乙型腦炎減毒活疫苗工藝中金黃地鼠腎細(xì)胞培養(yǎng)液里谷氨酰胺添加的研究

汪小磊，王紅寧，鄭慶紋，易維維

1.四川大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，四川成都 610064；2.成都生物制品研究所有限責(zé)任公司，四川成都 610023

乙型腦炎減毒活疫苗工藝中金黃地鼠腎細(xì)胞培養(yǎng)液里谷氨酰胺添加的研究

汪小磊1，王紅寧1，鄭慶紋2，易維維2

1.四川大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，四川成都 610064；2.成都生物制品研究所有限責(zé)任公司，四川成都 610023

目的 比較谷氨酰胺在不同濃度和不同添加階段的條件下，作為細(xì)胞生長液的成分，對乙型腦炎減毒活疫苗生產(chǎn)中金黃地鼠腎細(xì)胞的培養(yǎng)效果以及后續(xù)生產(chǎn)工藝的影響。方法①以兩種添加階段：將谷氨酰胺作為細(xì)胞生長液體培養(yǎng)基的成分加入細(xì)胞培養(yǎng)和培養(yǎng)細(xì)胞時臨時配制后加入細(xì)胞培養(yǎng)；②以不同的濃度：按0.05、0.1、0.2 g/L的濃度加入細(xì)胞培養(yǎng)。結(jié)合兩種條件后，每種組合條件生產(chǎn)3批地鼠腎細(xì)胞，對所有批次細(xì)胞的生長情況及后續(xù)接種病毒后，對應(yīng)的病毒生長情況進(jìn)行比較研究。 結(jié)果 谷氨酰胺在培養(yǎng)細(xì)胞時臨時配制后加入細(xì)胞培養(yǎng)所生產(chǎn)的地鼠腎細(xì)胞質(zhì)量優(yōu)于其作為細(xì)胞生長液體培養(yǎng)基的成分加入細(xì)胞培養(yǎng)，采用秩和檢驗(yàn)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.002＜0.05）；谷氨酰胺按0.1 g/L和0.2 g/L的濃度加入細(xì)胞培養(yǎng)所生產(chǎn)的地鼠腎細(xì)胞質(zhì)量優(yōu)于按0.05g/L濃度，在2種添加階段其，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.02＜0.05），但0.1g/L和0.2 g/L的濃度之間，無論谷氨酰胺的添加階段在培養(yǎng)基中添加P=0.513，在培養(yǎng)時臨時添加P=0.827），兩者差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。 結(jié)論 在乙型腦炎減毒活疫苗生產(chǎn)所需的地鼠腎細(xì)胞培養(yǎng)中，谷氨酰胺適合在培養(yǎng)細(xì)胞時臨時配制后加入細(xì)胞培養(yǎng)容器，濃度不宜低于0.1g/L。

乙型腦炎減毒活疫苗；谷氨酰胺；地鼠腎細(xì)胞培養(yǎng)；添加階段；濃度

谷氨酰胺，學(xué)名2-氨基-4-氨甲酰基丁酸，英文Glutamine(Gln)，是細(xì)胞生長中蛋白質(zhì)合成必需的編碼氨基酸，除了在人體內(nèi)代謝和免疫中的作用外，國內(nèi)外文獻(xiàn)對其在動物基質(zhì)培養(yǎng)基中的作用做了明確闡述，可以作為培養(yǎng)基必需的氮源并促進(jìn)細(xì)胞生長和分化。在乙型腦炎減毒活疫苗生產(chǎn)過程中，用于繁殖乙腦病毒的金黃地鼠腎細(xì)胞是貼壁培養(yǎng)的原代動物細(xì)胞，該細(xì)胞的生長液主要包括通過Medium199（Earle’s）改良后的109液和新生牛血清，谷氨酰胺作為生長液的重要成分。目前谷氨酰胺可以作為細(xì)胞生長液體培養(yǎng)基的成分參與細(xì)胞培養(yǎng)，或在培養(yǎng)細(xì)胞時臨時單獨(dú)配制后參與細(xì)胞培養(yǎng)，其添加的階段和濃度對地鼠腎細(xì)胞質(zhì)量和后續(xù)的病毒質(zhì)量指標(biāo)有顯著影響，因此該研究通過不同濃度及添加階段的條件下加入谷氨酰胺進(jìn)行試生產(chǎn)，對谷氨酰胺在乙型腦炎減毒活疫苗生產(chǎn)中的使用方法進(jìn)行比較研究，期望通過試驗(yàn)得到其在乙型腦炎減毒活疫苗生產(chǎn)中較好的使用方法，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

