丹參水提液對染鎘大鼠腎損傷的干預作用

張倩倩, 何 玲, 滕玉蓮, 呂曉云

(1. 蘭州大學第二醫(yī)院, 甘肅 蘭州, 730030;2. 廣東省珠海市第二人民醫(yī)院, 廣東 珠海, 519000;3. 蘭州大學校醫(yī)院, 甘肅 蘭州, 730030; 4. 蘭州大學中西醫(yī)結合研究所, 甘肅 蘭州, 730030)

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丹參水提液對染鎘大鼠腎損傷的干預作用

張倩倩1, 何 玲2, 滕玉蓮3, 呂曉云4

(1. 蘭州大學第二醫(yī)院, 甘肅 蘭州, 730030;2. 廣東省珠海市第二人民醫(yī)院, 廣東 珠海, 519000;3. 蘭州大學校醫(yī)院, 甘肅 蘭州, 730030; 4. 蘭州大學中西醫(yī)結合研究所, 甘肅 蘭州, 730030)

目的 探討丹參水提液對染鎘大鼠腎損傷的干預作用及其可能的作用機制。方法 健康Wistar大鼠，雌雄各20只，鼠齡6周。適應性喂養(yǎng)1周，隨機分組，空白組8只，模型組32只，空白組腹腔注射生理鹽水5 mL/(kg·d)，模型組以2.8 mg/(kg·d)氯化鎘溶液腹腔注射。連續(xù)造模4周，觀察大鼠一般情況，檢測大鼠腎功能指標、腎臟組織病理改變。造模成功后，將模型組隨機分為給藥組、陰性、陽性對照組及空白對照組。給藥組[丹參水提液高劑量2.7 g/(kg·d)、丹參水提液低劑量1.35 g/(kg·d)]灌胃，陽性對照組亞硒酸鈉溶液0.05 mg/(kg·d)灌胃，陰性及空白對照組給予同體積生理鹽水2.7 mL/(kg·d)。各組治療10周，實驗終末收集血清、尿液，并留取腎臟組織，待檢測。結果 丹參水提液低、高劑量組24 h尿量低于陰性對照組，而血清超氧化物歧化酶(SOD)明顯升高，丙二醛(MDA)顯著降低，總抗氧化能力(T-AOC)增強明顯，血尿素氮、血清肌酐含量降低，尿蛋白(β2-MG)含量下降。病理切片可見陰性對照組腎臟近曲小管上皮細胞渾濁、腫脹變性、壞死; 丹參水提液低、高劑量組血清、皮質(zhì)鎘含量低于陰性對照組; 丹參水提液低、高劑量組凋亡率低于陰性對照組。結論 丹參水提液能加速體內(nèi)鎘代謝，可有效干預鎘致腎損傷，有助于延緩慢性腎功能衰竭，改善腎功能，保護腎臟。

丹參水提液; 鎘; 腎損傷; 抗氧化損傷; 細胞凋亡

隨著世界經(jīng)濟的飛速發(fā)展，全球范圍內(nèi)出現(xiàn)了越來越多的重金屬鎘污染事件，嚴重威脅到人類生命健康[1-2]。本研究探討丹參水提液對鎘致腎臟損傷的干預作用，現(xiàn)報告如下。

1 資料與方法

1.1 藥物與試劑

氯化鎘(分析純)，批號130309，天津市光復科技發(fā)展有限公司; 亞硒酸鈉(分析純)，批號070510, 上海中秦化學試劑有限公司; 丹參中藥飲片，批號20151006, 岷縣蘅陽中藥材有限責任公司; 血肌酐試劑盒(批號20151015)、尿素氮試劑盒(批號20150928)、SOD、MDA試劑盒，批號分別為20151102、20151023, 均有南京建成生物工程研究所提供; 血清總抗氧化能力(T-AOC)試劑盒(批號20151005); 尿β2-MG(蘭州大學第一醫(yī)院中心實驗室檢驗)。

