小花棘豆中毒對家兔睪丸生精細胞凋亡的影響

［KH－*3D］王帥，賈琦珍，陳根元，王連群，張玲*

(1．塔里木大學動物科學學院，新疆阿拉爾843300;2．新疆生產建設兵團塔里木畜牧科技重點實驗室，新疆阿拉爾843300)

小花棘豆中毒對家兔睪丸生精細胞凋亡的影響

［KH－*3D］王帥1，2，賈琦珍2，陳根元2，王連群1，2，張玲1，2*

(1．塔里木大學動物科學學院，新疆阿拉爾843300;2．新疆生產建設兵團塔里木畜牧科技重點實驗室，新疆阿拉爾843300)

研究小花棘豆中毒對家兔睪丸生精細胞凋亡的影響，進一步探討小花棘豆的中毒機理。將24只雄性家兔隨機分為對照組和試驗Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ組，試驗組分別按照Ⅰ組15%(苦馬豆素含量30 mg/kg)、Ⅱ組30%(苦馬豆素含量60 mg/kg)、Ⅲ組45%(苦馬豆素含量90 mg/kg)的比例添加小花棘豆，對照組僅飼喂苜蓿干草，試驗期70 d。分別于攻毒后第14、35、70天每次每組隨機采集2只家兔的睪丸，通過TUNEL法定位，Hoechst 33258熒光染色細胞核，流式細胞儀測定細胞凋亡率和細胞周期。從第35天開始，試驗組家兔生精細胞凋亡率均極顯著升高(P﹤0．01)，表現(xiàn)為細胞膜下陷，細胞器濃縮，細胞核碎裂等，并出現(xiàn)凋亡小體。試驗組家兔睪丸單倍體細胞和二倍體細胞凋亡率均極顯著升高(P﹤0．01)，但四倍體細胞數量無顯著變化。與對照組相比，中毒家兔睪丸生精細胞G0/G1期數量升高，S期細胞數量降低，而且G1期與S期細胞數量呈顯著的負相關。小花棘豆中毒可導致家兔睪丸組織生精細胞凋亡，且與小花棘豆毒性成分呈現(xiàn)一定的時間－劑量效應。

小花棘豆;苦馬豆素;生精細胞;細胞凋亡;細胞周期

小花棘豆(Oxytropis glabra DC)為豆科棘豆屬植物，是南疆阿克蘇、克州、和田等地區(qū)分布最廣泛，危害最嚴重的有毒植物。據不完全統(tǒng)計，南疆地區(qū)已有近15%的天然草場中廣泛叢生小花棘豆，其蓋度均在50%左右，嚴重的蓋度可達95%以上;放牧家畜每年采食小花棘豆中毒的數量約為50 000～100 000只(頭)，其中50%以上的中毒家畜死亡［1］。中毒家畜主要表現(xiàn)為繁殖系統(tǒng)和神經系統(tǒng)損傷，其中睪丸、卵巢、腦組織等器官均出現(xiàn)細胞空泡變性、細胞核萎縮等病理變化［2］。王帥等［3－4］研究發(fā)現(xiàn)，小花棘豆的主要毒性成分是苦馬豆素(Swainsonine，SW)，可導致中毒動物睪丸萎縮、精子數量與活性降低，最終導致雄性動物生精功能障礙。龐龍［5］通過建立大鼠大腦皮質神經元體外培養(yǎng)模型，檢測了SW對大鼠大腦皮質神經細胞的毒性作用。其研究發(fā)現(xiàn)SW對神經細胞存在明顯的劑量－效應毒性作用，并導致神經細胞的凋亡率顯著增加。張樑［6］進一步研究發(fā)現(xiàn)SW可導致神經細胞胞核濃縮，DNA片段化，最終導致細胞凋亡。其作用機理為SW可影響caspase-8和caspase-3的級聯(lián)反應，而不是經線粒體通路介導神經細胞凋亡。目前有關SW對細胞凋亡的影響的試驗主要集中于其對癌細胞和神經細胞的作用上，對生精細胞的凋亡及基因表達未見報道。生精細胞正常情況下可通過細胞凋亡的方式清除異常細胞，但外源毒素誘導的生精細胞大量凋亡會導致睪丸細胞退化，其繼發(fā)性損害可嚴重影響動物的生殖能力。本課題組前期研究［2］發(fā)現(xiàn)小花棘豆中毒家兔睪丸指數極顯著升高，HE染色后鏡檢發(fā)現(xiàn)中毒家兔睪丸間質細胞、生精上皮細胞等出現(xiàn)空泡變性，但其中毒的分子作用機制尚不明確。本試驗通過制備亞慢性小花棘豆中毒家兔模型，探討小花棘豆中毒誘導家兔生精細胞凋亡的機制。

