益脾養(yǎng)肝方對大鼠肝癌前病變病理形態(tài)和脾臟T細(xì)胞亞群的影響*

郭英君 郭英 魏海梁 馮飛雪 李京濤 閆曙光 郭輝 常占杰

1.寧夏回族自治區(qū)人民醫(yī)院 (寧夏 銀川, 750001) 2.陜西中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院 3.陜西中醫(yī)藥大學(xué)

肝癌的形成通常要經(jīng)過“肝炎-肝硬化-肝癌”三個階段，而在肝硬化到肝癌的演進(jìn)過程中，存在一個比較長的癌前病變階段[1]，若能及時阻止此階段的惡性進(jìn)展，就有可能阻止肝癌的發(fā)生，但目前西醫(yī)缺乏有效的治療藥物。中醫(yī)藥抑制腫瘤的作用可能弱于化學(xué)藥物，但是在調(diào)節(jié)人體機(jī)能方面具有優(yōu)勢。我們前期研究發(fā)現(xiàn)益脾養(yǎng)肝方(YPYGF)具有抗肝癌癌前病變的效果[2,3]，研究的初步結(jié)果顯示其主要通過抗癌前病變細(xì)胞增殖(PCNA)和抗氧化損傷(GGT)方面起作用[4]。本實驗擬從免疫調(diào)控方面，進(jìn)一步探討YPYGF對肝癌癌前病變大鼠肝臟病理形態(tài)和脾臟組織T細(xì)胞亞群的影響，為YPYGF治療肝癌癌前病變提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 實驗動物 選取SPF級Wistar雄性大鼠80只，體質(zhì)量為180～220g，均購于第四軍醫(yī)大學(xué)實驗動物中心(許可證號：SCXK(軍)-2012-0007)，飼養(yǎng)在陜西中醫(yī)藥大學(xué)實驗中心，飼養(yǎng)室溫(23±2)℃、相對濕度(50±5)%，實驗動物自由進(jìn)食水，適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后進(jìn)入實驗。

1.2 實驗試劑和藥品 益脾養(yǎng)肝方(按成人每日劑量：白花蛇舌草、白術(shù)、黨參各30g、、鱉甲、枸杞、半枝蓮各15g，郁金、姜黃、熟地各10g)，由陜西中醫(yī)藥大學(xué)藥劑科購買并制備成凍干粉，每1克凍干粉含生藥5g,4℃冰箱密封保存，需要時以100℃沸水溶解，配制成大劑量濃度為1.0g/ml、小劑量濃度為0.5g/ml的中藥藥液。CD3+、CD4+和CD8+一抗以及二抗均購自美國BD公司；0.95g/ml 二乙基亞硝胺(DEN)購自美國Sigma公司；

1.3 動物分組、造模及給藥方法 所有大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后進(jìn)行實驗，按隨機(jī)數(shù)字表法隨機(jī)分為空白組、模型組、YPYGF大、小劑量組，每組20只。除空白組以外其余各組腹腔注射DEN(0.5ml/100g)，2次/周(即1次/84h)，連續(xù)造模給藥至16周；YPYGF小、大劑量組按10ml/kg分別以中藥灌胃(0.5g/ml，1.0 g/ml)，每日一次；同時，空白組、模型組給予等劑量生理鹽水灌胃，第16周處死大鼠。

1.4 取材及指標(biāo)測量 第16周灌胃24h后稱重，10%水合氯醛腹腔注射(0.3ml/100g)麻醉，心臟取血3ml，于陜西中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院生化檢驗科檢測肝功能指標(biāo)；處死大鼠后再解剖腹腔，于肝左葉、右葉、尾葉取材，將其置于10%甲醛溶液固定，常規(guī)HE和Masson染色，光鏡觀察；同時，取1/2脾臟組織制備冰凍切片，免疫熒光染色觀察CD3+、CD4+、CD8+T細(xì)胞亞群變化。

1.5 脾臟組織免疫熒光檢測 OCT包埋脾臟后液氮冰凍；切6μm組織切片；丙酮固定3min，PBS泡洗5min；晾干，加50-100μl封閉液覆蓋組織，室溫避光封閉2-3h；甩干，加相應(yīng)的抗體，避光，4℃過夜；PBS泡洗3次，15min/次，加二抗室溫孵育2小時；抗熒光淬滅劑封片，共聚焦顯微鏡觀察拍照。

1.6 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件處理實驗數(shù)據(jù)，以方差分析進(jìn)行組間比較，方差齊者采用單因素方差分析中LSD進(jìn)行檢驗，方差不齊者采用Tamhane’sT2檢驗，P<0.05具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠肝功能變化情況 見表1。

表1 各組大鼠肝功能結(jié)果比較

與模型組比較，*P<0.05，**P<0.01

2.2 各組大鼠肝臟組織病理情況 肉眼觀察，模型組大鼠肝臟表面散在分布大小不均淡黃色顆粒狀結(jié)節(jié)，肝臟邊緣不整齊；而YPYGF大小、劑量組均較模型組明顯好轉(zhuǎn)。HE染色示：模型組肝組織有大量假小葉的形成，肝臟組織結(jié)構(gòu)混亂，匯管區(qū)可見微膽管，動、靜脈大量增生并向肝竇內(nèi)浸潤，肝竇間隙變小，伴炎性細(xì)胞聚集，可見細(xì)胞水腫、脂肪變性和異性增生灶，伴有異型增生和結(jié)節(jié)形成；同時，可見細(xì)胞胞核呈分葉狀伴偏移，核質(zhì)比增大；YPYGF大小劑量組較大鼠模型組肝臟病理形態(tài)顯著改善，異性增生灶明顯較少，較少出現(xiàn)脂肪變、水腫壞死區(qū)，假肝小葉相對較少，肝細(xì)胞核分裂相減少，核質(zhì)比相對降低，炎性細(xì)胞向匯管區(qū)和肝竇內(nèi)的浸潤顯著減少。Masson染色示：模型組大鼠肝臟組織中可見大量纖維條索將肝臟組織分割形成假小葉，而YPYGF大小劑量組纖維條索明顯減少，肝臟分隔減少，且大劑量組比小劑量組更明顯。