1.2 中藥煎煮方法

丹參生藥飲片用自來水浸泡30 min, 用水量以輕壓藥材時水高出藥平面約2 cm為宜。將浸泡好的丹參飲片加水至液面淹沒過飲片約2～3 cm, 用砂鍋進行煎煮，未沸前用武火，沸后用文火、小火保持微沸狀態(tài)，煎煮20～30 min后提取藥汁，濾渣重新提取煎煮10～20 min提取濾液。將2次濾液進行合并濃縮得到含有生藥量為0.5 g/mL丹參水提取液[3], 分裝入玻璃瓶置于4℃冰箱備用，用時升至室溫搖勻后再進行灌胃。

1.3 實驗儀器

超凈工作臺(蘇凈集團安泰公司)、全自動生化分析儀(瑞士羅氏公司)、 離心機(上海安亭科技儀器廠)、721型分光光度計(杭州匯爾儀器有限公司)、顯微鏡(廣州啟躍光電儀器有限公司)、原子吸收法分光光度計石墨爐法(德國耶拿分析儀器股份公司)、流式細胞儀(美國Beekman coulter公司)、醫(yī)學實驗室用干燥箱(寧波新芝生物科技股份有限公司)、實驗室用恒溫水浴箱(杭州三浦精密儀器有限公司)。

1.4 動物分組與給藥

健康的Wistar大鼠，雌雄各20只，鼠齡6周，喂以常規(guī)飼料，保持溫度20℃～25℃, 濕度40%～70%, 適應性喂養(yǎng)1周后，隨機分為2組，分別是空白對照組、模型組?？瞻讓φ战M8只，模型組32只，常規(guī)飼養(yǎng)，空白對照組腹腔注射生理鹽水5 mL/(kg·d), 模型組以2.8 mg/(kg·d)氯化鎘溶液腹腔注射，即配制的氯化鎘溶液5 mL/(kg·d)。連續(xù)4周后，觀察大鼠一般情況，體質(zhì)量變化，檢測大鼠腎功能指標、尿β2-MG、SOD、MDA以及腎組織病理學改變。于造模成功后，將模型組隨機分為給藥組(丹參水提液高劑量組、丹參水提液低劑量組)、陰性對照組、陽性對照組。自實驗開始第4周后，給藥組給予丹參水提液高劑量2.7g/(kg·d)、丹參水提液低劑量1.35 g/(kg·d)灌胃，陽性對照組給予亞硒酸鈉溶液0.05 mg/(kg·d)灌胃，陰性對照組、空白對照組給予同體積生理鹽水灌胃2.7 mL/(kg·d)。

1.5 標本采集與組織處理

1.5.1 尿液、血清采集：在實驗進行的第14周末用代謝籠收集大鼠尿液，收集時間為24 h, 尿液收集過程中大鼠禁食禁水，收集完畢測量尿量; 次日大鼠禁食不禁水，再次收集尿液，放置-20 ℃冰箱保存，待測大鼠尿β2-MG含量; 在實驗進行的第14周末，對大鼠實施腹腔麻醉，從眼底靜脈叢采血，血液靜置45 min后，進行離心，然后收集所有血清，標注清楚分組名稱、收集時間，放置-20 ℃冰箱中保存[4]。待使用分光光度計測定 SOD、MDA、T-AOC; 采用苦味酸比色法檢測血清肌酐(Cr), 血肌酐、尿素氮均采用瑞士羅氏公司的全自動生化分析儀進行檢測; 使用原子吸收法分光光度計石墨爐法檢測尿鎘、血鎘含量; 采用原子吸收光譜法進行檢測血清微量元素。

1.5.2 腎臟組織處理：在實驗進行的第14周末，稱取各組大鼠的體質(zhì)量，取血后將大鼠固定在固定板上，剪毛，從腹部解剖，暴露心尖，用鑷子夾起左心室，灌流針刺入左心室0.5 cm, 并用止血鉗固定。剪開右心耳，讓血液流出，用生理鹽水行心臟灌流，直至腸管腫脹，停止灌流[5]。迅速摘取大鼠兩側腎臟除去包膜并稱重，待計算腎臟質(zhì)量系數(shù); 迅速將左側腎臟置于超凈工作臺，制作腎皮質(zhì)細胞懸液，用AnnexinV/PI雙染法進行腎皮質(zhì)細胞凋亡率檢測; 右側腎臟一部分進行HE染色，另一部分待用石墨爐法檢測腎皮質(zhì)鎘含量[6]。

