Akt和SRC在Exosomes促進(jìn)同源肺癌細(xì)胞遷移中的作用

解世林，曲晶磊，范一博，車曉芳，侯科佐，曲秀娟，劉云鵬，王曉楠，康健，胡雪君

（中國醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院1.呼吸疾病研究所老年病呼吸感染科；2.腫瘤內(nèi)科，遼寧省抗腫瘤藥物與生物治療重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室；3.呼吸疾病研究所呼吸內(nèi)科，沈陽110001）

·論著·

Akt和SRC在Exosomes促進(jìn)同源肺癌細(xì)胞遷移中的作用

解世林1，曲晶磊2，范一博2，車曉芳2，侯科佐2，曲秀娟2，劉云鵬2，王曉楠1，康健3，胡雪君1

（中國醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院1.呼吸疾病研究所老年病呼吸感染科；2.腫瘤內(nèi)科，遼寧省抗腫瘤藥物與生物治療重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室；3.呼吸疾病研究所呼吸內(nèi)科，沈陽110001）

目的研究肺癌細(xì)胞來源的Exosomes對其分泌細(xì)胞及同源腫瘤細(xì)胞遷移的影響，初步探討PI3K/Akt和SRC信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在此過程中的作用。方法采用密度梯度離心法，從肺癌細(xì)胞A549的上清液中分離出肺癌細(xì)胞來源的Exosomes，利用透射電子顯微鏡觀察Exosomes的形態(tài)，用Western blotting實(shí)驗(yàn)觀察蛋白的表達(dá)。Transwell實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞的遷移能力。結(jié)果透射電子顯微鏡下觀察肺癌A549細(xì)胞來源的Exosomes，其具有特征性的盤狀結(jié)構(gòu)，由雙層膜構(gòu)成，直徑30～100 nm。Western blotting結(jié)果顯示Exosomes表面富含CD9分子。A549細(xì)胞來源的Exosomes以劑量依賴性的方式促進(jìn)A549和其同源腫瘤細(xì)胞HCC827細(xì)胞的遷移，并伴隨Akt和SRC的活化。結(jié)論肺癌細(xì)胞來源的Exosomes能促進(jìn)其分泌細(xì)胞和同源腫瘤細(xì)胞的遷移，其機(jī)制可能與Akt和SRC的活化有關(guān)。

Exosomes；遷移；肺癌；Akt；SRC

Exosomes是納米級的由細(xì)胞分泌至胞外的囊性小泡體［1］。多種類型的細(xì)胞都可分泌Exosomes，其中包括腫瘤細(xì)胞、免疫細(xì)胞和上皮細(xì)胞等［2?4］。近年來，研究熱點(diǎn)主要集中于腫瘤細(xì)胞及免疫細(xì)胞分泌的Exosomes。有研究［5］顯示，腫瘤細(xì)胞來源的Exosomes可改變其周圍的微環(huán)境，從而促進(jìn)腫瘤的轉(zhuǎn)移。然而，Exosomes是否能影響其分泌細(xì)胞及同源腫瘤細(xì)胞的遷移能力及其機(jī)制尚不清楚。本研究探討了肺腺癌細(xì)胞A549分泌的Exosomes對自身及同源腫瘤細(xì)胞HCC827遷移能力的影響，以及PI3K/Akt和SRC通路在其中的作用，為進(jìn)一步闡明肺癌來源的Exosomes對轉(zhuǎn)移的自我調(diào)控機(jī)制提供新思路。

1 材料與方法

1.1 材料

CD9、β?actin抗體購自Santa Cruze公司，phosph?Akt、Akt、phosph?SRC、SRC抗體購自美國Cell Sig?naling公司，Transwell小室購自美國Corning公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)

肺癌細(xì)胞系A(chǔ)549、HCC827購自上海細(xì)胞庫。人肺癌細(xì)胞A549、HCC827生長于含有12 U/L慶大霉素、100 mL/L滅活胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液中，于37℃、5%CO2的孵育箱內(nèi)培養(yǎng)，2 d左右傳代1次。所有實(shí)驗(yàn)均采用對數(shù)生長期細(xì)胞。