1 材料與方法

1．1 材料

原位凋亡檢測試劑盒，德國Boechringer Mannheim公司;Hoechst 33258染液，Beyotime(中國)公司;Annexin V-FITC Apoptsis Detection KIT，美國BD公司，DNA-PERP STAIN細胞周期試劑盒，美國Beckman Coulter公司。其余試劑均為國產分析純。

CKX41型倒置相差顯微鏡，IX71型倒置熒光顯微鏡，日本Olympus株式會社;FAC Scam型流式細胞儀，美國BD公司;5810 R型高速冷凍離心機，德國Eppendorff公司;DSC型切片機，HI1220型溫控烤片臺，德國Leica公司。

1．2 實驗動物分組與處理

雄性家兔24只，體質量(2．0±0．1)kg，平均分為對照組和3個試驗組，分籠飼養(yǎng)。對照組僅飼喂青苜蓿干草，3個試驗組分別飼喂摻入小花棘豆15 %、30%和45%(按氣相色譜法計算苦馬豆素含量分別為30、60和90 mg/kg［7］)的混合干草，試驗期70 d。試驗第14、第35和第70天各組分別剖殺2只家兔取睪丸，將家兔睪丸組織在4℃下沿橫斷面劈開，部分置于Bouin’s液中后固定24 h后常規(guī)方法脫水、透明，石蠟包埋后制作切片，片厚4 μm。切片貼于涂有3-氨丙基三乙氧基硅烷的載玻片上，37℃過夜后用于TUNEL染色;部分睪丸組織剪成1～2 mm大小，置于5 mL PBS液(pH 7．4)中，渦旋振蕩3 min后使用200目尼龍濾網過濾，1500 r/min離心5 min后棄去上清，再置于5 mL PBS液中混勻。相同條件下重復3次即得到單細胞懸液，用于Hoechst 33258染色和細胞周期比例的檢測。

1．3 TUNEL法檢測小花棘豆中毒家兔生精細胞凋亡

將組織切片依次使用二甲苯、無水乙醇、95%乙醇和75%乙醇洗滌;然后使用3%H2O2處理10 min，去離子水洗滌;然后利用Proteinase K 37℃消化10 min，0．01 mol/L TBS洗滌;每個切片加標記緩沖液18 μl，TDT 1 μl，DIG-d-UTP1 μl，混勻后甩去切片上液體，加標記液20 μl，37℃反應2 h;0．01 mol/L TBS洗滌后加封閉液50 μl，室溫反應30 min;棄去封閉液，用抗體稀釋液將生物素化抗地高辛抗體稀釋至1∶100，每片加50 μl，37℃反應30 min;0．01 mol/L TBS洗滌后加1∶100 SABC 50 μl，37℃反應30 min;然后DAB顯色，自來水沖洗，蘇木精復染，中性樹膠封片。以細胞核中有棕黃色顆粒者為凋亡的細胞。

1．4 Hoechst 33258染色檢測小花棘豆中毒家兔生精細胞細胞核的形態(tài)學變化

總之，本文首先分析了初中英語閱讀教學中存在的問題，然后從注重提高英語閱讀材料的新穎性，組織學生靈活學習英語閱讀以及科學合理地安排英語閱讀時間幾個方面，提出了初中英語閱讀教學的提升策略，希望本文的研究能夠有助于初中英語閱讀教學水平的提升。當然，由于本人的研究水平有限，本文的論述難免存在一定的不足，還希望相關領域專家學者給與本人批評與指正。