1.1.1 金黃地鼠 選用同一飼養(yǎng)單元的SPF級金黃地鼠360只，按完全相同的操作步驟進(jìn)行地鼠處死、腎塊采集和剪碎。

1.1.2 地鼠腎細(xì)胞 剪碎的地鼠腎在三角瓶內(nèi)經(jīng)1%胰蛋白酶液在低溫消化20 h后分裝成18批地鼠腎細(xì)胞。

1.1.3 新生牛血清 市售Hyclone藥用級新生牛血清。

1.1.4 109液 通過Medium199（Earle’s）改良后的109液，以Earle’s液為平衡溶劑包含多種氨基酸和乳蛋白等成分[1]。在其他成分相同的情況下，分別制備谷氨酰胺濃度為0.062 5、0.125、0.25 g/L以及不含谷氨酰胺共4種規(guī)格溶液，除菌過濾后儲存于2～8℃，儲存時間持續(xù)一周[2]。

1.1.5 乙型腦炎減毒株病毒 SA14-14-2批工作種子批毒種

1.1.6 病毒維持液市售Gibco MEM液體培養(yǎng)基

1.1.7 谷氨酰胺 市售國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司

1.2 方法

使用Earle’s液將18批地鼠腎細(xì)胞容器內(nèi)的胰蛋白酶液沖洗干凈，按每組3批分為6組（A～F，組內(nèi)編號1～3），用于谷氨酰胺不同的使用條件。A1組操作如下：在A級層流環(huán)境下，將含谷氨酰胺的109液2 000 mL，其中谷氨酰胺含量為0.0 625 g/L，新生牛血清150 mL加入15 L玻璃瓶中，經(jīng)少量碳酸氫鈉調(diào)節(jié)pH至7.5[3]，加入Earle’s液定容至2 500 mL制成細(xì)胞生長液，該生長液中谷氨酰胺終濃度為0.05 g/L[4]。在其中加入一批地鼠腎細(xì)胞，經(jīng)45～50℃水浴2 min后，水平放置于轉(zhuǎn)瓶機(jī)上，在36～38℃下，以3～6 r/h培養(yǎng)70 h。

以同樣的方法對B～F組進(jìn)行操作，區(qū)別為各組使用的109液和谷氨酰胺含量不同。各組的谷氨酰胺添加條件分別為：A以109液成分加入，濃度為0.05 g/L；B以109液成分加入，濃度為0.1 g/L；C以109液成分加入，濃度為0.2 g/L；D臨時配制后加入，濃度為0.05 g/L；E臨時配制后加入，濃度為0.1 g/L；F臨時配制后加入，濃度為0.2 g/L。

1.2.1 細(xì)胞生長情況的觀察 生產(chǎn)中期望地鼠腎細(xì)胞貼壁生長，在顯微鏡下輪廓清晰，形態(tài)飽滿且整體呈現(xiàn)為致密的單層，通過鏡檢視野內(nèi)細(xì)胞的分布情況將致密度分為50%～75%、75%～90%以及90%以上3檔。

1.2.2 病毒生長情況的判定 將培養(yǎng)后的18批細(xì)胞瓶內(nèi)的細(xì)胞生長液移除，分別接種乙型腦炎減毒株病毒，加入病毒維持液2 000 mL后置于35～37℃下，以3～6 r/h培養(yǎng)50 h。培養(yǎng)結(jié)束后采集各瓶樣品運(yùn)用噬斑法進(jìn)行病毒滴定檢測[7]。

2 結(jié)果

2.1 不同時間、不同濃度添加谷氨酰胺后細(xì)胞生長情況對比

通過細(xì)胞培養(yǎng)后的鏡檢可見，谷氨酰胺在制備109液時加入，經(jīng)2～8℃儲存一周后進(jìn)入細(xì)胞培養(yǎng)所生產(chǎn)的地鼠腎細(xì)胞質(zhì)量低于培養(yǎng)細(xì)胞時臨時配制谷氨酰胺加入生長液。另外以0.05 g/L濃度添加谷氨酰胺會顯著降低細(xì)胞質(zhì)量，見表1。