1.3 Exosomes的制備

肺癌A549細(xì)胞在培養(yǎng)48 h后，收集上清液，以備提取Exosomes。首先，在4℃條件下，將收集的細(xì)胞上清液通過多步驟離心，去除細(xì)胞及細(xì)胞碎片（300g5 min、2 000g20 min、10 000g70 min）。然后將上清液移入高速離心管中，100 000g120 min。離心管中加滿PBS溶液，再次4℃100 000g120 min離心。得到提純的Exosomes沉淀。PBS 450 μL重懸，0.22 μm濾膜除菌，Bardford法測定蛋白含量，分裝后，-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 電鏡

Exosomes超速離心成的沉淀，于4℃經(jīng)固定液（2%多聚甲醛，2.5%戊二醛）固定1 h，PBS洗滌后，再經(jīng)l%鋨酸固定，梯度乙醇脫水，環(huán)氧樹脂包埋、聚合。最后，超薄切片、鉛鈾染色，于透射電子顯微鏡下觀察并攝片。

1.5 Western blotting檢測蛋白表達(dá)

提取A549細(xì)胞來源的Exosomes，經(jīng)超聲破碎后加入上樣緩沖液，煮沸5 min。不同濃度（0 μg/mL，5 μg/mL，20 μg/mL）Exosomes作用于對數(shù)生長期的A549細(xì)胞48 h后，同時(shí)收集A549細(xì)胞，將其裂解，與3×樣品緩沖液混合后，煮沸5 min。將Exosomes樣品和A549細(xì)胞裂解物進(jìn)行聚丙烯酰胺（SDS?PAGE）凝膠電泳，濕法轉(zhuǎn)印至硝酸纖維素膜上。5%脫脂牛奶封閉1 h后，分別加入一抗，以辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗鼠IgG作為二抗，ECL法顯色，GIS凝膠圖像分析系統(tǒng)照相并處理。

1.6 Transwell法檢測細(xì)胞遷移能力

采用6.5 mm直徑、10 μm厚度、8 μm孔徑的聚碳酸酯多孔濾膜（24孔板Transwell小室）。將A549或HCC827細(xì)胞（3.0×104個(gè)）懸浮于200 μL無血清RPMI1640培養(yǎng)液中，并種植在小室的上層。下室加入含2.5%血清RPMI1640培養(yǎng)液500 μL。實(shí)驗(yàn)組加入15 μg/mL Exosomes，對照組加入同體積的PBS溶液。37℃培養(yǎng)24 h后，用PBS輕輕沖洗上室，用棉簽去除膜上層未遷移的細(xì)胞。37℃風(fēng)干20 min后，將小室膜進(jìn)行瑞氏吉姆薩法固定、染色1 h。PBS沖洗風(fēng)干后，于顯微鏡下觀察穿膜細(xì)胞數(shù)，隨機(jī)取5個(gè)視野，計(jì)數(shù)5個(gè)視野穿膜細(xì)胞總數(shù)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)至少3次。遷移增加率=100%×（實(shí)驗(yàn)組穿膜細(xì)胞數(shù)-對照組穿膜細(xì)胞數(shù)）/對照組穿膜細(xì)胞數(shù)。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。所得數(shù)據(jù)均為3次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)結(jié)果，用x±s表示。2組之間比較采用t檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 A549細(xì)胞來源的Exosomes的驗(yàn)證

透射電子顯微鏡下觀察，肺癌A549細(xì)胞的上清液中分離出腫瘤來源的Exosomes為雙層膜構(gòu)成的盤狀結(jié)構(gòu)，直徑約30～100 nm（圖1A）。進(jìn)一步用Western blotting檢測Exosomes的標(biāo)志性蛋白，即四次跨膜分子CD9。結(jié)果發(fā)現(xiàn)Exosomes與等量的細(xì)胞裂解物相比，富含有更多的外泌體標(biāo)志性蛋白CD9（圖1B）。證明成功提取了A549細(xì)胞來源的Exosomes。