1.6 統(tǒng)計學方法

實驗各個分組所測數(shù)據(jù)均利用統(tǒng)計軟件SPSS 22.0進行分析，結果以平均數(shù)±標準差表示，空白對照組、陽性對照組、陰性對照組、丹參水提液低劑量組、丹參水提液高劑量組之間分析采用單因素方差分析。P<0.05或P<0.01為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1 大鼠一般狀況觀察

造模后，空白對照組大鼠精神狀態(tài)良好，皮毛舒展有光澤，食欲佳，活動頻繁、反應敏捷靈活，體質(zhì)量逐漸增加，剩余其他分組大鼠精神狀態(tài)較差、嗜睡、不愛活動、皮毛粗糙雜亂、食欲不振，反應遲鈍，體質(zhì)量增加緩慢。治療后，陽性對照組、丹參水提液低、高劑量組大鼠皮毛逐漸恢復光滑色澤，食欲增加、活動量增加、體質(zhì)量增加的幅度變大，但陰性對照組大鼠一般狀況變化不明顯。

2.2 各組大鼠的體質(zhì)量比較

造模型后，模型組與空白對照組相比有顯著差異(P<0.05); 治療后，陰性對照組與空白對照組相比有顯著差異(P<0.05), 陽性對照組、丹參水提液低、高劑量組與陰性對照組相比有顯著差異(P<0.05)。見表1。

表1 丹參水提液對鎘染毒大鼠體質(zhì)量的影響 g

與空白對照組比較, *P<0.05, **P<0.01; 與陰性對照組比較, #P<0.05。

2.3 各組大鼠24 h尿量及腎臟質(zhì)量系數(shù)比較

造模后模型組尿量顯著高于空白對照組(P<0.01); 治療后，陰性對照組較空白對照組尿量顯著增加(P<0.01); 高劑量組尿量顯著低于陰性對照組(P<0.01); 陰性對照組、陽性對照組大鼠腎臟質(zhì)量系數(shù)與空白對照組相比有顯著差異(P<0.01); 丹參水提液低劑量組、丹參水提液高劑量組與空白對照組比較無顯著差異(P>0.05), 丹參水提液低、高劑量組與陰性對照組比較有顯著差異(P<0.01), 見表2。

表2 丹參水提液對鎘染毒大鼠腎臟質(zhì)量系數(shù)、24 h尿量的影響

與空白對照組比較, *P<0.05, **P<0.01; 與陰性對照組比較, #P<0.05, ##P<0.01。

2.4 各組血清SOD、MDA、T-AOC比較

造模后，模型組血清SOD含量顯著低于空白對照組(P<0.01); 治療后，丹參水提液低、高劑量組、陽性對照組血清SOD含量顯著高于陰性對照組(P<0.05); 造模后模型組血清MDA含量顯著高于空白對照組(P<0.05)。治療后，丹參水提液低、高劑量組、陽性對照組血清MDA含量顯著低于陰性對照組(P<0.01)，見表3。治療后，陽性對照組、陰性對照組、丹參水提液低劑量組血清中總抗氧化能力(T-AOC)與空白照組比較有顯著降低(P<0.05); 丹參水提液高劑量組與空白對照組比較無顯著變化(P>0.05), 見表4。

表3 丹參水提液對鎘染毒大鼠SOD、MDA含量的影響

與空白對照組相比, *P<0.05, **P<0.01; 與陰性對照組相比, #P<0.05, ##P<0.01。

表4 丹參水提液對鎘染毒大鼠血清 總抗氧化能力的影響 U/mL

與空白對照組比較, *P<0.05;

與陰性對照組比較, #P<0.05, ##P<0.01。

2.5 各組血尿素氮、血清肌酐、尿β2-MG比較

造模后，模型組的血尿素氮、血清肌酐、尿β2-MG含量組間無顯著差異(P>0.05); 陽性對照組、丹參水提液低劑量組、丹參水提液高劑量組與空白對照組相比有顯著升高(P<0.01)。分析治療后結果顯示，丹參水提液高劑量組血尿素氮、血清肌酐、尿β2-MG含量與空白組比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05); 丹參水提液高劑量組血尿素氮、血清肌酐、尿β2-MG含量顯著低于陰性對照組(P<0.05)，說明利用丹參水提液高劑量進行治療取得了一定的效果; 陽性對照組、丹參水提液低劑量組血尿素氮的結果顯著低于陰性對照組(P<0.05)。見表5、圖1。

