B7-H4分子在肺癌中的表達(dá)及其與Treg細(xì)胞的關(guān)系

王 鑫 劉 潔 李虎子

(天津醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院腫瘤內(nèi)科，天津 300052)

B7-H4分子在肺癌中的表達(dá)及其與Treg細(xì)胞的關(guān)系

王 鑫 劉 潔1李虎子2

(天津醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院腫瘤內(nèi)科，天津 300052)

目的 探討肺癌小鼠中B7-H4分子的表達(dá)與調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(Treg)的變化及兩者之間的相關(guān)性。方法 C56BL/6雌性小鼠24只隨機(jī)分成對(duì)照組和肺癌組各12只。對(duì)照組小鼠皮下注射0.1 ml無(wú)菌生理鹽水；肺癌組小鼠皮下注射濃度為1×107/ml的0.1 ml Lewis肺癌細(xì)胞株懸液，于注射后14 d處死小鼠，通過(guò)蘇木素-伊紅(HE)染色驗(yàn)證肺癌模型；酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)檢測(cè)肺癌組織以及腹腔來(lái)源的巨噬細(xì)胞培養(yǎng)上清中白細(xì)胞介素(IL)-10、腫瘤壞死因子(TNF)-α、干擾素(IFN)-γ的分泌量；流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)小鼠肺癌組織以及腹腔來(lái)源的巨噬細(xì)胞表面B7-H4的表達(dá)以及脾臟、淋巴結(jié)中Treg細(xì)胞的比例及數(shù)量；并進(jìn)一步分析其相關(guān)性。結(jié)果 與對(duì)照組比，肺癌組小鼠高表達(dá)B7-H4分子，并且分泌更多的IL-10、TNF-α以及較少的IFN-γ(P<0.05)；肺癌小鼠的脾臟、淋巴結(jié)中的Treg細(xì)胞比例以及總數(shù)均顯著高于對(duì)照組(P<0.05)；Treg細(xì)胞的絕對(duì)數(shù)與B7-H4的蛋白表達(dá)水平呈顯著正相關(guān)(r=0.64，P<0.05)。結(jié)論 在肺癌中，B7-H4分子高表達(dá)并與Treg細(xì)胞相互作用，對(duì)腫瘤的免疫調(diào)節(jié)發(fā)揮作用。

B7-H4；調(diào)節(jié)性T細(xì)胞；肺癌；白細(xì)胞介素-10

大多數(shù)肺癌患者就診時(shí)已是中晚期，治療效果較差，術(shù)后5年生存率低于15%〔1，2〕。研究表明惡性腫瘤患者的免疫處于耐受或缺陷狀態(tài)，機(jī)體通過(guò)改變表面分子的表達(dá)水平、分泌抑制性細(xì)胞因子及封閉表面抗原等方式逃避機(jī)體的免疫機(jī)制從而發(fā)生發(fā)展〔3，4〕。B7-H4分子是最近研究發(fā)現(xiàn)的一種與腫瘤免疫逃逸相關(guān)的分子，在正常組織中有大量mRNA水平的表達(dá)，但是蛋白質(zhì)水平的表達(dá)較低，而在腫瘤細(xì)胞中，B7-H4分子在mRNA水平以及蛋白水平均高表達(dá)，可以通過(guò)抑制T細(xì)胞增殖和細(xì)胞因子分泌對(duì)T細(xì)胞的免疫應(yīng)答進(jìn)行負(fù)性調(diào)控〔5，6〕。調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(Treg)是在腫瘤免疫耐受過(guò)程中發(fā)揮著重要作用的一種CD4+T細(xì)胞亞群，其關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子為FoxP3，主要分泌的抑制性因子為白細(xì)胞介素(IL)-10、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子(TGF)-β和IL-35等〔7，8〕。Treg細(xì)胞通過(guò)產(chǎn)生的IL-10能夠抑制肺癌腫瘤細(xì)胞的增殖。本研究分析B7-H4在肺癌組織中的表達(dá)以及Treg細(xì)胞比例和數(shù)量的變化，分析兩者之間可能存在的聯(lián)系，探討B(tài)7-H4在肺癌免疫逃逸機(jī)制中的作用。

