rs3660單核苷酸多態(tài)性與非霍奇金淋巴瘤相關(guān)性研究

趙桂敏，高玉環(huán)，劉麗宏，吳曉琳，高哲，刁蘭萍

（河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院血液科，石家莊050000）

rs3660單核苷酸多態(tài)性與非霍奇金淋巴瘤相關(guān)性研究

趙桂敏，高玉環(huán)，劉麗宏，吳曉琳，高哲，刁蘭萍

（河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院血液科，石家莊050000）

目的評(píng)估KRT81基因的3’端非翻譯區(qū)miRNA結(jié)合位點(diǎn)rs3660單核苷酸多態(tài)性（miR?SNP）對(duì)非霍奇金淋巴瘤（NHL）患者癌癥風(fēng)險(xiǎn)和臨床預(yù)后的影響。方法采用連接酶檢測(cè)rs3660 SNP分型；對(duì)數(shù)秩檢驗(yàn)及Kaplan Meier方法分析rs3660與NHL生存相關(guān)性。采用Cox比例風(fēng)險(xiǎn)模型進(jìn)行多因素生存分析。結(jié)果rs3660基因分型在病例組及對(duì)照組中分布無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P=0.50）?；颊邤y帶rs3660 CG/CC基因型與GG基因型比較顯示較長(zhǎng)的生存時(shí)間（P=0.012）。此外，多因素分析證明rs3660與NHL患者總體生存率獨(dú)立相關(guān)（RR=0.589，95%CI：0.415～0.832，P=0.004）。在外周T細(xì)胞淋巴瘤亞型中也觀察到了這種miR?SNP對(duì)患者預(yù)后的影響價(jià)值。結(jié)論KRT81rs3660 GG基因型是NHL預(yù)后的獨(dú)立預(yù)測(cè)標(biāo)志。

單核苷酸多態(tài)性；KRT81基因；rs3660；非霍奇金淋巴瘤；相關(guān)

人類非霍奇金淋巴瘤（non?Hodgkin’s lympho?ma，NHL）已躍居世界第五大癌癥，發(fā)病率逐年增加［1］。NHL是一種異質(zhì)性腫瘤，有不同的生物侵襲性和臨床過(guò)程。彌漫型大B細(xì)胞淋巴瘤（diffuse large B cell lymphoma，DLBCL）、外周T細(xì)胞淋巴瘤（peripheral T cell lymphoma，PTCL）和濾泡淋巴瘤（fol?licular lymphoma，F(xiàn)L）是最常見(jiàn)的NHL亞型。雖然NHL是可以治愈的疾病，但有些患者常規(guī)化療后不能達(dá)到完全緩解［2］。許多臨床因素（年齡、分期、淋巴結(jié)或結(jié)外侵犯數(shù)目、體能狀態(tài)、B癥狀和某些生化指標(biāo)）已確定作為NHL預(yù)后的預(yù)測(cè)因素。這些因素組合成各種臨床預(yù)后指標(biāo)，包括針對(duì)DLBCL、PTCL患者的國(guó)際預(yù)后指數(shù)（international prognostic index，IPI）和針對(duì)FL患者的濾泡IPI（FIPI）［3?4］，但是這些預(yù)后指標(biāo)與臨床預(yù)后并不完全一致。影響NHL患者預(yù)后的潛在基因機(jī)制還不清楚，許多研究［5］結(jié)果促使研究基因變異在NHL預(yù)后的預(yù)測(cè)能力。

MicroRNA（miRNA）是長(zhǎng)度約22個(gè)核苷酸的新型非編碼小RNA，它參與多種生物活動(dòng)（發(fā)育、分化、凋亡、生存、衰老、翻譯抑制），并促進(jìn)信使RNA（mRNA）的降解和代謝［6?7］。超過(guò)700個(gè)miRNA在人類已確定，這些miRNA負(fù)責(zé)調(diào)節(jié)至少30%的蛋白編碼基因的表達(dá)［8］。具體來(lái)說(shuō)，miRNA的目標(biāo)核苷酸2?8在5’端，被稱為“種子區(qū)”的信使RNA的3’非翻譯區(qū)。最近研究［9］表明，位于miRNA結(jié)合位點(diǎn)的單核苷酸多態(tài)性（single nucleotide polymorphisms of miRNA binding sites，miR?SNP）可以調(diào)節(jié)癌基因、抑癌基因或基因的致癌途徑而促進(jìn)癌變。本研究探討miRNA結(jié)合位點(diǎn)KRT81基因的3’端非翻譯區(qū)的rs3660單核苷酸多態(tài)性與NHL患癌風(fēng)險(xiǎn)及預(yù)后的相關(guān)性。

1 材料與方法

1.1 組織標(biāo)本和DNA提取

血液樣本收集于2004年至2011年期間河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院血液科接受化療和完成隨訪的188例NHL患者（NHL組），并獲得完整臨床資料。NHL診斷依據(jù)WHO腫瘤分類。同時(shí)血液樣本也收集120例健康體檢者作為對(duì)照組。基因組DNA應(yīng)用向?qū)Щ蚪MDNA提取試劑盒（美國(guó)Proega公司）立即提取。所有程序都獲得河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院倫理委員會(huì)監(jiān)督和批準(zhǔn)。所有參與者均知情同意。

