多菌種發(fā)酵生產(chǎn)微生物蛋白飼料的菌種篩選研究

李洋++李忠軍

摘要 對茶粕固態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)微生物蛋白飼料的菌種進(jìn)行篩選試驗(yàn)。結(jié)果表明：茶粕接入霉菌和酵母菌組成的混合菌種進(jìn)行發(fā)酵可獲得較多的菌體干重，其中尤以黑曲霉、米曲霉、綠色木霉和產(chǎn)朊假絲酵母組成的混合菌種發(fā)酵茶粕獲得的菌體干重最多，可達(dá)到20.55 g/L左右。因此，選用這4種菌種作為茶粕發(fā)酵生產(chǎn)微生物蛋白飼料的最優(yōu)混合菌種。

關(guān)鍵詞 茶粕；微生物蛋白飼料；固態(tài)發(fā)酵；霉菌；酵母菌

中圖分類號 S816.4 文獻(xiàn)標(biāo)識碼 A 文章編號 1007-5739（2017）05-0228-03

Abstract An research for producing microbial protein feed was conducted by solid state fermentation using oil-tea-cake.The dry weight of microbial cells by different mixed fermentations were studied. The results showed that the dry weight of microbial cells in oil-tea-cake by compound culture of microzyme and mildew was more than others.The best compound microbes was screened out，it included Aspergillus niger，Aspergillus oryzae，Trichoderma viride and Geotrichun candidum.When reaction time was 4 days，the dry weight of microbial cells in oil-tea-cake by the four microbes increased to 20.55 g/L.So the four microbes could be selected as the optimum compound microbes on producing microbial protein feed with oil-tea-cake.

Key words oil-tea-cake；microbial protein feed；solid fermentation；mildew；microzyme

我國是世界上油茶品種最多、分布最廣、籽產(chǎn)量最高的國家，油茶籽、茶粕（即油茶籽榨油后剩下的渣）年產(chǎn)量分別為100萬、73萬t左右[1]。在我國江西、湖南等南方丘陵地區(qū)，油茶是一種重要的油料植物。

目前，我國茶粕大部分被用作清塘劑、肥料、燃料，甚至廢棄，僅少量用于茶皂素的提取，造成了資源浪費(fèi)，同時也污染了環(huán)境。茶粕中含有豐富的蛋白質(zhì)、糖類、粗纖維、灰分和茶皂素，利用價(jià)值較高，目前利用茶粕開發(fā)飼料的研究受到普遍關(guān)注[2-3]。研究表明，茶粕纖維素含量較高，營養(yǎng)水平較低，以及茶粕中茶皂素等抗?fàn)I養(yǎng)因子含量過高是限制油茶餅粕飼用的主要因素[4-5]。為使茶粕變廢為寶，緩解目前我國蛋白飼料短缺的問題，本試驗(yàn)以去除茶皂素的油茶餅粕為原料，采用多菌種組成的混合菌種進(jìn)行發(fā)酵，擬篩選出降低茶粕粗纖維含量、提高茶粕飼料適口性、增加茶粕菌體蛋白含量的優(yōu)良菌種。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 菌種。白地霉、產(chǎn)朊假絲酵母、熱帶假絲酵母、黑曲霉、米曲霉、綠色木霉，均由廣東微生物研究所提供，依次用Y1、Y2、Y3、M1、M2、M3表示。其中，黑曲霉、米曲霉、綠色木霉能產(chǎn)生較豐富的纖維素酶、果膠酶、淀粉酶等酶類，可較好地降解纖維素等多糖并產(chǎn)生較多的還原糖；產(chǎn)朊假絲酵母、白地霉、熱帶假絲酵母則有利用還原糖能快速生長的特點(diǎn)，可較大提高茶粕的菌體蛋白含量。通過不同菌群之間的組合，應(yīng)當(dāng)可以實(shí)現(xiàn)優(yōu)勢匹配和“超產(chǎn)”的目標(biāo)[6-7]。

1.1.2 儀器與設(shè)備。超凈工作臺、恒溫培養(yǎng)箱、電子天平、高壓蒸汽滅菌鍋、移液器、電熱恒溫干燥箱、電動離心機(jī)、水浴鍋、電爐、試管、量筒、燒杯、三角瓶、容量瓶等。