表5 丹參水提液對鎘染毒大鼠血尿素氮、血清肌酐含量的影響

與空白對照組比較, *P<0.05, **P<0.01; 與陰性對照組比較, #P<0.05, ##P<0.01。

與空白對照組相比,*P<0.05,**P<0.01;與陰性對照組相比,△P<0.05。圖1 丹參水提液對鎘染毒大鼠尿β2-MG含量的影響

2.6 各組腎臟組織病理學觀察比較

光鏡下空白組腎小管管腔清晰，上皮細胞形狀非常規(guī)則且排列很整齊，腎小球結構完好。陰性組上皮細胞呈現(xiàn)渾濁，排列凌亂，有變性、壞死，腎小管管腔狹窄，沒有活性癥狀。陽性組可見部分腎小管腔不規(guī)則，細胞核位于上皮細胞的管腔側，腎小球有輕微的變性癥狀[7]。丹參低劑量組上皮細胞稍有渾濁腫脹，也可見上皮細胞核位于細胞的最頂端，腎小球結構有輕微受損。丹參高劑量組上皮細胞結構正常，腎小球可見上皮細胞輕微渾濁，結構稍有損傷，基本屬于正常。

2.7 各組腎皮質(zhì)鎘、尿鎘及血鎘含量比較

模型組腎皮質(zhì)含鎘量均顯著高于空白對照組(P<0.05); 模型組尿鎘含量均顯著高于空白對照組(P<0.01); 丹參水提液低、高劑量組血鎘含量與陰性對照組有顯著差異(P<0.05), 見表6。

表6 丹參水提液對鎘染毒大鼠腎皮質(zhì)、尿及血鎘含量的影響

與空白對照組比較, *P<0.05, **P<0.01; 與陰性對照組比較, #P<0.05, ##P<0.01。

2.8 各組大鼠血清中微量元素比較

造模后，模型組血清中鐵、鋅含量與空白照組比較均顯著降低(P<0.05)。陽性對照組、陰性對照組血清中銅、鈣含量比空白對照組顯著減少(P<0.05); 丹參水提液低、高劑量組血清中銅、鈣含量與空白對照組相比差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05), 丹參水提液低、高劑量組血清中銅、鐵、鋅、鈣含量顯著高于陰性對照組(P<0.05)。見表7。

表7 丹參水提液對鎘染毒大鼠血清中銅、鐵、鋅、鈣含量的影響 mg/L

與空白對照組比較, *P<0.05; 與陰性對照組比較, #P<0.05。

2.9 各組腎皮質(zhì)細胞凋亡率比較

檢測結果顯示，陰性對照組與空白對照組相比早期、晚期凋亡率以及總凋亡率顯著升高 (P<0.01); 陽性對照組與空白組相比早期凋亡率、晚期凋亡率顯著升高(P<0.05); 丹參水提液低、高劑量組與空白對照組相比早、晚、總凋亡率無顯著差異(P>0.05); 丹參水提液高劑量組與陰性對照組相比早期凋亡率顯著降低(P<0.05); 陽性對照組、丹參水提液低、高劑量組晚期和總凋亡率與陰性對照組相比均顯著降低(P<0.01)。見表8。

表8 丹參水提液對鎘染毒大鼠腎皮質(zhì)細胞凋亡率的影響 %

與空白對照組比較, *P<0.05, **P<0.01; 與陰性對照組比較, #P<0.05, ##P<0.01。

3 討 論

3.1 亞硒酸鈉液對隔致腎損傷的作用機制

亞硒酸鈉液中的硒為人體必需的微量元素之一，具有抑制癌細胞生長，阻斷癌細胞的能量供應，有抗癌發(fā)生的作用; 具有調(diào)節(jié)維生素A、C、E、K的吸收與利用的作用，可預防近視、白內(nèi)障等缺硒類疾病的發(fā)生，提高抗病能力; 具有調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)的合成的功能，可預防由于人體中硒含量不足導致的遺傳染色體損傷及蛋白質(zhì)能量缺乏。硒在體內(nèi)發(fā)揮著重要的生理功能，是不可或缺的微量元素，而腎臟是硒代謝和儲存的重要器官，是動物或者人體內(nèi)的一個大“硒”庫，腎內(nèi)硒含量非常高。本實驗選擇亞硒酸鈉液作為陽性對照組，其對隔致腎損傷的作用機制有以下幾個方面。

