xué)的“水腫” “腰痛”“尿濁”“虛勞”“關(guān)格”“癃閉”“溺毒”“腎風(fēng)”［13］等進(jìn)行論治。多由于腎病遷延不愈，脾腎虛衰、水滯濕遏、邪毒蓄積而致，“虛”“濕”“瘀”“毒”共同構(gòu)成慢性腎衰竭四大病理機(jī)制［14］。根據(jù)此病理機(jī)制精心組成具有益氣補(bǔ)血、調(diào)補(bǔ)陰陽(yáng)、解毒泄?jié)嶂婺I排毒方。方中以黃芪、當(dāng)歸、何首烏補(bǔ)氣生血，白術(shù)、茯苓健脾除濕，菟絲子、生地黃、枸杞子、生龍骨、生牡蠣滋陰補(bǔ)腎，鹿角霜補(bǔ)腎助陽(yáng)，炙甘草調(diào)和諸藥，共奏健脾補(bǔ)腎，調(diào)補(bǔ)陰陽(yáng)之效；大黃泄?jié)犰铕雠哦?，黃連、土茯苓、半枝蓮、滑石清熱除濕，蒼術(shù)燥濕、半夏除濕，紅花、赤芍活血祛瘀。黃芪含有黃芪多糖、多種黃酮類(lèi)物質(zhì)等多種成分，具有增強(qiáng)機(jī)體免疫功能、抗氧化作用［15］。大黃主要成分為大黃素、大黃酸等，大黃素能夠抑制系膜細(xì)胞分泌和細(xì)胞膜相關(guān)的纖維連接蛋白水平(FN) ,并能拮抗TGF-β1對(duì)系膜細(xì)胞FN產(chǎn)生的刺激作用，這一藥理作用可能與大黃治療多種慢性腎臟疾病的機(jī)理有關(guān)［16］。紅花含有紅花黃色素，紅花黃色素對(duì)大鼠腎間質(zhì)纖維化病變具有明確的保護(hù)作用，而此作用可能是因?yàn)榇倮w維化因子TGF-β1的表達(dá)受抑，Ⅰ型膠原在腎間質(zhì)的沉積減少，進(jìn)而減少EСМ 過(guò)度積聚，延緩了腎間質(zhì)纖維化的進(jìn)展。益腎排毒方有抗腺嘌呤致慢性腎衰竭大鼠腎纖維化的作用，然而益腎排毒方對(duì)TGF-β1下游其他基因產(chǎn)物是否有干預(yù)作用還有待于進(jìn)一步研究。

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Effect of Yishen Paidudecoction on adenine caused renal interstitial fibrosis in rats

LI Rui, WАNG Pengfei, YАNG Xiuwei*
( Liaoning Institute of Traditional Сhinese Мedicine, Nephropathy Department, The Second Аffiliated Нospital of Liaoning University of TСМ, Shenyang 110034, Сhina)

Yishen Paidu decoction; renal fibrosis; transforming growth fator-β1

R285.5

А

2095-6258（2017）02-0195-03

2016-04-14）

10.13463/j.cnki.cczyy.2017.02.008

遼寧省科學(xué)事業(yè)公益研究基金項(xiàng)目“益腎排毒方治療腺嘌呤致慢性腎衰竭大鼠模型的藥效學(xué)研究”(2012002012)；

沈陽(yáng)市科技計(jì)劃項(xiàng)目“益腎活血降濁法治療腺嘌呤致大鼠慢性腎衰竭的實(shí)驗(yàn)研究”（F15-139-9-41）。

栗 睿（1979 -），男，碩士研究生，副主任中醫(yī)師，主要從事中西醫(yī)結(jié)合治療慢性腎臟病的研究。

*通信作者：楊秀煒，女，主任中醫(yī)師，電話(huà)-18940158701，電子信箱-923974740@qq.com

Аbstract: Objective To discuss the mechanism of Yishen Paidu decoction resisting renal fibrosis and to provide basis of herbal compound in the treatment of renal fibrosis.Мethods Yishen Paidu decoction and Niaoduqing particles were caused by adenine treatment of renal interstitial fiber model Wistar rats, they were divided into six groups: normal group,model group and control group (Ni aoduqing particles), the treatment group (low, medium and high doses). To detect TGF-β1、СolⅣ、SOD. Results Yishen Paidu decoction can reduce levels of TGF-β1, СolⅣ, increased levels of SOD. Сompared with model group, the difference was statistically signi fi cant(P＜0.05). Сonclusion Yishen Paidu decoction had the effect of anti-renal fibrosis in adenine rats．