去除單細胞懸液中的PBS，加入4%甲醛1 mL固定15 min，然后棄去固定液，PBS洗滌3次，每次3 min，加入0．5 mL Hoechst 33258染色液，染色2 min，棄去染色液，加入1 mL PBS后于熒光顯微鏡下觀察。激發(fā)波長350 nm，參比波長460 nm。

1．5 小花棘豆中毒對家兔生精細胞細胞周期的影響

使用PBS沖洗單細胞懸液1～2次，加入質量濃度為0．125%的胰蛋白酶消化2 min，含血清培養(yǎng)液終止消化后棄去上清，PBS漂洗3次后收集細胞于離心管中。4℃、2000 r/min離心10 min后棄去上清，加入1 mL 75%乙醇4℃固定過夜。然后4℃、2000 r/min條件下離心10 min后棄去上清，PBS漂洗3次后再于4℃、2000 r/min條件下離心10 min，將細胞重懸于200 μl PBS液中，加入5 μl RnaseA，37℃反應1 h，再加入10 μl Triton-X-100和5 μl PI，4℃下避光孵育30 min，1 h內使用流式細胞儀檢測。

1．6 小花棘豆中毒家兔生精細胞凋亡率的測定

使用PBS沖洗單細胞懸液1～2次，加入質量濃度為0．125%的胰蛋白酶消化2 min，含血清培養(yǎng)液終止消化后棄去上清，PBS漂洗3次后收集細胞于離心管中。4℃、2000 r/min離心10 min后棄去上清，加入1 mL PBS重懸細胞，使用250目尼龍濾網過濾，然后4℃、2000 r/min條件下離心10 min后棄去上清，將細胞重懸于200 μl Binding Buffer中，加入10 μl AnnexinV-FITC和5 μl PI，4℃下避光孵育30 min，1 h內上機檢測。

1．7 數據分析

試驗數據使用SPSS 16．0軟件中One-Way ANOVA方法進行單因素方差分析。

2 結果與分析

2．1 小花棘豆中毒家兔睪丸生精細胞凋亡的檢測

由圖1可見，對照家兔睪丸生精細胞排列整齊，清晰明顯，各時期生殖細胞如精原細胞、初級精母細胞、次級精母細胞和精子均清晰可辨;TUNEL染色顯示僅有極少數的生精細胞的凋亡(圖1-A)。試驗Ⅰ組家兔睪丸組織出現(xiàn)曲精細管排列不規(guī)則，生精細胞輕度異型，部分細胞核濃染，精子減少;凋亡細胞多表現(xiàn)為細胞膜完整，胞質空泡(圖1-B)，其數量明顯升高。試驗Ⅱ組和試驗Ⅲ組家兔睪丸組織均出現(xiàn)曲精細管排列極度紊亂，各級生精細胞明顯減少，異型細胞和凋亡細胞數量增多，凋亡細胞出現(xiàn)細胞膜下陷，細胞器濃縮，細胞核碎裂等，并形成凋亡小體，部分凋亡小體被鄰近細胞吞噬(圖1-C、D)。

2．2 小花棘豆中毒家兔睪丸生精細胞細胞核的形態(tài)學檢測

Hoechst 33258染色發(fā)現(xiàn)，對照家兔睪丸生精細胞細胞核呈現(xiàn)圓形及卵圓形，且染色質均勻分布(圖2-A)。小花棘豆中毒家兔生精細胞細胞核縮小，呈新月形或染色質濃縮。試驗Ⅰ組家兔出現(xiàn)核固縮為均質團塊(圖2-B)，試驗Ⅱ組和試驗Ⅲ組家兔生精細胞胞體也明顯縮小，細胞核多碎裂，并伴有凋亡小體出現(xiàn)(圖2-C，2-D)。

圖1 對照家兔(A)與小花棘豆中毒家兔(B、C、D)生精細胞凋亡TUNEL染色Fig．1Spermatogenic cells apoptosis in control rabbit testis(A)and poisoning rabbit testis(B，C，D)by TUNEL

圖2 對照家兔(A)與小花棘豆中毒家兔(B、C、D)生精細胞細胞核的形態(tài)學變化Fig．2The change of spermatogenic cells nucleus in control rabbit testis(A)and poisoning rabbit testis(B，C，D)