3.1.1 亞硒酸鈉液可提高腎小球濾過率，減輕炎癥發(fā)生：腎臟是一個重要的耗氧器官，當機體受重金屬污染而患腎臟病時，腎內(nèi)慢性缺氧導致腎臟內(nèi)產(chǎn)生大量氧自由基，從而可導致腎臟發(fā)生損傷，并最后導致腎小球硬化、腎小管萎縮及腎間質(zhì)纖維化。亞硒酸鈉液中的硒是谷胱甘肽過氧化物酶(GPx)的合成成份，具有清除體內(nèi)自由基，減少脂質(zhì)過氧化物氧化反應，降低機體的氧化損傷的作用; 硒還有拮抗一些重金屬毒性的作用，一方面硒是體內(nèi)抗氧化系統(tǒng)的重要組成成分，能明顯改善重金屬誘導的脂質(zhì)過氧化反應，減輕重金屬元素對人體的毒害; 另一方面硒與金屬有很強的親和力，可在體內(nèi)與重金屬結合成金屬硒蛋白復合物，從而可降低重金屬的毒性作用。

3.1.2 亞硒酸鈉液對腎臟有保護作用，減輕毒素對腎侵害：亞硒酸鈉液中的硒具有良好的解毒功能，能促使一些重金屬從腎臟排泄，拮抗這些重金屬引起的腎臟損害。LIU Yang等[9]動物實驗研究表明，硒能夠抑制隔導致的c-Jun氨基末端激酶(JNK)通路的活化及細胞凋亡，硒作為一種抗氧化微量元素在鎘引起JNK通路的激活及誘導細胞凋亡中起到一定的干預作用。 用硒預處理鎘染毒的腎細胞能減少活性氧的出現(xiàn)，干預線粒體膜電位的異常下降、細胞色素C的釋放以及caspase的激活，從而抑制鎘誘導的腎細胞凋亡。此外，根據(jù)對相關實驗數(shù)據(jù)的分析研究，在鋅、硒共同作用對鎘毒性拮抗作用比單獨給予鋅、硒效果更好。所以給機體增加攝入微量元素硒，可提高機體免疫力，排出體內(nèi)有毒、有害物質(zhì)，降低鎘毒性對機體組織的損傷，能修復受損腎細胞，起到對腎臟的保護作用，減輕鎘毒素對腎侵害。

3.1.3 亞硒酸鈉液能提高機體免疫力，維持機體活化免疫應答：鎘致慢性腎臟病患者免疫功能往往是受抑制的，易發(fā)生感染。亞硒酸鈉液中硒是一種免疫調(diào)節(jié)劑，對人或動物免疫功能的影響是多方面的和復雜的。當活化的免疫細胞代謝增加時，產(chǎn)生活性氧的機會便會增多，這種活性氧過度產(chǎn)生又會損害免疫活性細胞，降低免疫力，因此需要有一個強有力的系統(tǒng)使活性氧的量保持在一定范圍內(nèi)[10]。實驗中通過用亞硒酸鈉液灌胃補硒后，腎臟細胞及其他部分硒水平升高，其抗氧化性增強，通過谷胱甘肽過氧化物酶及其同功酶和硒的其它化合物清除自由基，減少脂質(zhì)過氧化物的產(chǎn)生，從而保護細胞膜免受過氧化物的損害，從而促進免疫應答。

3.2 丹參水提液對鎘致腎損傷的作用機制

3.2.1 丹參水提液清除自由基：在慢性鎘中毒的情況下，鎘可通過對線粒體的損傷、抗氧化活性降低或喪失、激發(fā)產(chǎn)生超氧化自由基、引起炎癥反應等途徑引起腎臟的氧化損傷。本實驗的結果表明，受丹參水提液干預治療后，丹參水提液低、高劑量組增強了大鼠SOD活性、降低了MDA含量，且在降低MDA含量方面表現(xiàn)更加明顯。這是丹參水提液防病治病作用機制的重要特征，其作用機制可能是通過阻斷自由基產(chǎn)生的連鎖反應，修復腎臟組織細胞，以保持內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定。證實丹參水提液具有較強的清除氧自由基的能力，有效減緩、遏制鎘致腎臟的氧化損傷，對鎘致腎臟組織損傷干預作用明顯[8]。

