不同基因型腐爛莖線蟲侵染不同甘薯品種后生物學(xué)特性研究

［KH－*3D］王宏寶，李茹，付佑勝，趙桂東*，梁照文，張凱

(1．江蘇徐淮地區(qū)淮陰農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所，江蘇淮安223001;2．宜興出入境檢驗(yàn)檢疫局，江蘇宜興214206)

不同基因型腐爛莖線蟲侵染不同甘薯品種后生物學(xué)特性研究

［KH－*3D］王宏寶1，李茹1，付佑勝1，趙桂東1*，梁照文2，張凱1

(1．江蘇徐淮地區(qū)淮陰農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所，江蘇淮安223001;2．宜興出入境檢驗(yàn)檢疫局，江蘇宜興214206)

通過在不同抗性甘薯品種上接種不同基因型腐爛莖線蟲來研究線蟲群體繁殖量、性比的生物學(xué)特性。結(jié)果表明，基因型B群體DeYL隨著接種數(shù)量的增加，線蟲在不同甘薯品種下繁殖數(shù)量均顯著增加，其中在栗子香品種上的繁殖量增加最高，與其它2個甘薯品種相比，線蟲繁殖量在(P＜0．05)上差異顯著;隨著接種量的增加，在栗子香上線蟲性比從0．77增加到1．44，表現(xiàn)線蟲向雌蟲方向分化;在徐薯18上同樣表現(xiàn)為線蟲向雌蟲分化，相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)，在勝利百號、栗子香、徐薯18甘薯品種上，線蟲群體繁殖量與性比均呈正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)分別為0．987、0．477、0．984;同一接種量下3個線蟲群體的繁殖量與性比測定結(jié)果顯示:3個線蟲群體繁殖量、雌雄比在不同甘薯品種下差異顯著，證實(shí)了線蟲生長環(huán)境對于線蟲的生長發(fā)育，性比有一定的影響;3個線蟲群體均表現(xiàn)為感病品種栗子香上繁殖量高，雌雄比高，線蟲性別偏向雌蟲分化。

腐爛莖線蟲;營養(yǎng)環(huán)境;繁殖量;雌雄比

腐爛莖線蟲(Ditylenchus destructor Thome)是一種對植物危害嚴(yán)重的病原線蟲。該類線蟲最初發(fā)現(xiàn)于馬鈴薯上，可導(dǎo)致馬鈴薯腐爛，因此國外也稱之為Potato nematode［1］。該線蟲被亞太植物保護(hù)組織、許多國家和地區(qū)及我國列為重要的植物檢疫性有害生物［2－3］。腐爛莖線蟲在中國首先發(fā)現(xiàn)于甘薯上，主要侵染塊根并使其腐爛，引起甘薯莖線蟲病，隨后在中藥材(如當(dāng)歸、薄荷、人參)以及馬鈴薯上都分離到該類線蟲［4－5］腐爛莖線蟲自1937年傳入我國北方地區(qū)以來，通過甘薯種薯運(yùn)輸、種苗調(diào)運(yùn)、農(nóng)事操作以及花卉植物的種苗、苗木運(yùn)輸?shù)韧緩?，已擴(kuò)散到河北、河南、北京、山東、江蘇、安徽、吉林、內(nèi)蒙古等12個省(區(qū))［6－9］，并成為北方甘薯產(chǎn)區(qū)最嚴(yán)重的病害;受害田塊一般可減產(chǎn)20%～40%，嚴(yán)重的可減產(chǎn)80%以上，甚至絕收［10］。腐爛莖線蟲除危害甘薯外，還可危害蠶豆、花生、小麥、玉米、山藥、胡蘿卜蘿卜、大蒜等幾十種農(nóng)作物或經(jīng)濟(jì)作物。