2．3 小花棘豆中毒對家兔睪丸生精細胞細胞周期的影響

由圖3可知，小花棘豆中毒家兔睪丸生精細胞與對照家兔相比，G0/G1期細胞數量逐漸升高，S期細胞數量逐漸降低，而且G1期與S期細胞數量呈顯著的負相關。其中高劑量小花棘豆中毒組家兔的變化最為明顯。

圖3 對照家兔(A)與小花棘豆中毒家兔(B、C、D)生精細胞細胞周期的檢測Fig．3The cell cycle of spermatogenic cells nucleus in control rabbit testis(A)and poisoning rabbit testis(B，C，D)by FCM

2．4 小花棘豆中毒對家兔睪丸生精細胞凋亡率的影

家兔睪丸生精細胞主要分為單倍體細胞、二倍體細胞和四倍體細胞。與對照組相比，第14天時試驗組家兔單倍體細胞凋亡率均顯著高于對照家兔(P﹤0．05)，但僅試驗Ⅲ組家兔生精細胞凋亡率顯著高于對照家兔(P﹤0．05)。第35 d時試驗組單倍體細胞凋亡率和生精細胞凋亡率均極顯著高于對照家兔(P﹤0．01)，但二倍體細胞凋亡率均顯著高于對照家兔(P﹤0．05)。第70 d時試驗組單倍體細胞凋亡率、二倍體細胞凋亡率和生精細胞凋亡率均極顯著高于對照家兔(P﹤0．01)，但整個試驗期內四倍體細胞凋亡率與對照差異不顯著(P﹥0．05)。

表1 小花棘豆中毒對家兔睪丸生精細胞凋亡率的影響(%)Table 1The effect of apoptosis index of O．glabra DC poisoning on spermatogenic cells

圖4 對照家兔(A)與小花棘豆中毒家兔(B、C、D)生精細胞凋亡率的檢測Fig．4The apoptosis index of spermatogenic cells in control rabbit testis(A)and poisoning rabbit testis(B，C，D)by FCM

3 討論

細胞凋亡在細胞發(fā)育及疾病發(fā)生過程中均起著重要的作用。凋亡過程中，細胞不僅發(fā)生了生化變化，而且還具有凋亡的特征性形態(tài)和亞微結構。有核細胞凋亡的重要特征是DNA斷裂，TUNEL法能特異性的標記斷裂DNA，可有效檢測細胞早期凋亡，是目前應用較廣、可靠較高的標記凋亡細胞的方法。正常情況下，睪丸的精原細胞在促性腺激素和雄性激素作用下，依次經過精原細胞、初級精母細胞和次級精母細胞，最后轉變成為高度分化的精子。張先平等［8］研究發(fā)現(xiàn)減數分裂前的精原細胞和精母細胞有較高的自發(fā)凋亡現(xiàn)象，但精子細胞很少發(fā)生凋亡，這是保證隨后的精子正常生長所必需的。其意義在于維持成熟精子的質量和數量，清除染色體異常的生精細胞，保持生精細胞與支持細胞數量上的平衡。課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，小花棘豆中毒主要影響動物的繁殖和神經系統(tǒng)，其中雄性中毒動物表現(xiàn)為性欲低下，無配種能力;雌性動物可造成流產、死胎、弱胎、畸形等。丁伯良等［9］研究發(fā)現(xiàn)甘肅棘豆(主要毒性物質SW)中毒山羊睪丸的精原細胞和初級精母細胞空泡化，次級精母細胞和精子細胞數量減少，附睪、精囊、輸精管數量明顯降低。本試驗研究發(fā)現(xiàn)小花棘豆中毒家兔睪丸組織曲精細管排列紊亂，各級生精細胞和精子細胞數量明顯減少，凋亡細胞數量增多，并可見凋亡小體形成及凋亡小體被吞噬細胞吞噬的現(xiàn)象。TUNEL染色發(fā)現(xiàn)小花棘豆中毒可顯導致家兔生精細胞凋亡率極顯著升高(P＜0．01)，Hoechst 33258染色發(fā)現(xiàn)凋亡細胞細胞核的染色質濃縮，核碎裂，并出現(xiàn)凋亡小體。其結果與丁伯良等的研究一致，表明小花棘豆毒性成分可誘導睪丸生精細胞凋亡。

