蛋白磷酸酶2A Cα在昆蟲桿狀病毒中的表達(dá)及活性

渠 靜 鄭 媛 任曉曦 鄭 焱 楊 慧 張建亮

(首都醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院神經(jīng)生物學(xué)系 北京腦重大疾病研究院教育部神經(jīng)變性病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100069)

蛋白磷酸酶2A Cα在昆蟲桿狀病毒中的表達(dá)及活性

渠 靜 鄭 媛 任曉曦 鄭 焱 楊 慧 張建亮

(首都醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院神經(jīng)生物學(xué)系 北京腦重大疾病研究院教育部神經(jīng)變性病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100069)

目的 利用昆蟲桿狀病毒系統(tǒng)表達(dá)蛋白磷酸酶(PP)2A Cα亞基并進(jìn)行活性分析。方法 先將PP2A Cα構(gòu)建進(jìn)入昆蟲桿狀病毒表達(dá)載體，然后將其轉(zhuǎn)染到昆蟲細(xì)胞Sf9中并進(jìn)行蛋白表達(dá)，最后檢測(cè)PP2A Cα的功能。結(jié)果 Western印跡結(jié)果表明PP2A Cα蛋白已經(jīng)在昆蟲細(xì)胞成功表達(dá);PP2A活性檢測(cè)和GST pull-down實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明PP2A Cα蛋白既有生物學(xué)功能，又有結(jié)構(gòu)學(xué)功能。結(jié)論 昆蟲桿狀病毒載體系統(tǒng)可以成功表達(dá)有活性的PP2A Cα蛋白。

昆蟲桿狀病毒；蛋白磷酸酶2A

蛋白磷酸酶(PP)2A參與DNA復(fù)制、RNA剪接、基因表達(dá)、細(xì)胞代謝、分化及凋亡等活動(dòng)過程，并且與老年疾病的發(fā)生發(fā)展有著密切聯(lián)系〔1，2〕。在帕金森病(PD)中，α-突觸核蛋白(α-Syn)可以使PP2A活性上調(diào)，從而使酪氨酸羥化酶(TH)去磷酸化，抑制TH活性，進(jìn)而抑制多巴胺的生物合成〔3〕。在阿爾茨海默病(AD)中，PP2A活性降低，抑制tau去磷酸化，使tau蛋白過度磷酸化，進(jìn)而形成神經(jīng)元纖維纏結(jié)〔4〕；PP2A活性降低也會(huì)增加β淀粉樣蛋白(Aβ)生成〔5〕。因此，PP2A已成為老年疾病研究的焦點(diǎn)之一。PP2A由結(jié)構(gòu)亞基-A和催化亞基-C形成核心酶，然后再和調(diào)節(jié)亞基-B組成全酶；其中C亞基有α和β兩種異構(gòu)體，它在PP2A活性的調(diào)節(jié)中起著極其重要的作用。但是目前，PP2A確切的調(diào)節(jié)機(jī)制還不十分清楚。昆蟲桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)是近年來備受青睞的真核表達(dá)系統(tǒng)，利用桿狀病毒作為外源基因的載體，通過感染昆蟲細(xì)胞來表達(dá)外源蛋白，具有安全性好、蛋白表達(dá)量高、可以同時(shí)表達(dá)多個(gè)基因等優(yōu)點(diǎn)〔6〕。本研究利用昆蟲桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)，在昆蟲細(xì)胞內(nèi)表達(dá)PP2A Cα亞基，從而得到PP2A Cα蛋白，進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)證明其結(jié)構(gòu)完整、活性穩(wěn)定。

1 材料和方法

1.1 材料 昆蟲細(xì)胞Sf9，DH10Bac大腸桿菌細(xì)胞，pFastBacTM質(zhì)粒購自Invitrogen公司；Sf-900 Ⅱ無血清培養(yǎng)基購自美國Gibco公司；聚醚酰亞胺購自美國Sigma公司；PP2A活性比色法定量檢測(cè)試劑盒購自Genmed公司；His抗體購自Abcam公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染 昆蟲細(xì)胞Sf9采用SF-900Ⅱ無血清的培養(yǎng)基，置于27℃的搖床上進(jìn)行懸浮培養(yǎng)。Bacmid用聚醚酰亞胺(PEI)轉(zhuǎn)染到Sf9細(xì)胞中。

1.2.2 重組質(zhì)粒的構(gòu)建 用限制性內(nèi)切酶EcoRⅠ和XhoⅠ將PP2A Cα基因從質(zhì)粒pcDNA3.1中切出，亞克隆到質(zhì)粒pFastBacTM的相應(yīng)酶切位點(diǎn)，得到質(zhì)粒pFastBac-PP2A Cα(圖1)，經(jīng)過酶切鑒定以及測(cè)序進(jìn)行確認(rèn)。