線蟲種群的性別比例對于種群自身的發(fā)育繁殖、后代繁衍有重要作用，據(jù)報道稱，加拿大阿爾伯特大學(xué)科學(xué)家曾獲得了一項十分有趣的發(fā)現(xiàn):營養(yǎng)狀況以及種群密度可以改變動物線蟲的自然性別，根據(jù)他們的研究結(jié)果，動物的自然屬性以及基因構(gòu)造卻能通過營養(yǎng)狀況以及生存環(huán)境發(fā)生變化［11］。有報道研究表明，昆蟲病原索科線蟲性別是由營養(yǎng)環(huán)境決定的［12］，這種機(jī)制在動物界極其特殊。那么，對于腐爛莖線蟲在中抗、感病甘薯品種下其種群數(shù)量、性比否會發(fā)生變化國內(nèi)報道不多。

本試驗(yàn)旨在通過不同抗性甘薯品種接種不同線蟲種群，來研究不同線蟲種群繁殖量與雌雄比的變化關(guān)系及發(fā)育情況，試圖了解甘薯品種差異對于腐爛莖線蟲種群后代群體繁殖量及雌雄比的影響及其相關(guān)性變化，該研究對于揭示線蟲群體在不同生長環(huán)境下雌雄比與群體繁殖量的生物學(xué)特性具有重要的科研價值，也為通過外源物影響線蟲性別比例來控制影響線蟲生長發(fā)育、后代繁殖具有重要意義。

1 材料與方法

1．1 腐爛莖線蟲群體純化培養(yǎng)

腐爛莖線蟲由南京農(nóng)業(yè)大學(xué)提供，為兩類基因型A和B［13］線蟲群體，線蟲培養(yǎng)保存方法，先在解剖鏡下挑出生活力較強(qiáng)的線蟲100條，用3%H2O2消毒3 min，接種到經(jīng)乙醇(75%)消毒5 min的健康薯塊上，蠟封。25℃培養(yǎng)30 d后，轉(zhuǎn)移到4℃冰箱備用［14－15］。甘薯材料:勝利百號(中抗)，徐薯18 (感病)，栗子香(感病)。

1．2 薯片培養(yǎng)皿接種法

薯塊采用直徑13 mm打孔器獲得，厚度約1 cm，薯塊中心再用5 mm打孔器打出約5 mm深的洞將一定量線蟲用移液槍接入，接種薯塊放置于1%瓊脂糖凝膠培養(yǎng)皿中密封后置于25℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，接種量根據(jù)需要分別接種線蟲10，25，50條;培養(yǎng)40 d后淺盤法分離線蟲，每個處理重復(fù)3次。

1．3 線蟲繁殖量和雌雄比測定

通過淺盤法分離到的線蟲收集在10 mL試管中，先定下體積，然后充分混勻后，用移液槍吸取50 μl線蟲懸浮液滴在玻片上并置于低倍顯微鏡下計數(shù)后統(tǒng)計出線蟲的總數(shù)，性比(雌雄比)的測定:吸取100條左右的線蟲在顯微鏡高倍鏡下記錄線蟲的雌雄比［16］，每個處理重復(fù)3次。

1．4 發(fā)育進(jìn)度的測定

以性成熟個體的比例作為發(fā)育進(jìn)度的指標(biāo)［17］，分析線蟲在不同甘薯品種下生長發(fā)育情況。將上述方法3．2中分離的線蟲用移液槍吸取約100條在顯微鏡下觀察并統(tǒng)計性成熟個體的比例。每個處理設(shè)3次重復(fù)，性成熟百分比=性成熟個體數(shù)/總線蟲數(shù)×100%。

1．5 結(jié)果統(tǒng)計與數(shù)據(jù)處理

應(yīng)用Spss16．0軟件進(jìn)行差異顯著性與相關(guān)性分析，旨在發(fā)現(xiàn)腐爛莖線蟲群體在生物學(xué)特性上的相關(guān)關(guān)系。