圖1 肺腺癌A549細(xì)胞來源的Exosomes的驗(yàn)證×50 000Fig.1 Validation of exosomes isolated from the lung adenocar?cinoma cells，A549×50 000

2.2 肺癌細(xì)胞A549來源的Exosomes促進(jìn)其分泌細(xì)胞的遷移

Transwell法檢測A549細(xì)胞來源的Exosomes作用于A549細(xì)胞后，遷移能力的變化。結(jié)果表明，15 μg/mL A549來源的Exosomes作用于其自身24 h后，細(xì)胞的遷移能力明顯提高（P<0.05），見圖2。

圖2 A549來源的Exosomes促進(jìn)A549細(xì)胞的遷移瑞氏吉姆薩法Fig.2 Exosomes derived from A549 cells promoted migration of A549 cells#Giemsa staining

2.3 Exosomes促進(jìn)同源肺癌細(xì)胞HCC827的遷移

用Transwell法檢測Exosomes作用于肺癌細(xì)胞HCC827后，細(xì)胞遷移能力的變化。結(jié)果表明，15μg/mL A549來源的Exosomes作用于HCC827細(xì)胞24 h后，細(xì)胞的遷移能力明顯提高（P<0.01），見圖3。

2.4 Exosomes誘導(dǎo)其分泌細(xì)胞中Akt和SRC的活化

圖3 A549來源的Exosomes促進(jìn)HCC827細(xì)胞的遷移瑞氏吉姆薩法×20Fig.3 Exosomes isolated from A549 cells promoted the migration of HCC827 cells Giemsa staining×20

Western blotting檢測不同濃度的Exosomes作用于A549細(xì)胞48 h后，Akt和SRC的表達(dá)變化。結(jié)果表明，A549細(xì)胞來源的Exosomes可以劑量依賴性的方式促進(jìn)A549細(xì)胞中Akt和SRC的活化。

3 討論

Exosomes是細(xì)胞主動分泌至胞外的小囊泡，攜帶其來源細(xì)胞的重要遺傳信息，介導(dǎo)細(xì)胞間的信息交流，促進(jìn)腫瘤的增殖及轉(zhuǎn)移等過程［6?7］。已有文獻(xiàn)報(bào)告，肺癌來源的Exosomes可促其轉(zhuǎn)移，然而其是否能促進(jìn)其分泌細(xì)胞自身和同源腫瘤細(xì)胞的遷移及其機(jī)制尚不明確。

圖4 Western blotting檢測不同濃度的Exosomes作用于A549細(xì)胞后蛋白的表達(dá)Fig.4 Western blotting depicting the exosome?specific protein expression in response to treatment of the A549 cells with exosomes of different concentrations

既往研究［8］顯示腫瘤來源的Exosomes可改變其微環(huán)境，從而促進(jìn)腫瘤的轉(zhuǎn)移。胰腺癌來源的Exo?somes可引發(fā)轉(zhuǎn)移前位（niche）形成，從而促進(jìn)胰腺癌細(xì)胞向肝臟轉(zhuǎn)移［9］；慢性淋巴細(xì)胞白血病細(xì)胞來源的Exosomes誘導(dǎo)間充質(zhì)干細(xì)胞轉(zhuǎn)變成癌相關(guān)成纖維細(xì)胞，從而促進(jìn)慢性淋巴細(xì)胞白血病細(xì)胞遷移［10］。然而肺癌來源的Exosomes是否可影響其分泌細(xì)胞及其同源腫瘤細(xì)胞的遷移尚不明確。本研究結(jié)果顯示，將A549細(xì)胞來源的Exosomes作用于其分泌細(xì)胞及同源腫瘤細(xì)胞后，遷移能力明顯增強(qiáng)，提示肺癌細(xì)胞來源的Exosomes可促進(jìn)其分泌細(xì)胞及其同源腫瘤細(xì)胞的遷移。