1.2 miR?SNP的基因分型

使用連接酶檢測(cè)反應(yīng)方法對(duì)miRNA結(jié)合位點(diǎn)KRT81rs3660進(jìn)行基因分型。KRT81基因引物（上游，5’?GTTAGGCACCCCAACTCAAGT?3’；下游，5’?GCCAGCGGACTTCTTTCTAGG?3’）擴(kuò)增DNA片段根據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/ snp）。聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）應(yīng)用PCR混合試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行。連接產(chǎn)品應(yīng)用ABI 3730XL基因分析儀分離。連接用的探針是S1（5’?TTTTTTTTAGCAAGTGCTCAGCTACTTCT CCTC?3’），S2（5’?TTTTTTTTTTTAGCAAGTGCT CAGCTACTTCTCCTG?3’）和S3（5’?CACTTTGAAAG ACCCCTCCCACTCCTTTTTT?3’）。多態(tài)性被證實(shí)是基于連接產(chǎn)物的長(zhǎng)度差異。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

應(yīng)用SPSS 18.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，2個(gè)樣本率（構(gòu)成比）比較采用χ2檢驗(yàn)。生存曲線使用Kaplan?Meier方法計(jì)算，生存曲線之間的比較應(yīng)用對(duì)數(shù)秩檢驗(yàn)。多因素生存分析使用Cox比例風(fēng)險(xiǎn)模型。P< 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 NHL患者的臨床特征

患者在隨訪過(guò)程中無(wú)失訪，每3個(gè)月評(píng)估1次，為期5年，188例NHL患者包括94例DLBCL，65例 PTCL，其他29例，通過(guò)單因素和多因素分析進(jìn)行評(píng)估。采用對(duì)數(shù)秩檢驗(yàn)分析5年隨訪期間收集的數(shù)據(jù)與患者臨床特征之間的關(guān)系。臨床特征中Ann Ar?bor分期、乳酸脫氫酶（lactic dehydrogenase，LDH）水平、骨髓有無(wú)浸潤(rùn)和B癥狀顯示與患者5年生存率潛在相關(guān)。調(diào)整Cox風(fēng)險(xiǎn)模型使用多因素分析后發(fā)現(xiàn)，Ann Arbor分期、LDH水平和B癥狀認(rèn)為是NHL生存的獨(dú)立預(yù)測(cè)因子，見(jiàn)表1。

2.2 rs3660基因型與NHL癌癥風(fēng)險(xiǎn)和預(yù)后相關(guān)性

結(jié)果顯示，對(duì)照組中GG基因型75例，CG+CC基因型45例，NHL組患者中GG基因型111例，CG+ CC基因型77例，2組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P= 0.50）。認(rèn)為rs3660 SNP在NHL患癌癥風(fēng)險(xiǎn)方面沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的關(guān)聯(lián)（P>0.05）。對(duì)數(shù)秩檢驗(yàn)評(píng)估rs3660 SNP與NHL總體生存相關(guān)性發(fā)現(xiàn)，患者rs3660 GG基因型和CG/CC基因型5年生存率分別為20.3%、37.2%（P=0.012）。Cox比例風(fēng)險(xiǎn)模型多因素分析發(fā)現(xiàn)，rs3660SNP可確定為NHL總生存的獨(dú)立預(yù)測(cè)因子（RR=0.589，95%CI：0.415～0.832，P= 0.004），見(jiàn)表1，圖1。

圖1 rs3660基因型與NHL生存相關(guān)性Fig.1 The genotype of rs3660 associated with NHL survival

2.3 rs3660與NHL亞型預(yù)后的相關(guān)性

結(jié)果顯示對(duì)于PTCL，GG型患者的5年生存率為11.3%，而CG/CC型患者為30.9%。2者差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.030），調(diào)整Ann Arbor分期、骨髓浸潤(rùn)、血清LDH水平和B癥狀后利用多因素分析發(fā)現(xiàn)，rs3660可確定為PTCL預(yù)后獨(dú)立預(yù)測(cè)因素（RR= 0.345；95%CI：0.163～0.742；P=0.007），見(jiàn)表2、圖2。對(duì)于DLBCL，這個(gè)miR?SNP對(duì)生存的預(yù)測(cè)能力無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見(jiàn)表3。

表1 單因素和多因素分析臨床特點(diǎn)、miR?SNP與NHL生存的關(guān)系Tab.1 Univariate and multivariate analysis of clinical factors and miR?SNP associated with NHL survival

圖2 rs3660基因型與PTCL生存相關(guān)性Fig.2 The association of rs3660 genotype with PTCL survival

3 討論

本研究發(fā)現(xiàn)rs3660 SNP與NHL患癌風(fēng)險(xiǎn)無(wú)關(guān)；KRT81rs3660 GG基因型患者的生存時(shí)間比CG或CC基因型更短；多因素分析表明，KRT81rs3660 GG基因型是NHL生存的一個(gè)獨(dú)立預(yù)后變量。PTCL亞組分析結(jié)果與此一致。