1.2.3 重組昆蟲桿狀病毒的構(gòu)建 將構(gòu)建好的pFastBac-PP2A Cα轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH10Bac感受態(tài)細(xì)胞，在含有卡那霉素、慶大霉素、四環(huán)素和X-gal的固體LB培養(yǎng)基上培養(yǎng)，進(jìn)行藍(lán)白斑篩選。將白色的單菌斑進(jìn)行培養(yǎng)，抽提得到重組bacmid，然后通過PCR進(jìn)行鑒定。用脂質(zhì)介導(dǎo)法將bacmid轉(zhuǎn)染到昆蟲細(xì)胞Sf9中，72 h后得到培養(yǎng)基上清，即為第1代重組昆蟲桿狀病毒。加入第1代重組昆蟲桿狀病毒感染正常的Sf9細(xì)胞，擴(kuò)增依次得到第2代昆蟲桿狀病毒。

A：pFastBac載體以及PP2A Cα插入片段的示意圖;B：pFastBac-PP2A Cα的酶切鑒定圖；1:DNA ladder；2和3:pFastBac-PP2A Cα的酶切圖(pFastBac:4 800 bp;PP2A Cα:900 bp)圖1 pFastBac-PP2A Cα的質(zhì)粒構(gòu)建以及酶切鑒定圖

1.2.4 重組蛋白的表達(dá)與檢測(cè) 取第2代重組昆蟲桿狀病毒加入到正常的Sf9細(xì)胞中進(jìn)行蛋白表達(dá)。3 d后收取細(xì)胞,離心得到細(xì)胞沉淀，提取蛋白質(zhì)。提取的蛋白質(zhì)用于SDS-PAGE和Western印跡檢測(cè)。按照每個(gè)孔道2 μg 蛋白上樣，經(jīng)過15%的SDS-PAGE分離蛋白質(zhì)，半干法將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)至PVDF膜。PVDF膜用5%(體積分?jǐn)?shù))的脫脂牛奶室溫封閉1 h，與鼠抗人單克隆抗His抗體(1∶2 000)于室溫反應(yīng)2 h，然后與抗鼠熒光二抗(1∶10 000)于室溫反應(yīng)1 h，用Odyssey Infrared成像系統(tǒng)檢測(cè)。

1.2.5 PP2A活性檢測(cè) 根據(jù)文獻(xiàn)〔7,8〕，參照Genmed試劑盒提供的使用說明書檢測(cè)PP2A活性。

1.2.6 GST pull-down實(shí)驗(yàn) 將含有GST標(biāo)簽的α-Syn蛋白與GST珠子在4℃結(jié)合1 h，然后加入提取的PP2A Cα蛋白，在4℃結(jié)合3 h，500 r/min離心5 min；棄掉上清，然后加入400 μl 0.1 mol/L的PBS洗滌，500 r/min離心5 min；重復(fù)洗10次，棄掉上清，加入10 μl的上樣緩沖液，95℃變性10 min；吸取上清用于Western印跡分析。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用Prism6.0軟件行多因素方差分析。

2 結(jié) 果

2.1 PP2A Cα基因擴(kuò)增與克隆 將PP2A Cα基因克隆到載體pFastBac上(圖1A為示意圖)，使用EcoRⅠ和XhoⅠ進(jìn)行雙酶切鑒定，結(jié)果表明PP2A Cα基因克隆已成功克隆到pFastBac上(圖1B)。經(jīng)測(cè)序進(jìn)一步鑒定，結(jié)果與預(yù)期設(shè)計(jì)一致。

2.2 重組桿狀病毒的克隆篩選 重組bacmid轉(zhuǎn)化體的菌落應(yīng)呈白色，而非重組bacmid轉(zhuǎn)化體的菌落應(yīng)為藍(lán)色(圖2)。挑取白色的單菌斑進(jìn)行培養(yǎng)，抽提得到重組桿狀病毒基因組DNA。以提取的bacmid為模板，用通用引物M13進(jìn)行PCR鑒定，擴(kuò)增結(jié)果見圖3。重組的PP2A Cα bacmid大小應(yīng)為3 200 bp，而非重組的bacmid為300 bp。筆者選取bacmid 2和3進(jìn)行后面的實(shí)驗(yàn)。

白色的單菌斑應(yīng)為PP2A Cα bacmid，藍(lán)色的應(yīng)為空載bacmid圖2 藍(lán)白斑篩選重組桿狀病毒

1:DNA ladder;2和3:bacmid of PP2A Cα(3 200 bp);4:control bacmid (300 bp)圖3 重組桿狀病毒PCR鑒定

2.3 重組蛋白的表達(dá) SDS-PAGE檢測(cè)結(jié)果顯示，在分子量為36 kD處有條帶。為了進(jìn)一步檢測(cè)目的基因表達(dá)，使用Western印跡檢測(cè)，結(jié)果顯示在分子量為36 kD處的確有目的基因表達(dá)蛋白,表明PP2A Cα蛋白表達(dá)成功。見圖4。