3.2.2 丹參水提液降低腎臟皮質(zhì)、血鎘含量：實驗腎臟皮質(zhì)鎘濃度測定的結果表明，丹參水提液有明顯的驅(qū)鎘效應。實驗中丹參水提液低、高劑量組鎘含量也較少，這說明丹參能夠改善腎臟微循環(huán)，加快血液流速，加快鎘在體內(nèi)代謝的過程[11]。

3.2.3 丹參水提液降低尿蛋白：尿蛋白超過正常量可使腎臟受損。實驗證明丹參水提液一定程度上能夠減輕鎘對腎小球和腎小管的損傷程度，能夠增強損傷細胞結構修復和功能恢復的能力[12-13]。

3.2.4 丹參水提液抗細胞凋亡：實驗[11-14]表明，丹參水提液對慢性鎘中毒引起腎臟損傷而導致的TEC凋亡有明顯的抑制作用，意味著丹參水提液能有效降低鎘對組織細胞的影響。

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Effects of water extract of radix salviae miltiorrhizae on renal injury in rats exposed to cadmium

ZHANG Qianqian1, HE Ling2, TENGYulian3, LYU Xiaoyun4

(1.SecondHospitalofLanzhouUniversity,Lanzhou,Gansu, 730030; 2.ZhuhaiSecondPeople′sHospital,Zhuhai,Guangdong, 519000; 3.LanzhouUniversityHospital,Lanzhou,Gansu, 730030; 4.InstituteofIntegratedTraditionalChineseandWesternMedicineofLanzhouUniversity,Lanzhou,Gansu, 730030)

Objective To explore effects of water extract of radix salviae miltiorrhizae on renal injury in rats exposed to cadmium and its possible mechanism. Methods Twenty male and female healthy Wistar rats, respectively, at age of 6 weeks were randomly divided into blank group (n=8), and model group (n=32) after adaptive feeding for 1 week, given intraperitoneal injection of saline for 5 mL/(kg·d) and intraperitoneal injection of cadmium chloride solution for 2.8 mg/(kg·d). Continuously building for 4 weeks, the general situation of rats was observed, and the rat kidney function and kidney tissue pathological changes were detected. After successful molding, the model group was randomly divided into medicine group, negative and positive and blank control groups. The medicine group was given Salvia miltiorrhiza water extract of high dose of 2.7g/(kg·d), Danshen aqueous extract of low dose 1.35 g/(kg·d) by gavage, positive control group was given sodium selenite for 0.05 mg/kg·d by gavage, the negative and blank control groups were given the same mount of saline for 2.7 mL/(kg·d). After 10 weeks of treatment, serum and urine was collected, and kidney tissue was to be detected. Results Salvia miltiorrhiza water extraction liquid of low and high dose group had less 24 h urine volume than negative control group, and serum superoxide dismutases (SOD) increased significantly, Malondialdehyde (MDA) decreased significantly, total antioxidant capacity (T-AOC) increased significantly, blood urea nitrogen, urinary beta β2-MG content and serum creatinine levels was decreased. Pathological section revealed that renal proximal convoluted tubules epithelial cells was turbid, swelling, degeneration and necrosis in the negative control group. Salvia miltiorrhiza water extraction liquid of low and high dose group had lower serum cortical cadmium content than the negative control group, Salvia miltiorrhiza water extraction liquid of low and high dose group had lower apoptosis rate than the negative control group. Conclusion The salvia miltiorrhiza water solution can accelerate the metabolism of cadmium, and effectively interfere with cadmium induced renal injury, delay chronic renal failure, and protect the kidney.

aqueous extract of Salvia miltiorrhiza; cadmium; renal injury; oxidative damage; cell apoptosis

2016-10-26

廣東省珠海市科技計劃項目(2015A0014)

滕玉蓮, E-mail: tengyl@lzu.edu.cn

R 692

A

1672-2353(2017)05-005-06

10.7619/jcmp.201705002