2.3 各組大鼠脾臟組織T細(xì)胞亞群情況 與空白組比較，模型組大鼠脾臟組織T細(xì)胞亞群CD3+、 CD4+T表達(dá)陽性區(qū)域顯著減少，CD8+T細(xì)胞的陽性區(qū)域數(shù)目增加；與模型組比較，益脾養(yǎng)肝方組大鼠脾臟組織T細(xì)胞亞群CD3+、CD4+表達(dá)陽性區(qū)域數(shù)目增長，CD8+則降低。提示益脾養(yǎng)肝方可能通過調(diào)節(jié)大鼠肝癌前病變脾臟組織CD3+、CD4+和CD8+T細(xì)胞數(shù)目的異常，從而發(fā)揮抗肝癌前病變的作用。

3 討論

肝癌癌前病變在祖國傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)中并沒有明確的概念，多以肝癌發(fā)生后患者的臨床表現(xiàn)來命名，如“臌脹”、“積聚”、“黃疸”等。中醫(yī)學(xué)強(qiáng)調(diào)“未病先防，既病防變”，在肝硬化向肝癌惡性轉(zhuǎn)變的過程，應(yīng)用有效的單味中藥、復(fù)方制劑以及提取物進(jìn)行綜合治療，起到延緩、阻止甚或逆轉(zhuǎn)肝癌癌前病變的惡性轉(zhuǎn)變。

肝癌的形成主因本虛標(biāo)實，而正氣虧虛導(dǎo)致臟腑陰陽失調(diào)，毒邪凝結(jié)不祛，日久虛、瘀、毒互結(jié)為有形實邪，更致病情加重?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)認(rèn)為：機(jī)體免疫功能降低，會失去對周圍環(huán)境的適應(yīng)性調(diào)節(jié)能力，進(jìn)而導(dǎo)致組織結(jié)構(gòu)、功能發(fā)生病理性改變，導(dǎo)致肝炎病毒、內(nèi)毒素等有機(jī)可乘，侵犯人體導(dǎo)致疾病的發(fā)生；同時，免疫細(xì)胞因為被破壞、消耗，更失去了對腫瘤細(xì)胞的免疫監(jiān)視和清除能力，從而導(dǎo)致肝硬化、肝癌的形成[5,6]。益脾養(yǎng)肝方是我科沿用多年的防治肝硬化進(jìn)展的臨床常用方，該方以黨參、白術(shù)、熟地、枸杞健運(yùn)脾胃、補(bǔ)養(yǎng)肝腎，先天、后天得養(yǎng)，機(jī)體御邪之力倍增；半枝蓮、白花蛇舌草解毒散結(jié)抗癌；郁金行氣化瘀，姜黃合鱉甲，散瘀行氣，消積散結(jié)，以上諸藥共奏益脾養(yǎng)肝，解毒散結(jié)之功。藥理研究發(fā)現(xiàn)：白術(shù)揮發(fā)油具有促進(jìn)胃腸蠕動的功效[7]，也可調(diào)節(jié)免疫抑制動物模型T細(xì)胞亞群分布失調(diào)狀態(tài)，使 Th淋巴細(xì)胞表達(dá)上調(diào)，Th/Ts比例升高，促進(jìn) IL-2的分泌和 Th-R2的表達(dá)[8]；黨參提取物可提高免疫抑制小鼠NK細(xì)胞活性、B淋巴細(xì)胞和T淋巴細(xì)胞增殖能力，同時可拮抗CXT誘發(fā)的脾臟萎縮、白細(xì)胞減少等不良反應(yīng)[9]；枸杞多糖可顯著抑制H22荷瘤小鼠腫瘤細(xì)胞的增殖，增加胸腺、脾臟的指數(shù)，進(jìn)一步增強(qiáng)細(xì)胞免疫和體液免疫功能，上調(diào)血清中IL-2、TNF-α的表達(dá)，從而通過免疫增強(qiáng)途徑實現(xiàn)對腫瘤的抑制效應(yīng)[10]；熟地黃可促進(jìn)免疫損傷小鼠效應(yīng)記憶性T細(xì)胞(TEM)比例下降和Th細(xì)胞亞群比例失衡的盡早恢復(fù)，有利于免疫功能的重建[11]；半枝蓮多糖可顯著促進(jìn)移植性H22肝癌小鼠胸腺、脾臟重量和單核細(xì)胞的吞噬指數(shù)，提高IL-2的表達(dá)，發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)和抗腫瘤作用[12]；白花蛇舌草聯(lián)合半枝蓮可增加晚期非小細(xì)胞肺癌患者治療效果，調(diào)節(jié)T淋巴細(xì)胞亞群CD3+、CD4+、CD8+表達(dá)及CD4+/CD8+的比例[13]。

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