既往研究［5，11?13］證實(shí)，PI3k/Akt信號通路和SRC的活化促進(jìn)胃癌、腸癌及乳腺癌等多種實(shí)體腫瘤的轉(zhuǎn)移。近年的研究［14］顯示，肺癌細(xì)胞來源的Exo?somalintegrins α6β4 and α6β1可通過激活肺癌細(xì)胞的SRC，促進(jìn)其轉(zhuǎn)移；肺腺癌細(xì)胞來源的Exosomes中的促腫瘤轉(zhuǎn)移分子轉(zhuǎn)移金屬蛋白酶組織抑制劑?1可通過PI3K/Akt的活化，促進(jìn)肺癌A549細(xì)胞的進(jìn)展及轉(zhuǎn)移［15］。本研究發(fā)現(xiàn)，A549細(xì)胞分泌的Exosomes以劑量依賴性的方式激活A(yù)kt和SRC，促進(jìn)A549細(xì)胞的遷移能力增強(qiáng)。這些結(jié)果提示，肺癌來源的Exosomes可能通過激活A(yù)kt和SRC信號通路促進(jìn)其分泌細(xì)胞及同源肺癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移。

綜上所述，肺癌來源的Exosomes不僅能夠促進(jìn)其分泌細(xì)胞的遷移，同時(shí)還可促進(jìn)同源細(xì)胞的遷移，并伴隨Akt和SRC的活化，提示PI3K/Akt及SRC通路是Exosomes促進(jìn)其分泌細(xì)胞的遷移機(jī)制之一。本研究為進(jìn)一步明確肺癌細(xì)胞自我調(diào)控遷移的機(jī)制和尋找治療肺癌的靶分子提供重要的科學(xué)依據(jù)，具有潛在的臨床應(yīng)用價(jià)值。

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（編輯 于溪）

Role of Akt and SRC Pathways in Exosome?mediated Migration of Homologous Lung Adenocarninoma Cells

XIE Shilin1，QU Jinglei2，F(xiàn)AN Yibo2，CHE Xiaofang2，HOU Kezuo2，QU Xiujuan2，LIU Yunpeng2，WANG Xiaonan1，KANG Jian3，HU Xuejun1
（1.Institute of Respiratory Disease，Department of Respiratory and Infectious Disease of Geriatrics，The First Hospital，China Medical University，Shenyang 110001，China；2.Department of Medical Oncology，The First Hospital，China Medical University，Shenyang 110001，China；3.Institute of Respiratory Disease，Department of Respiratory Medicine，The First Hospital，China Medical University，Shenyang 110001，China）

ObjectiveTo investigate the effect of Exosomes derived from lung cancer cells on the migration of secretory cells and homologous tu?mor cells and to explore the role of PI3K/Akt and SRC signaling pathways in this process.MethodsExosomes were isolated from the supernatant post density gradient centrifugation of A549，lung cancer cells.Morphology of the Exosomes was studied using transmission electron microscopy. Protein expression was analyzed using Western blotting.Cell migration was analyzed by a transwell assay.ResultsThe double?membrane?bound Exosomes appeared as discal?shaped structures，30?100 nm in diameter.Western blotting showed that CD9 was abundant in the Exosomes.The Exosomes promoted the migration of A549 cells and their homologous tumor cells，HCC827 in a dose?dependent manner，accompanied by the acti?vation of Akt and SRC.ConclusionThe Exosomes derived from A549（lung cancer）cells promote the migration of the secreting cells and the homologous tumor cells.The mechanism may be correlated with the activation of Akt and SRC.

Exosomes；migration；lung cancer；Akt；SRC

R734.2

A

0258-4646（2017）04-0294-04

10.12007/j.issn.0258?4646.2017.04.002

國家自然科學(xué)基金（81372546，81472193）；遼寧省科學(xué)技術(shù)計(jì)劃（2014226033，2014225013，L2014296）；遼寧省教育廳重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室基礎(chǔ)研究（LZ2014037）

解世林（1987-），女，助教，碩士.

胡雪君，E-mail：huxuejun2008@hotmail.com

2016-10-12

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