表1 供試腐爛莖線蟲編號和來源Table 1Number and origin of tested Ditylenchus destructor

2 結(jié)果與分析

2．1 同一線蟲群體在不同品種上的繁殖量與雌雄比

表2 數(shù)據(jù)顯示，在不同甘薯品種中，同一接種量下線蟲群體的繁殖量與性比不盡相同，證實(shí)線蟲生長環(huán)境對于線蟲的生長發(fā)育，性比有一定的影響;表現(xiàn)為感病品種栗子香、徐薯18適合線蟲的生長繁殖，線蟲在這樣的環(huán)境下利于自身繁殖，表現(xiàn)為繁殖量高，雌雄比高，線蟲性別偏向雌蟲分化;而在中抗品種勝利百號甘薯品種上，雖然線蟲繁殖量遠(yuǎn)不如2個感病品種多，但隨著接種量增加，繁殖量增加，線蟲的性比分化也偏向雌蟲分化。

線蟲群體DeYL隨著接種數(shù)量的增加，線蟲在不同甘薯品種下繁殖數(shù)量均有增加，其中在栗子香品種上的繁殖量增加最高，與其它2個甘薯品種相比，線蟲繁殖量在P=0．05上差異顯著;隨著接種量的增加，在栗子香上線蟲性比從0．77增加到1．44，表現(xiàn)線蟲向雌蟲方向分化;在徐薯上隨著線蟲繁殖量的增加，線蟲的性比從0．44增加到2．4，同樣在該環(huán)境下線蟲向雌蟲分化。

表2 同一線蟲群體在不同品種上的繁殖量與雌雄比Table 2Reproductive capacity and sex ratio of DeYL nematode population in different varieties

2．2 同一線蟲群體在不同品種上的繁殖量與雌雄比相關(guān)性分析

表3 相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)，在勝利百號、栗子香、徐薯18甘薯品種上，線蟲群體繁殖量與性比均呈正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)分別為0．987、0．477、0．984。其中，在栗子香上線蟲群體繁殖量與性比相關(guān)性最低，僅為0．477，分析認(rèn)為在該品種上線蟲量隨著提高線蟲繁殖量提高遠(yuǎn)超過其它2個品種，筆者認(rèn)為在同樣甘薯重要的營養(yǎng)環(huán)境下，線蟲群體達(dá)到一定密度后反而會限制線蟲向雌蟲方向分化，這項發(fā)現(xiàn)似乎與Prahlad V等人對秀麗小桿線蟲性別與種群數(shù)量研究中提到的線蟲群體的性別分化與種群密度有聯(lián)系［11］相關(guān);另外，結(jié)論也顯示該線蟲群體在不同甘薯品種下繁殖量與性比相關(guān)性比較，在栗子香上相關(guān)性與其它2個品種的相關(guān)性差異顯著，這從側(cè)面也反映在不同甘薯品種下性比變化差異顯著，這一結(jié)論同樣與加拿大科學(xué)家Prahlad V等人的研究發(fā)現(xiàn)一致，即周圍的環(huán)境變化可以影響線蟲自身的雌雄性別比例［11］。

表3 不同接種數(shù)量下線蟲群體數(shù)量與雌雄比的相關(guān)性Table 3Correlation between the number of nematode population and the ratio of male and female under different inoculation quantities

2．3 同一線蟲群體在不同品種上發(fā)育進(jìn)度測定

同一接種量下DeYL線蟲群體在不同甘薯品種上繁殖的成蟲比例如圖1所示，DeYL線蟲群體在不同甘薯品種上成蟲比例表現(xiàn)不盡相同，DeYL線蟲群體在基礎(chǔ)接種量為10條的時候，在3個甘薯品種上成蟲比例比較接近，在P=0．05上差異不顯著;而在基礎(chǔ)接種量為25、50條的情況下，在3個甘薯品種上成蟲比例在P=0．05上差異顯著，當(dāng)接種量為50條的時候，在勝利百號上的成蟲比例顯著高于其它2個感病品種，分析認(rèn)為，在線蟲總量增多的情況下，幼蟲往往所占比例高，實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)在徐薯18和栗子香上二齡幼蟲占比遠(yuǎn)高于勝利百號，這樣來看在線蟲總量多的情況下，成蟲占比低也是可以理解的。

