梨頭草提取物對(duì)四氯化碳致小鼠急性肝損傷的修復(fù)作用

張 雷 郭玉成 石 鑫 趙靜怡 李建會(huì) 楊 闊 郎桂森

(承德醫(yī)學(xué)院，河北 承德 067000)

梨頭草提取物對(duì)四氯化碳致小鼠急性肝損傷的修復(fù)作用

張 雷 郭玉成 石 鑫 趙靜怡 李建會(huì) 楊 闊 郎桂森1

(承德醫(yī)學(xué)院，河北 承德 067000)

目的 探討犁頭草提取物對(duì)四氯化碳(CCl4)誘導(dǎo)大鼠急性肝損傷的修復(fù)效果和抗氧化作用。方法 體外抗氧化評(píng)價(jià)主要考察對(duì)DPPH、ABTS、羥自由基以及還原力的清除率，利用CCl4誘導(dǎo)昆明小鼠肝損傷后，以不同劑量的犁頭草提取物灌胃7 d并且測(cè)定血清中天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶(AST)、堿性磷酸酶(ALP)、丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶(GGT)、總膽紅素(TB)和肝腎組織中的超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化氫酶(CAT)、谷胱甘肽(GSH)以及丙二醛(MDA)等指標(biāo)，HE 染色觀察肝臟病理組織學(xué)變化。結(jié)果 體外抗氧化實(shí)驗(yàn)證明犁頭草提取物具有較強(qiáng)的抗氧化效果，各劑量組均能降低CCl4致小鼠急性肝損傷血AST、ALP、ALT、GGT和TB的升高，降低肝腎中MDA含量，增強(qiáng) SOD、CAT和GSH活性，減輕 CCl4對(duì)肝組織的病理損傷。結(jié)論 犁頭草提取物對(duì) CCl4致小鼠急性肝損傷具有一定的保護(hù)作用。

犁頭草；護(hù)肝；抗氧化

犁頭草屬于堇菜科堇菜屬草本植物,為一種侗族民間常用中藥,主要分布華中及華南各省,多生于山坡林邊、 溪邊或荒山草地中〔1〕。在民間常用于清熱解毒,除膿消炎、治癰疽、外傷感染、瘰疬、瘡瘍、扁桃體炎、瘡瘍等癥。現(xiàn)代藥理實(shí)驗(yàn)表明,犁頭草還具有抗金黃色葡萄糖球菌及治療急慢性骨髓炎等多種藥理作用〔2,3〕，在民間常用來治療肝病，但相關(guān)報(bào)道甚少。本實(shí)驗(yàn)采用體外抗氧化和體內(nèi)抗氧化實(shí)驗(yàn)，結(jié)合四氯化碳(CCl4)致小鼠急性化學(xué)性肝損傷模型，觀察犁頭草提取物保護(hù)急性肝損傷和抗氧化的作用。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑 犁頭草采購于江蘇省恒順大藥房，鑒定為堇菜科堇菜屬植物犁頭草的干燥全草。種在40℃～50℃烘干后用中藥粉碎機(jī)粉碎過60目篩。清潔級(jí)健康KM小白鼠，雄性體質(zhì)量(20±2)g，由北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司提供，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)SCKK(京)2012-0001，分籠飼養(yǎng)，飼料充足飲水不限，室溫20℃～25℃，適應(yīng)環(huán)境5 d后用于實(shí)驗(yàn)。谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶(GGT)、丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶(AST)、堿性磷酸酶(ALP)、超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽(GSH)、總膽紅素(TB),過氧化氫酶(CAT)，丙二醛(MDA)測(cè)試盒購自西安臻品生物制品有限公司。其他試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備 Infinite M200TECAN 酶標(biāo)儀(瑞士TECAN集團(tuán)公司)；AL104電子天平(Mettler-Toledo儀器公司)；RE-52AA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海亞榮生化儀器廠)；CTXNW-10B超聲波循環(huán)提取機(jī)(北京弘祥生物技術(shù)開發(fā)公司)；DU-800紫外掃描分光光度計(jì)(美國貝克曼庫爾特公司)。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 犁頭草提取物的提取 稱取干燥草全草5 kg，用65%乙醇浸泡24 h后利用循環(huán)超聲波提取儀提取45 min，減壓濃縮回收乙醇得水溶液，上D-101大孔樹脂，先用20%的乙醇洗脫去除雜質(zhì)，再用60%的乙醇洗脫，得總黃酮的乙醇溶液，減壓濃縮回收乙醇后烘干粉碎得犁頭草提取物粉末。