睪丸細胞主要包括單倍體細胞(精子細胞和精子)、二倍體細胞(G0期精原細胞、次級精母細胞、支持細胞和間質細胞)以及四倍體細胞(粗線期、細線期、雙線期的初級精母細胞和G2期的精原細胞等)，另外還有一些較為分散的細胞由進行DNA合成的精原細胞和細線前期精母細胞組成。其中四倍體細胞與二倍體細胞的比率反映了精原細胞轉化為初級精母細胞的效率，單倍體細胞與四倍體細胞的比率顯示了減數分裂的效果，單倍體細胞與二倍體細胞的比率反映了精原細胞轉化為精子細胞的效率。Jyothi等［10］研究表明睪丸生精細胞凋亡時精原細胞的凋亡比較嚴重，即多數生殖毒性物質的靶細胞是精原細胞。本試驗通過流式細胞儀檢測了家兔睪丸內各種生精細胞的比例，結果發(fā)現(xiàn)與對照組相比，小花棘豆中毒家兔睪丸單倍體細胞和二倍體細胞凋亡率均極顯著升高，但四倍體細胞凋亡率無明顯變化;說明小花棘豆中毒可顯著影響家兔減數分裂及精原細胞轉化為初級精母細胞的效率，即小花棘豆毒性成分主要影響精原細胞和次級精母細胞。

通過流式細胞儀檢測小花棘豆中毒對家兔睪丸生精細胞細胞周期的影響，發(fā)現(xiàn)與對照組相比，中毒家兔睪丸生精細胞G0/G1期數量增多，S期細胞數量降低。表明小花棘豆毒性成分可能抑制了S期DNA的合成與修復過程，從而使S期細胞數量降低，并抑制了S期細胞進入G2/M期，另外還對細胞進入G1期有一定的促進作用。凋亡率檢測發(fā)現(xiàn)處于分裂增殖階段的精原細胞、精母細胞對小花棘豆的毒性作用較為敏感。其原因可能為精原細胞和精母細胞分別處于有絲分裂和減數分裂期，在S期需打開DNA雙鏈以合成新的DNA，而裸露的DNA對小花棘豆毒性成分的作用較為敏感，容易產生DNA損傷［11］。當DNA損傷超過自身的修復能力時，將導致同源染色體配對、交換和分離的紊亂，從而引發(fā)細胞凋亡。但龐龍［4］研究發(fā)現(xiàn)SW主要抑制大鼠皮質神經細胞的G0/G1期數量，與本研究結果不太一致。表明小花棘豆中毒導致家兔睪丸生精細胞凋亡的機制還有待于進一步的研究。

4 結論

通過TUNEL染色、Hoechst 33258染色和流式細胞術檢測，小花棘豆中毒可導致家兔睪丸生精細胞、單倍體細胞和二倍體細胞凋亡率極顯著升高，且與小花棘豆毒性成分呈現(xiàn)一定的時間－劑量效應。凋亡細胞出現(xiàn)胞核縮小、碎裂，染色質濃縮等，高劑量中毒組出現(xiàn)凋亡小體。與對照組相比，中毒家兔睪丸生精細胞G0/G1期數量增多，S期細胞數量降低，表明小花棘豆中毒可能抑制了S期DNA的合成與修復過程。

［1］王帥，賈琦珍，陳根元，等．不同生長時期小花棘豆營養(yǎng)成分與苦馬豆素含量比較［J］．新疆農業(yè)科學，2015，52(8):1505－1509．

［2］賈琦珍，陳根元，廖秋萍，等．小花棘豆中毒對家兔臟器指標的影響［J］．湖北農業(yè)科學，2014，53(12):2584－2586．

［3］王帥，吳書奇，胡建軍，等．南疆地區(qū)小花棘豆中苦馬豆素的分離與鑒定［J］．草業(yè)科學，2011，28(6):1194－1197．

［4］王帥，陳根元，賈琦珍，等．小花棘豆中毒對家兔睪丸α-甘露糖苷酶的影響［J］．中國獸醫(yī)學報，2015，35(4):640－644．

［5］龐龍．苦馬豆素體外誘導SD大鼠神經細胞凋亡研究［D］．陜西楊凌:西北農林科技大學，2012．

［6］張樑．苦馬豆素誘導新生SD大鼠大腦皮質神經細胞凋亡機制研究［D］．陜西楊凌:西北農林科技大學，2013．

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［8］張先平，才秀蓮，王乾興，等．錳對大鼠生精細胞凋亡與增殖的影響［J］．毒理學雜志，2007，21(3):176－179．