2.2 不同時間、不同濃度添加谷氨酰胺后病毒滴度比較

通過病毒滴定實(shí)驗(yàn)的檢測可見，谷氨酰胺在制備109液時加入，經(jīng)2～8℃儲存一周后進(jìn)入細(xì)胞培養(yǎng)所生產(chǎn)的地鼠腎細(xì)胞接種病毒后，病毒生長情況較差，病毒滴度低于臨時配制谷氨酰胺加入培養(yǎng)的情況。另外以0.05 g/L濃度添加谷氨酰胺在降低細(xì)胞質(zhì)量的同時，也影響了后續(xù)接種病毒后病毒的生長，見表2。

表2 不同時間、不同濃度添加谷氨酰胺后病毒滴度比較（logPFU/mL）

由于乙型腦炎減毒活疫苗病毒滴度是非正態(tài)數(shù)據(jù)，因此采用秩和檢驗(yàn)（Mann-Whitney U）對以上數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。①D、E、F組為臨時配制谷氨酰胺加入培養(yǎng)，滴度值與A、B、C 3組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （P=0.002＜0.05）；②B、C組和E、F組在谷氨酰胺添加階段一致的條件下，B、C組滴度高于A組（P=0.02＜0.05），同樣的E、F組滴度高于D組（P=0.02＜0.05）；③B、E組谷氨酰胺濃度為0.1g/L，C、F組谷氨酰胺濃度為0.2 g/L，在谷氨酰胺添加階段一致的條件下，B和C的滴度差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （P=0.513＞0.05），E和F的滴度差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.827＞0.05）。

3 討論

在乙型腦炎減毒活疫苗的生產(chǎn)流程中，根據(jù)谷氨酰胺在不同階段添加和以不同濃度添加兩種條件進(jìn)行試生產(chǎn)后，對所有批次細(xì)胞的生長情況及后續(xù)接種病毒后對應(yīng)的病毒生長情況進(jìn)行比較。在此項(xiàng)比較性研究中可見，谷氨酰胺在培養(yǎng)地鼠腎細(xì)胞時臨時配制后加入細(xì)胞培養(yǎng)所生產(chǎn)的地鼠腎細(xì)胞質(zhì)量優(yōu)于其作為液體培養(yǎng)基的成分經(jīng)儲存后加入細(xì)胞培養(yǎng)，谷氨酰胺按0.1 g/L和0.2 g/L的濃度加入細(xì)胞培養(yǎng)所生產(chǎn)的地鼠腎細(xì)胞質(zhì)量優(yōu)于按0.05 g/L濃度。分析原因?yàn)楣劝滨０肥且环N較不穩(wěn)定的氨基酸，隨著時間的推移，會轉(zhuǎn)換成細(xì)胞不能利用的形態(tài)[5-6]，雖然眾多知名進(jìn)口品牌市售含谷氨酰胺的培養(yǎng)基儲存條件為2～8℃，有效期常為數(shù)月，但通過試驗(yàn)可見在乙腦減毒活疫苗生產(chǎn)中的地鼠腎細(xì)胞培養(yǎng)時，使用谷氨酰胺適宜在培養(yǎng)時臨時配制后添加，這樣能夠更好保持其有效成分幫助細(xì)胞生長。另外由于谷氨酰胺是一種條件必需性氨基酸，既是氮源又有組織生長和修補(bǔ)作用[8-9]，在乙腦減毒活疫苗生產(chǎn)中，細(xì)胞生長液的谷氨酰胺濃度不宜低于0.1 g/L。傳統(tǒng)的哺乳動物細(xì)胞培養(yǎng)基Medium199中谷氨酰胺含量即為0.68 mmol/L（約0.099 g/L）[10]，同時考慮到測試結(jié)果顯示繼續(xù)提升谷氨酰胺濃度沒有顯著提升細(xì)胞質(zhì)量，且過多的谷氨酰胺可能會降解導(dǎo)致對細(xì)胞有害的氨生成，因此在乙腦減毒活疫苗生產(chǎn)的細(xì)胞培養(yǎng)階段繼續(xù)提升谷氨酰胺濃度需要謹(jǐn)慎試驗(yàn)并進(jìn)行更多觀察和研究。

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R521.6

A

1672-5654（2017）02（c）-0043-03

2016-11-24）

汪小磊（1985.12-），男，四川成都人，本科，醫(yī)學(xué)生物工程系列工程師，研究方向：生物工程專業(yè)（動物細(xì)胞培養(yǎng)）。

10.16659/j.cnki.1672-5654.2017.06.043