在miRNA結(jié)合位點(diǎn)的單核苷酸多態(tài)性，與miRNA自身多態(tài)性一樣，是疾病表型的關(guān)鍵因素［10］。少量被識(shí)別的miRNA結(jié)合位點(diǎn)的單核苷酸多態(tài)性對(duì)癌癥風(fēng)險(xiǎn)和生存相關(guān)［11］。miRNA在細(xì)胞核中被轉(zhuǎn)錄和加工，然后輸出到細(xì)胞質(zhì)進(jìn)一步加工，最終大多數(shù)情況下通過(guò)RNA誘導(dǎo)沉默復(fù)合體結(jié)合到目的mRNA的3’非翻譯區(qū)。miRNA和目標(biāo)mRNA的互補(bǔ)序列由于RNA沉默誘導(dǎo)蛋白水平減少［12］。研究miR?SNP打開(kāi)了新的癌癥生物學(xué)和臨床腫瘤學(xué)研究領(lǐng)域，尤其在危險(xiǎn)分層、對(duì)治療的反應(yīng)等方面［13］。KRT81編碼一種Ⅱ型角蛋白Hb?1。角蛋白在所有類型上皮細(xì)胞表達(dá)，在維護(hù)細(xì)胞完整性、蛋白質(zhì)合成和細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)發(fā)揮重要作用［14?15］。角蛋白由于不同的表達(dá)方式可以作為腫瘤標(biāo)志物和預(yù)后指標(biāo)［16］。DE LARREA等［17］指出KRT81rs3660在多發(fā)性骨髓瘤與腫瘤復(fù)發(fā)時(shí)間和總生存有關(guān)。在蛋白質(zhì)水平已經(jīng)證明KRT81?mir?17結(jié)合改變雜交過(guò)程可能影響RNA?miRNA結(jié)合結(jié)構(gòu)格式化過(guò)程。根據(jù)他們的研究，這種rs3660多態(tài)性可能影響KRT81功能，從而在腫瘤的發(fā)生中起作用。本研究證明KRT81rs3660與NHL生存有關(guān)。推測(cè)該位點(diǎn)的變相結(jié)合能力可以推斷KRT81功能和NHL的過(guò)程。

表2 單因素和多因素分析臨床特點(diǎn)、miR?SNP與PTCL生存的關(guān)系Tab.2 Univariate and multivariate analysis of clinical factors and miR?SNP associated with PTCL survival

綜上所述，miRNA結(jié)合位點(diǎn)基因型變異可影響癌癥患者的預(yù)后，rs3660 SNP可確定為NHL預(yù)后的獨(dú)立標(biāo)志。在miRNA結(jié)合位點(diǎn)的基因多態(tài)性分析可以幫助識(shí)別高危人群。本研究?jī)H初步探討了miRNA結(jié)合位點(diǎn)的單核苷酸多態(tài)性，此結(jié)論需要進(jìn)一步研究來(lái)驗(yàn)證。

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表3 單因素和多因素分析臨床特點(diǎn)、miR?SNP與DLBCL生存的關(guān)系Tab.3 Univariate and multivariate analysis of clinical factors and miR?SNP associated with DLBCL survival

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（編輯 武玉欣）

Association of rs3660 Single Nucleotide Polymorphisms with Non?Hodgkin’s Lymphoma

ZHAO Guimin，GAO Yuhuan，LIU Lihong，WU Xiaolin，GAO Zhe，DIAO Lanping
（Department of Hematology，The Fourth Hospital，Hebei Medical University，Shijiazhuang 050000，China）

ObjectiveTo evaluate the effect of single?nucleotide polymorphisms at the miRNA binding site rs3660 in the 3’?untranslated region of theKRT81gene（miR?SNPs）on the cancer risk and clinical prognosis of non?Hodgkin’s lymphomas（NHL）.MethodsThe single?nucleo?tide polymorphisms of rs3660 was genotyped with ligation detection reaction method.The association of rs3660 with NHL survival was calculated with log?rank test using Kaplan?Meier method.Multivariate survival analysis was performed using a Cox proportional hazards model.ResultsThe rs3660 genotype distribution difference was not statistically significant between the case and control group（P=0.50）.Patients carrying the rs3660 CG/CC genotype exhibited a significantly longer survival time than patients carrying the GG genotype（P=0.012）.In addition，rs3660 was associated independently with the survival of NHL patients in multivariate analysis（RR=0.589，95%CI：0.415?0.832，P=0.004）.The associ?ation of this miR?SNP with NHL survival was further confirmed in the peripheral T cell lymphoma（PTCL）subtype.ConclusionOur results in?dicate thatKRT81rs3660 GG type is an independent prognostic marker in NHL.

miR?SNP；KRT81；rs3660；non?Hodgkin’s lymphoma；correlation

R733.4

A

0258-4646（2017）04-0321-05

10.12007/j.issn.0258?4646.2017.04.009

河北省科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目（135200）

趙桂敏（1978-），男，主治醫(yī)師，碩士.

刁蘭萍，E-mail：diaolanping@163.com

2016-09-16

網(wǎng)絡(luò)出版時(shí)間：