1 材料與方法

1.1 小鼠分組及構(gòu)建肺癌模型 24只6～8 w的C56BL/6雌性小鼠購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，SPF級(jí)實(shí)驗(yàn)室飼養(yǎng)，約15～20 g。小鼠肺癌細(xì)胞株Lewis購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院生物化學(xué)與細(xì)胞生物學(xué)研究所，在本實(shí)驗(yàn)室常規(guī)傳代培養(yǎng)，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，用胰酶消化，離心后收集細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度為1×108個(gè)/ml。隨機(jī)分成對(duì)照組及肺癌組，取小鼠Lewis肺癌細(xì)胞系培養(yǎng)后收集細(xì)胞，用生理鹽水重懸后臺(tái)盼藍(lán)染色，細(xì)胞活力>95%，取細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)，調(diào)整濃度為1×107/ml。肺癌組小鼠12只，皮下注射肺癌細(xì)胞株懸液0.1 ml，濃度為1×107/ml；對(duì)照組小鼠12只，皮下注射0.1 ml無(wú)菌生理鹽水。兩組小鼠于接種后14 d斷頸處死。兩組小鼠的體質(zhì)量比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

1.2 組織病理切片 取小鼠腫瘤組織最大面，避開(kāi)過(guò)多的壞死組織部分，連續(xù)切片，厚度約2～3 mm，用4%甲醛固定，常規(guī)石蠟包埋，蘇木素-伊紅(HE)染色。顯微鏡下觀察組織病理。

1.3 流式細(xì)胞術(shù)測(cè)B7-H4的表達(dá) 荷瘤小鼠的肺癌組織用Ⅳ型膠原酶37℃消化后，過(guò)100目無(wú)菌濾網(wǎng)，磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌后重懸細(xì)胞，濃度為2×106/ml，貼壁1.5 h后收集貼壁細(xì)胞；腹腔巨噬細(xì)胞用PBS作為腹腔灌洗液收集，收集后2 000 r/min離心10 min，取出后棄上清，將得到的細(xì)胞用完全1640重懸，置于孵箱5%CO2，37℃培養(yǎng)，24 h后用PBS洗去非黏附細(xì)胞，對(duì)貼壁細(xì)胞反復(fù)吹打得到腹腔巨噬細(xì)胞，經(jīng)流式檢測(cè)其純度達(dá)到90%以上。用APC-F4/80、PE-B7-H4(購(gòu)自美國(guó)BD公司)染色后分析，取正常小鼠、荷瘤小鼠腹腔來(lái)源的巨噬細(xì)胞，用PE-B7-H4孵育30 min，4℃，PBS洗滌2次后，重懸細(xì)胞，4%多聚甲醛固定后用BD FACSCalibur流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)。

1.4 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的比例 通過(guò)斷頸將小鼠處死，提取小鼠脾臟、腸系膜淋巴結(jié)，研磨制成單細(xì)胞懸液，并進(jìn)行白細(xì)胞計(jì)數(shù)，調(diào)整細(xì)胞懸液濃度，并取2×106個(gè)細(xì)胞用PE-CD4、FITC-CD25、APC-FoxP3(購(gòu)自美國(guó)BD公司)標(biāo)記Treg細(xì)胞，避光孵育后PBS洗2遍，4%多聚甲醛固定后進(jìn)行流式細(xì)胞學(xué)檢測(cè)，采用FlowJo分析得出Treg細(xì)胞占總CD4+T細(xì)胞的比例，并換算出Treg細(xì)胞的數(shù)量。

1.5 酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)檢測(cè)IL-10、腫瘤壞死因子(TNF)-α、干擾素(IFN)-γ的分泌量 按照ELISA試劑盒(購(gòu)自R&D公司)說(shuō)明書(shū)，將上述取得的巨噬細(xì)胞采用完全培養(yǎng)基在體外培養(yǎng)24 h，收集培養(yǎng)上清，梯度稀釋后加入包被好的反應(yīng)孔中，37℃孵育1 h后洗滌，在反應(yīng)孔中加入稀釋后的酶標(biāo)抗體，37℃孵育1 h后加入顯色液，37℃孵育30 min后終止反應(yīng)，用酶標(biāo)儀(Bio-Rad model 550)在450 nm處檢測(cè)OD值。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS19.0軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)、單因素方差分析、LSD多重比較及Pearson相關(guān)分析。