2．4 同一接種量下不同線蟲群體的繁殖量與性比測定

表4 數(shù)據(jù)顯示，在不同甘薯品種下，同一接種量下不同線蟲群體的繁殖量與性比也有差異，其中繁殖量在不同甘薯品種下差異顯著;同樣證實(shí)了線蟲生長環(huán)境對于線蟲的生長發(fā)育，性比有一定的影響; 3個線蟲群體均表現(xiàn)為感病品種栗子香上繁殖量高，雌雄比高，線蟲性別偏向雌蟲分化，線蟲在這樣的環(huán)境下利于自身繁殖;其中，基因型B群體DeYL、基因型A群體DeLY線蟲群體在感病品種栗子香、徐薯18上的繁殖量比中抗品種的高，這從側(cè)面說明抗性甘薯品種在抗線蟲方面表現(xiàn)出不利于線蟲增值侵染的優(yōu)越性;而基因型A群體DeLL在3個不同甘薯品種下均表現(xiàn)出性比向雌蟲方向分化，比如在中抗品種上的性比1．56均高于其它2個線蟲群體在該品種上的性比，當(dāng)然這種情況一方面可能是不同線蟲群體自身遺傳特異性表現(xiàn)出的差異，也或是由于線蟲群體密度達(dá)到一定量后性比向雌蟲方向分化，筆者對于后者可能性比較感興趣，因?yàn)閺臄?shù)據(jù)上可以看出，基因型A群體DeLL線蟲群體在中抗品種上性比1．56對應(yīng)的繁殖量為1616．67，而基因型B群體DeYL、基因型A群體DeLY線蟲群體在該品種上對應(yīng)的性比0．97、0．64和繁殖量1333．33、866．67;即不考慮線蟲自身遺傳差異性外，線蟲性比分化與繁殖量有一定關(guān)聯(lián)。

圖1 同一線蟲群體在不同品種上發(fā)育進(jìn)度測定Fig．1Adult percentage of DeYL nematode group in different varieties of sweet potato

表4 不同線蟲群體在不同品種上的繁殖量與雌雄比Table 4Correlation between the number of nematode population and the ratio of male and female in different inoculation quantities

2．5 同一接種量下不同線蟲群體的繁殖量與性比的相關(guān)性

如果不考慮不同甘薯品種的因素對線蟲的影響，單從線蟲群體數(shù)量上分析群體數(shù)量對線蟲性別的影響，隨著線蟲繁殖量的增加，從表5相關(guān)性分析中發(fā)現(xiàn)，在勝利百號、栗子香、徐薯18甘薯品種上，線蟲群體繁殖量與性比均呈正相關(guān)，其中DeLL群體、DeLY群體的相關(guān)系數(shù)分別為0．999、1．000，在P=0．05達(dá)顯著水平;其中，DeYL群體繁殖量與性比相關(guān)性也較高，為0．699。

表5 不同線蟲群體繁殖量與雌雄比相關(guān)性分析Table 5Correlation analysis of reproduction quantity and ratio of male and female on different nematode populations

2．6 不同線蟲群體在不同甘薯品種上的發(fā)育進(jìn)度

如圖2所示，不同線蟲群體在不同甘薯品種上成蟲比例表現(xiàn)存在差異，3個線蟲群體的成蟲比例在徐薯18和栗子香上占比高于勝利百號，而且在徐薯18上的發(fā)育進(jìn)度在25%～28%，在P=0．05水平上顯著高于勝利百號，說明3個線蟲群體在感病品種上發(fā)育進(jìn)度好，成蟲占比高。

圖2 不同線蟲群體在不同甘薯品種上成蟲百分比Fig．2Adult percentage of different nematode groups in different varieties of sweet potato