1.3.2 犁頭草提取物體外抗氧化分析

1.3.2.1 犁頭草提取物對(duì)DPPH自由基的清除率 參照文獻(xiàn)〔4〕將樣品用甲醇配制成一系列濃度(50～300 μg/ml)；加入提前配制的DPPH溶液(13 mg DPPH自由基甲醇定容至25 ml,避光放置)。分別用不同濃度的樣品溶液 0.1 ml加入3.5 ml DPPH 甲醇溶液，振搖混勻后置于暗室中靜30 min，在 517 nm波長處測(cè)定吸光度，維生素C(VC)為對(duì)照，每份樣品平行操作3次，計(jì)算公式：清除率(%)=〔(AC-AS)/AC〕× 100%。式中AC為3.5 ml DPPH溶液與0.1 ml甲醇混合后的吸光度，AS為3.5 ml DPPH 溶液與0.1 ml樣品溶液混合后的吸光度。

1.3.2.2 犁頭草提取物對(duì)ABTS自由基的清除率 按照文獻(xiàn)〔5〕將等量的7 mmol/L ABTS溶液與2.45 mmol/L過硫酸鉀水溶液混合，避光放置 12～16 h。用無水乙醇將該溶液稀釋至734 nm波長處的吸光度為(0.7±0.02)，得到 ABTS 工作液。將樣品用甲醇配制成一系列濃度(25～150 μg/ml)，取0.15 ml樣品加入2.85 ml ABTS自由基工作液，混合30 min后測(cè)定517 nm處吸光度，VC為對(duì)照，計(jì)算公式為：清除率(%)=〔(AC-AS)/AC〕×100%。式中AC為2.85 ml ABTS溶液與0.15 ml甲醇混合后的吸光度，AS為2.85 ml ABTS溶液與0.15 ml樣品混合后的吸光度。

1.3.2.3 犁頭草提取物對(duì)羥自由基的清除率 利用犁頭草提取物清除羥基自由基能力的強(qiáng)弱來測(cè)定其抗氧化性的大小，參照文獻(xiàn)〔6〕方法加以適當(dāng)改進(jìn)。將犁頭草提取物配制成不同質(zhì)量濃度(125～500 μg/ml)的樣品溶液，依次加入1 ml樣品、1 ml 9 mmol/L水楊酸-乙醇溶液和1 ml 9 mmol/L FeSO4溶液和1 ml 8.8 mmol/L的 H2O2溶液，混勻后于37℃恒溫水浴30 min，測(cè)510 nm處吸光度。VC為對(duì)照，每份樣品平行操作 3次。羥自由基清除能力由以下公式計(jì)算：清除率(%)=〔(AS-AJ)/(AC-AJ)〕×100%。式中，AS為加入樣品的反應(yīng)溶液吸光值，AJ為用水代替樣品的溶液吸光值，AC為用水代替樣品和H2O2的溶液吸光值。

1.3.2.4 犁頭草提取物還原能力的測(cè)定 參照文獻(xiàn)〔7〕將樣品液配制成一系列的濃度(50～200 μg/ml)，分別取1.0 ml，加入0.2 mol/L磷酸鹽緩沖液(pH6.8)1 ml和1%的鐵氰化鉀溶液1 ml，充分混合以后，立即放入在50℃下保溫20 min，取出立即冷卻至室溫，加入4.0 ml 10%三氯乙酸充分混合后終止反應(yīng)。吸取反應(yīng)液4.0 ml,加入蒸餾水2 ml和0.5 ml 0.1% FeCl3溶液，混合均勻，暗室反應(yīng)30 min后在700 nm波長處比色，VC為對(duì)照。

1.3.3 犁頭草提取物對(duì)CCl4誘導(dǎo)肝損傷的修復(fù)效果

1.3.3.1 肝損傷模型的建立和處理 昆明小白鼠60只，隨機(jī)分成 6 組：正常對(duì)照組(在治療期間喂養(yǎng)10 ml/kg體重0.3%的羧甲基纖維素鈉)；肝損傷模型組(給予10 ml/kg體重0.3%的羧甲基纖維素鈉)；水飛薊素組(給予100 mg/kg體重的水飛薊素)；犁頭草提取物低、中、高劑量組(分別給予100、200和400 mg/kg體重的犁頭草提取物)。每天灌胃1次，連續(xù)6 d，末次給藥2 h 后，除正常對(duì)照組按5 ml/kg體重腹腔注射體積分?jǐn)?shù)為 6%的 CCl4橄欖油溶液1次，禁食不禁水24 h后，麻醉后眼眶取血，小鼠血樣4℃ 3 500 r/min離心10 min后取血清。麻醉處死小鼠，剖腹取出肝臟和腎臟于冷的生理鹽水中洗凈血液備用；另外剪肝小葉置于10%甲醛中固定，待病理檢測(cè)。