A：SDS-PAGE檢測(cè)PP2A Cα蛋白水平；B：Western印跡檢測(cè)PP2A Cα蛋白水平圖4 重組PP2A Cα蛋白在昆蟲細(xì)胞Sf9中的表達(dá)

2.4 PP2A Cα的功能鑒定 表達(dá)的PP2A Cα蛋白活性是對(duì)照組的4倍，表明從細(xì)胞中表達(dá)的PP2A Cα有生物學(xué)活性(圖5A)。

GST pull-down實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示(圖5B)，PP2A Cα可以與α-Syn相互作用。以上結(jié)果表明，本研究提取的PP2A Cα既有生物學(xué)活性，又有結(jié)構(gòu)學(xué)功能。

圖5 PP2A Cα蛋白的活性分析

3 討 論

PP2A是一個(gè)重要的絲/蘇氨酸殘基蛋白磷酸酶，可以使許多病理性蛋白去磷酸化，包括與PD相關(guān)的α-Syn蛋白、酪氨酸羥化酶、與AD相關(guān)的tau蛋白等，因此參與了老年疾病的發(fā)生發(fā)展過程〔9～15〕。為了在體內(nèi)體外實(shí)驗(yàn)中探索PP2A功能,有必要建立一種高效的PP2A Cα重組蛋白表達(dá)體系。常見的蛋白表達(dá)系統(tǒng)包括原核和真核表達(dá)系統(tǒng)。原核表達(dá)系統(tǒng)最常見的是大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)，但該系統(tǒng)會(huì)產(chǎn)生包涵體，而且不能產(chǎn)生一些翻譯后修飾，這些都不利于重組蛋白保持天然的結(jié)構(gòu)和功能；而真核表達(dá)系統(tǒng)可以表達(dá)具有天然結(jié)構(gòu)和功能的蛋白，是獲得重組蛋白的良好途徑。常見真核表達(dá)系統(tǒng)包括酵母表達(dá)系統(tǒng)、昆蟲細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)及哺乳動(dòng)物表達(dá)系統(tǒng)。其中昆蟲細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)是目前備受人們推崇的真核表達(dá)系統(tǒng)，該系統(tǒng)主要是利用桿狀病毒作為外源基因的載體通過感染昆蟲細(xì)胞來表達(dá)外源蛋白，具有很多優(yōu)點(diǎn)，如安全性好、蛋白表達(dá)量高、可以同時(shí)表達(dá)多個(gè)基因等。

首先，筆者利用昆蟲桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)，成功構(gòu)建了PP2A Cα的重組桿狀病毒，并轉(zhuǎn)染到昆蟲細(xì)胞Sf9中，SDS-PAGE和Western印跡檢測(cè)結(jié)果顯示有大量的PP2A Cα蛋白表達(dá)；之后，筆者使用活性檢測(cè)試劑盒檢測(cè)到了該蛋白活性高于對(duì)照組4倍，表明從該體系中表達(dá)的PP2A Cα不但表達(dá)量高，而且還具有良好的生物學(xué)活性。

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〔2016-11-01修回〕

(編輯 曲 莉)

Expression of protein phosphatase 2A Cα by the insect baculovirus and its activity analysis

QU Jing, ZHENG Yuan, REN Xiao-Xi,etal.

Department of Neurobiology, School of Basic Medical Sciences, Capital Medical University, Center for Parkinson′s Disease, Beijing Institute for Brain Disorder, Key Laboratory for Neurodegenerative Disease of Ministry of Education, Beijing 100069, China

Objective To construct the recombinant baculovirusof protein phosphatase 2A(PP2A)Cα and express the PP2A Cα protein in insect cells.Methods Firstly,the gene of PP2A Cα was cloned into pFastBac and transpositioned into the genome of insect baculovirus.Then, the PP2A Cα protein was expressed in the insect Sf9 cells by the recombinant baculovirus.Finally, PP2A Cα activity was assayed.Results The protein of PP2A Cα was successfully expressed in the insect cells and it showed its biological activity.Conclusions The insect baculovirus could be used to express the PP2A Cα protein.

Insect baculovirus;Protein phosphatase 2A

國家自然科學(xué)基金(31271136,31571202)；北京市屬高等學(xué)校青年拔尖人才培養(yǎng)計(jì)劃(CIT&TCD201504087)；北京市教委科技計(jì)劃(KZ201210025020)

張建亮(1976-)，男，副教授，主要從事帕金森病相關(guān)蛋白結(jié)構(gòu)功能關(guān)系的研究。

渠 靜(1990-)，女，在讀碩士，主要從事帕金森病相關(guān)蛋白結(jié)構(gòu)功能關(guān)系的研究。

R816

A

1005-9202(2017)07-1571-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.07.004