2 結(jié) 果

2.1 HE染色驗(yàn)證肺癌模型的建立 皮下接種肺癌細(xì)胞株，成瘤率100%，并且在14 d后進(jìn)行剖殺，取腫瘤組織進(jìn)行HE染色，在顯微鏡下觀察到癌細(xì)胞被纖維組織分隔成大小不等的癌巢，癌細(xì)胞呈圓形或橢圓形，細(xì)胞大小不等，胞質(zhì)呈偏嗜堿性。見(jiàn)圖1。

圖1 肺癌組織HE染色

2.2 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)小鼠B7-H4分子的表達(dá) 同型對(duì)照小鼠B7-H4表達(dá)(0.6±0.3)%，對(duì)照組巨噬細(xì)胞B7-H4分子表達(dá)非常微弱〔(2.4±0.5)%〕，而荷瘤小鼠腹腔來(lái)源及腫瘤組織來(lái)源的巨噬細(xì)胞B7-H4表達(dá)〔(20.3±2.0)%,(17.2±3.1)%〕均明顯高于正常小鼠腹腔來(lái)源的巨噬細(xì)胞上的B7-H4表達(dá)(P<0.05)。

2.3 各組巨噬細(xì)胞分泌的IL-10、TNF-α、IFN-γ水平比較 肺癌組巨噬細(xì)胞分泌的IL-10〔肺癌組織：(506±10)pg/ml，腹腔：(562±18)pg/ml〕、TNF-α〔肺癌組織：(1 605±139)pg/ml，腹腔：(1 780±115)pg/ml〕水平明顯高于對(duì)照組〔(254±13)pg/ml、(527±28)pg/ml〕(P<0.05)，而IFN-γ水平〔肺癌組織：(95±8)pg/ml，腹腔：(172±10)pg/ml〕明顯低于對(duì)照組〔(738±40)pg/ml〕(P<0.05)。

2.4 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)脾臟、淋巴結(jié)中Treg細(xì)胞的比例和數(shù)量 肺癌組小鼠脾臟以及淋巴結(jié)中的Treg細(xì)胞比例〔(13.7±1.8)%、(16.2±2.8)%〕以及數(shù)量〔(720±97)×103,(350+15)×103〕均顯著高于對(duì)照組〔(3.3±0.4)%、(4.9±0.4)%；(312±68)×103,(119±21)×103〕(P<0.05)。

2.5 B7-H4分子表達(dá)水平與Treg細(xì)胞絕對(duì)數(shù)的相關(guān)性 Treg細(xì)胞的絕對(duì)數(shù)即小鼠脾臟、淋巴結(jié)中Treg細(xì)胞的總數(shù)與B7-H4分子的蛋白表達(dá)水平呈顯著正相關(guān)(r=0.64，P<0.05)。