1.3.3.2 生化指標(biāo)的測(cè)定 自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)血清 ALT、AST、ALP、GGT和TB 的活性，分別取肝、腎組織加入生理鹽水于冰浴中制成組織勻漿，離心后取上清液按試劑盒說明測(cè)定SOD、CAT、GSH和MDA的含量。

1.3.3.3 肝臟組織的病理切片觀察 取小鼠右葉相同位置肝組織，用4℃生理鹽水沖洗后，濾紙拭干，浸泡于10%中性甲醛溶液中固定，石蠟包埋，常規(guī)切片，蘇木素-伊紅(HE)染色，光學(xué)顯微鏡下觀察肝組織切片的病理變化。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS16.0軟件進(jìn)行方差分析和t檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1 犁頭草提取物的體外抗氧化效果 犁頭草提取物對(duì)DPPH的清除率呈劑量依賴性，同樣，對(duì)ABTS的清除效果、對(duì)羥自由基同樣表現(xiàn)出明顯的清除率，在濃度30～150 μg/ml范圍內(nèi)，還原力也是濃度依賴性，雖然犁頭草提取物對(duì)以上自由基的清除效果和還原力不如VC，但是依然體現(xiàn)出了較強(qiáng)的體外抗氧化能力。見圖1。

2.2 犁頭草提取物對(duì)CCl4致小鼠急性肝損傷模型血清中ALP、AST、ALT、GGT和TB的影響 與正常對(duì)照組比較，模型組小鼠血清中的ALP、ALT、ASP、GGT、TB的含量升高(P<0.001)，經(jīng)水飛薊素和犁頭草提取物治療后，大鼠血清ALP、ALT、ASP、GGT和TB含量均有明顯降低(P<0.01或P<0.001)，見表1。

圖1 犁頭草提取物的體外抗氧化效果

2.3 犁頭草提取物對(duì)CCl4致小鼠急性肝損傷模型肝和腎組織中SOD、CAT、GSH和MDA的影響 與正常對(duì)照組比較，模型組鼠肝腎組織SOD、CAT和GSH顯著降低(P<0.001)，而MDA的含量顯著提高(P<0.001),與模型組比較，水飛薊素和不同劑量犁頭草提取物組小鼠，肝腎組織SOD、CAT和GSH顯著升高(P<0.001或P<0.01)，而MDA的含量顯著降低(P<0.001或P<0.01)。見表2。

2.4 犁頭草提取物對(duì)CCl4致小鼠急性肝損傷模型小鼠的肝組織病理形態(tài)學(xué)的影響 正常對(duì)照組小鼠肝臟的肝小葉結(jié)構(gòu)正常，肝細(xì)胞圍繞中央靜脈，成輻射狀排列，小葉間血管和膽管清晰，肝細(xì)胞無變形、壞死等損傷性改變；模型組小鼠肝結(jié)構(gòu)紊亂，肝細(xì)胞出現(xiàn)嚴(yán)重的水樣變性或脂肪變性，甚至壞死，伴炎癥細(xì)胞浸潤；水飛薊素組小鼠肝小葉結(jié)構(gòu)基本正常，但肝細(xì)胞排列紊亂，可見少量肝細(xì)胞水樣變性或脂肪變性，偶見壞死，伴炎癥細(xì)胞浸潤；與模型組比較，犁頭草提取物各劑量組明顯改善小鼠肝小葉結(jié)構(gòu)，不同程度地減少 CCl4誘導(dǎo)肝損傷中肝細(xì)胞中的炎性細(xì)胞浸潤、水腫和壞死等，見圖2。

組別ALT(IU/L)AST(IU/L)ALP(IU/L)GGT(IU/L)TB(mg/dl)正常對(duì)照組48.43±1.3558.53±1.7868.34±2.3442.23±1.630.58±0.01模型組138.23±7.581)213.54±9.871)187.47±16.321)134.56±7.341)1.69±0.051)水飛薊素64.35±6.184)76.58±6.324)82.23±4.234)58.68±3.894)0.75±0.074)犁頭草提取低劑量組124.32±6.452)156.45±15.623)152.15±7.543)108.36±6.353)1.25±0.083)犁頭草提取中劑量組92.46±2.344)128.73±7.544)1103.42±6.163)83.355±2.874)1.03±0.044)犁頭草提取高劑量組67.32±3.184)86.54±6.124)85.23±5.464)63.52±4.564)0.83±0.074)