［9］丁伯良，王建辰，薛登民，等．山羊甘肅棘豆中毒睪丸、附睪的病理學研究［J］．畜牧獸醫(yī)學報，1994，25(4):368－374．

［10］Jyothi P，Jagetia G，Krishnamurthy H，et al．Evaluation of teniposide (VM-26)-induced toxicity on mouse spermatogenesis by flow cytometry［J］．Toxicology，2001，163(2－3):163－174．

［11］Zhaocai Li，Yong Huang，F(xiàn)eng Dong，et al．Swainsonine promotes apoptosis in human oesophageal squamous cell carcinoma cells in vitro and in vivo through activation of mitochondrial pathway［J］．Journal of Biosciences，2012，37(1):1005－1016．

(責任編輯 李潔)

Effect of Oxytropis glabra DC Poisoning on Spermatogenic Cells Apoptosis in Rabbit

WANG Shuai1，2，JIA Qi-zhen2，CHEN Gen-yuan2，WANG Lian-qun1，2，ZHANG Ling1，2*
(1．College of Animal Science，Tarim University，Xinjiang Alar 843300，China;2．Key Laboratory of Tarim Animal Husbandry Science and Technology，Xinjiang Production＆Construction Corps，Xinjiang Alar 843300，China)

The aim of this study was to investigate the effects of Oxytropis glabra DC poisoning on spermatogenic cells apoptosis in rabbit testis，and reveal the toxicity mechanism of O．glabra DC in future．24 male rabbits were randomly and equally divided into blank control group and experimental groupⅠ，Ⅱ，Ⅲ，the dried plant of O．glabra DC was comminnuted，then different amounts of the grass powder(15%，30 %and 45%the corresponding swainsonine content was 30，60，90 mg/kg)were mixed with the forage in 3 experimental groups．The rabbits consumed the forages freely until typical symptoms were observed，the test period was 70 days．2 rabbits were selected randomly from each group on the 14th，35thand 70thday，respectively，the testis were collected and apoptosis of cardiomyocyte were measured by insitu end-labeled DNA(TUNEL)，nuclear staining techniques by Hoechst 33258，flow cytometry determination of apoptosis rate and cell cycle．The results indicated that the apoptosis index of spermatogenic cell increased in experimental groups were very significantly higher than control group(P﹤0．01)，with increasing concentration of swainsonine，the spermatogenic cell membrane caveolated，cell organelles narrow and cell nucleus broken，and in severe apoptotic bodies．The apoptosis index of haploid cells and diploid cells in test rabbit testis were very significantly higher than control group(P﹤0．01)from 35 d，but the contents of four times the somatic cells in test rabbit testis had no significant difference with control group．The G0/G1of the cell increased and S phase cells gradually decreased，there were significantly negative correlation with G1phase cells and S phase cells．The results showed that O．glabra DC has remarkable effects on spermatogenic cells apoptosis in rabbit testis，in a time-effect as a dose-effect relationship．

Oxytropis glabra DC;Swainsonine;Spermatogenic cell;Apoptosis;Cell cycle

S816．1

A

1001－4829(2017)1－0209－06

10．16213/j．cnki．scjas．2017．1．036

2016－02－25

國家自然科學基金(31460678);國家星火計劃項目(2015GA891015);兵團塔里木畜牧科技重點實驗室開放課題(HS201409)

王帥(1984－)，男，高級實驗師，碩士，山西長治人，主要從事動物中毒病及毒理學方面的研究，E-mail:wangshuaidky@126．com;*為通訊作者:張玲(1966－)，女，高級實驗師，本科，河北河間人，主要從事牧草生產與牧草加工方面的研究，E-mail:1044763025@qq．com。