1.1.3 培養(yǎng)基。①斜面培養(yǎng)基。PDA培養(yǎng)基：用于霉菌培養(yǎng)；麥芽汁瓊脂培養(yǎng)基：用于酵母菌培養(yǎng)。②液體種子培養(yǎng)基。霉菌：葡萄糖2%，可溶性淀粉3.0%，蛋白胨0.15%，KH2PO4 0.3%，（NH4）2SO4 0.5%，MgSO4 0.15%[8-9]，自來水1 000 mL。酵母菌：130 g麥芽汁加水1 000 mL配成12 oBx溶液，供酵母增殖用。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 茶粕固體發(fā)酵培養(yǎng)基。茶粕12.5 g，豬血粉2.5 g，（NH4）2SO4 2%，KH2PO4 0.1%，MgSO4 0.05%。

1.2.2 發(fā)酵條件。250 mL三角瓶，裝茶粕固體發(fā)酵培養(yǎng)基15 g，加自來水20 mL，殺菌后接種經(jīng)活化及擴(kuò)大培養(yǎng)的6 種菌種的菌懸液（總接種量為15%，各菌種的接種比均為1∶1），在室溫下培養(yǎng)4 d。

1.2.3 分析測定方法。培養(yǎng)結(jié)束后向三角瓶內(nèi)加入蒸餾水200 mL，30 ℃恒溫水浴浸提3 h，過濾，所得濾液用于測定菌體干重[6-8]。將濾液全部移入離心管中，3 000 r/min離心分離10 min，再分離出上清液，保留管底沉淀物，用蒸餾水洗滌此沉淀物3次[8-9]，收集到的即是微生物細(xì)胞。將微生物細(xì)胞置于65 ℃烘箱中烘干至恒重，稱重即為菌體干重。

2 結(jié)果與分析

2.1 單菌種發(fā)酵

用250 mL三角瓶裝茶粕固體發(fā)酵培養(yǎng)基15 g，加水20 mL，滅菌后接種單一菌種的菌懸液（接種量均為15%），在室溫下培養(yǎng)4 d。發(fā)酵結(jié)束后以收集到的菌體干重作為測試指標(biāo)，試驗(yàn)結(jié)果見圖1。可以看出，采用單一菌種發(fā)酵茶粕培養(yǎng)基，收集到的菌體干重很少，最多僅為9.35 g/L，這說明采用單一菌種發(fā)酵茶粕時，茶粕和豬血粉中的營養(yǎng)成分很難被利用，因而自身的生長繁殖受到影響[8-10]。為了大量培養(yǎng)菌種細(xì)胞，茶粕發(fā)酵時應(yīng)當(dāng)采用混合菌種進(jìn)行發(fā)酵，有效利用微生物的協(xié)同作用，促使各菌種在茶粕基質(zhì)中都能較好地生長繁殖[11-12]。

2.2 雙菌種發(fā)酵

用250 mL三角瓶裝茶粕固體發(fā)酵培養(yǎng)基15 g，加水20 mL，滅菌后接種雙菌種的菌懸液（總接種量為15%，2種菌種的接種比為1∶1），在室溫下培養(yǎng)4 d[13-14]。發(fā)酵結(jié)束后以收集到的菌體干重作為測試指標(biāo)，試驗(yàn)結(jié)果見圖2。可以看出，采用雙菌種發(fā)酵茶粕培養(yǎng)基，發(fā)酵后收集到的菌體干重在9.43～13.74 g/L之間，大于單菌種發(fā)酵獲得的菌體干重[9]，這是因?yàn)槊咕徒湍妇g存在一種協(xié)同作用，霉菌能分泌淀粉酶、纖維素酶及蛋白酶等酶類，降解淀粉、粗纖維及粗蛋白等物質(zhì)，生成可被酵母菌直接利用的葡萄糖、氨基酸等小分子物質(zhì)，酵母菌則在這些小分子營養(yǎng)物質(zhì)的作用下不斷生長繁殖，使發(fā)酵后茶粕含有較多的菌體細(xì)胞。