3 討 論

Treg細(xì)胞有著獨(dú)特的免疫負(fù)調(diào)節(jié)作用，當(dāng)Treg細(xì)胞過(guò)多時(shí)，機(jī)體中的正常免疫系統(tǒng)受到抑制，將無(wú)法正常發(fā)揮免疫效應(yīng)，而當(dāng)Treg細(xì)胞過(guò)少時(shí)，則會(huì)發(fā)生自身免疫性疾病〔9〕。研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤患者體內(nèi)免疫效應(yīng)降低，免疫缺失與患者體內(nèi)更多的CD4+CD25+FoxP3+的Treg細(xì)胞密切相關(guān)〔10〕。提示在肺癌發(fā)生發(fā)展的過(guò)程中，Treg細(xì)胞占總CD4+T細(xì)胞的比例不斷增加，將增強(qiáng)機(jī)體其他免疫細(xì)胞的抑制作用，而機(jī)體免疫效應(yīng)細(xì)胞的能力減弱，腫瘤得以進(jìn)一步發(fā)展，增加了腫瘤細(xì)胞發(fā)生免疫逃逸的可能。B7-H4分子作為新近發(fā)現(xiàn)的負(fù)性調(diào)節(jié)分子在腫瘤中的作用逐漸受到關(guān)注，研究發(fā)現(xiàn)，在結(jié)腸癌、侵襲性導(dǎo)管癌等腫瘤中B7-H4分子高度表達(dá)，并且可以抑制效應(yīng)T細(xì)胞的功能。本實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)正常小鼠腹腔來(lái)源的巨噬細(xì)胞僅微弱表達(dá)B7-H4分子，而荷瘤小鼠無(wú)論是腹腔來(lái)源還是腫瘤組織來(lái)源的巨噬細(xì)胞均高表達(dá)B7-H4分子，提示在肺癌形成的微環(huán)境中B7-H4分子可能發(fā)揮著重要的作用。本文進(jìn)一步檢測(cè)了多種炎癥因子，結(jié)果提示B7-H4分子可能是通過(guò)分泌IL-10、TNF-α等細(xì)胞因子作用于T細(xì)胞發(fā)揮免疫逃逸的作用。另外，進(jìn)一步觀察了免疫抑制細(xì)胞Treg在肺癌小鼠脾臟、淋巴結(jié)中的變化，結(jié)果提示B7-H4分子在腫瘤發(fā)生發(fā)展中與Treg細(xì)胞之間可能存在相互作用的關(guān)系，B7-H4分子可能是通過(guò)分泌大量的IL-10、TNF-α作用于Treg細(xì)胞對(duì)免疫調(diào)節(jié)發(fā)揮作用的。然而，B7-H4分子到底是否通過(guò)細(xì)胞因子IL-10、TNF-α作用于Treg細(xì)胞還有待進(jìn)一步的研究。本研究為腫瘤免疫逃逸現(xiàn)象的機(jī)制研究提供了新的實(shí)驗(yàn)依據(jù)，并為肺癌治療提供了新的靶標(biāo)。

1 趙 威，李恩有，劉珊珊，等.肺癌診斷方法的比較與研究進(jìn)展〔J〕.現(xiàn)代生物醫(yī)學(xué)進(jìn)展，2016；16(9)：1766-8.

2 Piacentini GL，Tezza G，Cattazzo E，etal.Impact of waiting time after surgery and overall time of postoperative radiochemotherapy on treatment outcome in glioblastoma multiforme〔J〕.Radiat Oncol，2015；16(10)：172.

3 Selman M，Rojas M，Mora AL，etal.Aging and interstitial lung diseases：unraveling an old forgotten player in the pathogenesis of lung fibrosis〔J〕.Semin Respir Crit Care Med，2010；31(5)：607-17.

4 Kantoff PW，Higano CS，Shore ND，etal.Sipuleucel-T immunotherapy for castration-resistant prostate cancer〔J〕.N Engl J Med，2010；363(5)：411-22.

5 Dutsch-Wicherek M，Tomaszewska R，Lazar A，etal.The presence of B7-H4+ macrophages and CD25+CD4+ and FOXP3+ regulatory T cells in the microenvironment of nasal polyps-a preliminary report〔J〕.Folia Histochem Cytobiol，2010；48(4)：611-7.

6 Fujimura T，Ring S，Umansky V，etal.Regulatory T cells stimulate B7-H1 expression in myeloid-derived suppressor cells in ret melanomas〔J〕.J Invest Dermatol，2012；132(4)：1239-46.

7 Zhang X，Kelaria S，Kerstetter J，etal.The functional and prognostic implications of regulatory T cells in colorectal carcinoma〔J〕.J Gastrointest Oncol，2015；6(3)：307-13.

8 Wolf D，Sopper S，Pircher A，etal.Treg(s) in cancer：friends or foe〔J〕?J Cell Physiol，2015；230(11)：2598-605.

9 Hori T，Kuribayashi K，Saito K，etal.Ultraviolet-induced alloantigen-specific immunosuppression in transplant immunity〔J〕.World J Transplant，2015；5(1)：11-8.

10 Cao C，Ma T，Chai YF，etal.The role of regulatory T cells in immune dysfunction during sepsis〔J〕.World J Emerg Med，2015；6(1)：5-9.

〔2016-12-11修回〕

(編輯 袁左鳴/滕欣航)

1 天津市第三中心醫(yī)院呼吸科 2 天津中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院呼吸科

劉 潔(1982-)，女，碩士，主治醫(yī)師，主要從事呼吸道腫瘤研究。

王 鑫(1985-)，男，碩士，住院醫(yī)師，主要從事呼吸、泌尿腫瘤研究。

R73

A

1005-9202(2017)07-1611-02；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.07.018