與正常對(duì)照組比較：1)P<0.001；與模型組比較：2)P<0.05，3)P<0.01，4)P<0.001；下表同

組別肝臟組織SOD(U/mg)CAT(U/mg)MDA(nmol/mg)GSH(mg/g)腎臟組織SOD(U/mg)CAT(U/mg)MDA(nmol/mg)GSH(mg/g)正常對(duì)照組285.15±5.4568.53±2.161.47±0.049.18±0.25234.65±3.6558.65±1.652.25±0.058.56±0.35模型組179.25±10.861)32.53±3.181)3.52±0.201)3.76±0.181)125.68±6.341)19.05±4.341)4.35±0.151)3.65±0.081)水飛薊素組241.54±5.872)61.25±2.354)1.64±0.094)8.72±0.344)206.98±4.613)42.65±2.784)2.65±0.084)7.34±0.324)犁頭草提取物低劑量組208.07±9.253)42.14±1.082)2.87±0.082)4.23±0.162)138.65±10.352)26.34±4.352)4.13±0.163)4.12±0.081)犁頭草提取物中劑量組234.04±6.323)51.35±2.073)2.18±0.053)6.65±0.313)174.31±12.054)31.65±4.164)3.42±0.084)5.86±0.232)犁頭草提取物高劑量組258.45±8.164)60.25±3.074)1.75±0.044)7.89±0.154)198.61±7.534)38.34±4.054)2.95±0.074)7.34±0.084)

圖2 各組小鼠肝組織病理切片(HE，×200)

3 討 論

CCl4是典型的致急性肝損傷物質(zhì)，高活性的代謝產(chǎn)物直接或間接導(dǎo)致的肝細(xì)胞脂質(zhì)過氧化作用，導(dǎo)致許多活性物質(zhì)如各種轉(zhuǎn)氨酶和磷酸酶就會(huì)從肝臟逸出〔8〕。肝細(xì)胞出現(xiàn)嚴(yán)重的水樣變性或脂肪變性，甚至壞死，伴炎癥細(xì)胞浸潤有關(guān)，從病理學(xué)觀察可以得到驗(yàn)證〔9〕。CCl4經(jīng)肝臟微粒體混合功能氧化酶系統(tǒng)作用后，生成三氯甲基游離基(·CCl3)，·CCl3基的反應(yīng)非常迅速，與氧反應(yīng)生成CCl3OO·〔10〕。這些自由基與蛋白質(zhì)和脂類反應(yīng)除去氫原子的不飽和脂質(zhì)從而引發(fā)脂質(zhì)過氧化，導(dǎo)致細(xì)胞膜和肝組織損傷的完整性的損失〔8〕。GSH、SOD和CAT為關(guān)鍵抗氧化酶，防止氧化損傷〔11〕。SOD轉(zhuǎn)化為H2O2和O2，從而參與其他抗氧化酶對(duì)氧的毒性，在酶促防御中，CAT是抗氧化防御系統(tǒng)的關(guān)鍵組成部分。這種保護(hù)機(jī)制的靈敏度增強(qiáng)的結(jié)果會(huì)抑制自由基誘導(dǎo)細(xì)胞的損傷。CAT的減少可能會(huì)導(dǎo)致許多有害的影響〔12〕。GSH是另一個(gè)抗氧化的參數(shù)，在肝臟和腎臟的氧化損傷中，GSH是對(duì)抗自由基的第一道防線。在CCl4處理的大鼠中，肝GSH活性降低表明對(duì)肝細(xì)胞的損害程度。MDA 是自由基攻擊生物膜中的多不飽和脂肪酸而引發(fā)的脂質(zhì)過氧化作用的最終分解產(chǎn)物,其含量的多少可反映組織細(xì)胞的脂質(zhì)過氧化速率或強(qiáng)度〔13〕。MDA 含量異常增高會(huì)引起細(xì)胞損傷。本研究表明利用CCl4致昆明小鼠損傷后，小鼠的肝和腎組織中SOD、CAT和GSH明顯降低，MDA的含量明顯增加，通過犁頭草提取物不同劑量的治療，肝腎組織中的SOD、CAT和GSH的含量都明顯提高，而MDA的含量明顯降低。

綜上所述，犁頭草提取物對(duì) CCl4誘導(dǎo)小鼠肝損傷具有保護(hù)作用，且具有結(jié)構(gòu)特異性，其保護(hù)機(jī)制可能與清除自由基，減輕脂質(zhì)過氧化，保護(hù)肝細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)和功能的完整性；提高肝細(xì)胞內(nèi)SOD、CAT、GSH活性，增強(qiáng)機(jī)體抗氧化能力。

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〔2015-08-05修回〕

(編輯 苑云杰/曹夢(mèng)園)

河北省自然科學(xué)基金項(xiàng)目(C2009001007)

1 河北省灤平中醫(yī)院

張 雷(1976-)，男，碩士，副教授，主要從事醫(yī)學(xué)教育研究。

R285

A

1005-9202(2017)07-1605-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.07.016