2.3 三菌種發(fā)酵

用250 mL三角瓶裝茶粕固體發(fā)酵培養(yǎng)基15 g，加水20 mL，滅菌后接種三菌種的菌懸液（總接種量為15%，3種菌種的接種比為1∶1∶1），在室溫下培養(yǎng)4 d。發(fā)酵結(jié)束后以收集到的菌體干重作為測試指標(biāo)，試驗(yàn)結(jié)果見圖3。可以看出，采用三菌種發(fā)酵茶粕培養(yǎng)基，發(fā)酵后收集到的菌體干重為10.66～18.91 g/L，差別較大，其中混合菌種M3+Y1+Y2發(fā)酵茶粕后收集到的菌體干重可達(dá)18.91 g/L，菌體干重居首位，粗纖維含量也降低至10.54%，是三菌種發(fā)酵中最優(yōu)的菌種組合。

2.4 四菌種發(fā)酵

用250 mL三角瓶裝茶粕固體發(fā)酵培養(yǎng)基15 g，加水20 mL，滅菌后接種四菌種的菌懸液（總接種量為15%，4種菌種的接種比為1∶1∶1∶1），在室溫下培養(yǎng)4 d。發(fā)酵結(jié)束后以收集到的菌體干重作為測試指標(biāo)，試驗(yàn)結(jié)果見圖4?？梢钥闯?，4種菌種組成的混合菌種能更好地利用培養(yǎng)基中的營養(yǎng)成分來維持各菌種細(xì)胞的生長繁殖，四菌種發(fā)酵可獲得的菌體干重總體上多于雙菌種發(fā)酵及三菌種發(fā)酵。

2.5 五菌種發(fā)酵

用250 mL三角瓶裝茶粕固體發(fā)酵培養(yǎng)基15 g，加水20 mL，滅菌后接種五菌種的菌懸液（總接種量為15%，5種菌種的接種比為1∶1∶1∶1∶1），在室溫下培養(yǎng)4 d。發(fā)酵結(jié)束后以收集到的菌體干重作為測試指標(biāo)，試驗(yàn)結(jié)果見圖5?？梢钥闯?，采用五菌種發(fā)酵茶粕培養(yǎng)基，發(fā)酵后收集到的菌體干重要比四菌種發(fā)酵低，這說明多菌種發(fā)酵時，并非菌種越多越好。因?yàn)榫N數(shù)增多，會消弱各菌種的優(yōu)勢，且容易感染雜菌[8-9]，使培養(yǎng)的目的菌種不能較好地生長繁殖，故導(dǎo)致菌體干重減少。

2.6 六菌種發(fā)酵

用250 mL三角瓶裝茶粕固體發(fā)酵培養(yǎng)基15 g，加水20 mL，殺菌后接種六菌種的菌懸液（總接種量為15%，6種菌種的接種比為1∶1∶1∶1∶1∶1），在室溫下培養(yǎng)4 d。發(fā)酵結(jié)束后以收集到的菌體干重作為測試指標(biāo)，復(fù)合菌種M1+M2+M3+Y1+Y2+Y3發(fā)酵茶粕收獲菌體干重為14.66 g/L?？芍?種菌種組成的混合菌種不適宜用來發(fā)酵茶粕，這是因?yàn)椴捎昧N發(fā)酵茶粕培養(yǎng)基，發(fā)酵后收集到的菌體干重較少，而粗纖維含量也較高[9-10]。

3 結(jié)論與討論

本試驗(yàn)在所選用的菌種范圍內(nèi)進(jìn)行了廣泛的篩選，試驗(yàn)結(jié)果表明，茶粕培養(yǎng)基在接入不同混合菌種進(jìn)行發(fā)酵后，都能獲得一定的菌體干重（或菌體蛋白）。但是菌體干重的含量差別較大，在6.57～20.55 g/L范圍內(nèi)變化，其中3種霉菌和1種酵母菌組成的混合菌種獲得菌體干重最多[8-10，13-14]，尤以混合菌種M1+M2+M3+Y2獲得的菌體干重較多，可達(dá)20.55 g/L左右，故該混合菌種是發(fā)酵茶粕和血粉生產(chǎn)微生物蛋白飼料的最佳菌種組合。

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