3 討論

在動物家族中，性別的決定方式有多種，但大體可分為兩類:基因決定和環(huán)境決定。在基因性別決定(GSD)機(jī)制中，性別差異由雌雄兩性的內(nèi)在基因不同造成;而在環(huán)境性別決定機(jī)制中，依賴環(huán)境信號的誘導(dǎo)決定動物雌雄。與基因性別決定模型相比，人們對環(huán)境性別決定的基因機(jī)制還了解得很少。

腐爛莖線蟲在不同品種上的繁殖量與雌雄比相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)，DeYL群體在勝利百號、栗子香、徐薯18甘薯品種上，線蟲群體繁殖量與性比均呈正相關(guān)，其中，在栗子香上線蟲群體繁殖量與性比相關(guān)性較低，僅為0．477，分析認(rèn)為在該品種上隨著線蟲量提高，線蟲繁殖量增加數(shù)量遠(yuǎn)超過其它2個品種，筆者認(rèn)為在線蟲侵染的初期，線蟲群體密度低，線蟲為了快速穩(wěn)固自身群體優(yōu)勢，線蟲繁殖量與雌雄比存在正相關(guān)，即隨著種群密度的增加，線蟲偏向于雌蟲方向分化，或者也可以認(rèn)為是線蟲盡可能向雌蟲分化，為的就是多繁育后代增加群體密度;然后，有趣的是，線蟲并不是隨著群體密度的增加雌雄比一直增加，當(dāng)線蟲量達(dá)到一定量后，性比分化會維持在一定范圍內(nèi)，如，DeYL群體在接種25、50條的情況下，繁殖量為16 000，21 600條，然而性比卻保持在1．4左右并沒有增加，筆者認(rèn)為在同樣甘薯營養(yǎng)環(huán)境下，線蟲群體達(dá)到一定密度后反而會限制線蟲向雌蟲方向分化，這一結(jié)果似乎說明線蟲群體性別分化不僅與營養(yǎng)環(huán)境有關(guān)，也與種群密度有關(guān)系;國內(nèi)有報道稱，昆蟲病原索科線蟲性別是由營養(yǎng)環(huán)境決定的［12］，這種機(jī)制在動物界極其特殊。已有的生物學(xué)研究結(jié)果表明，中華卵索線蟲性別分化是由線蟲的感染強(qiáng)度及其宿主體內(nèi)營養(yǎng)物質(zhì)的豐度所決定。感染強(qiáng)度越大，每條線蟲吸收的營養(yǎng)越少，越有可能發(fā)育為雄蟲，反之，則為雌蟲［18］;對于腐爛莖線蟲性別分化研究，與Andre P S報道［12］的昆蟲病原索科線蟲性別是由營養(yǎng)環(huán)境決定較為一致。同時這一結(jié)論與加拿大科學(xué)家Prahlad V等人的研究發(fā)現(xiàn)也較為一致，即周圍的環(huán)境變化可以影響線蟲自身的雌雄性別比例［11］，這在某種程度上解釋動物是如何適應(yīng)變化著的環(huán)境具有重要意義。這種在性別上的分化現(xiàn)象除了線蟲自身染色體核型控制外，不同抗性甘薯營養(yǎng)似乎對線蟲的性別分化起到了調(diào)控作用，至于不同營養(yǎng)條件下寄主的哪些營養(yǎng)成分或信號物質(zhì)參與了線蟲性別的分化有待于進(jìn)一步研究。

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(責(zé)任編輯 陳虹)

Study on Biological Characteristics of Different Genotypes Ditylenchus destructor Infected on Different Sweet Potato Varieties

WANG Hong-bao1，LI Ru1，F(xiàn)U You-sheng1，ZHAO Gui-dong1*，ZHAO Wen-liang2，ZHANG Kai1
(1．Jiangsu Institute of Agricultural Sciences Xuhuai Region Huaiyin，Jiangsu Huaian 223001，China;2．Yixing Entry-exit Inspection and Quarantine Bureau of People’s Republic of China，Jiangsu Yixing 214206，China)

The biological characteristics of different genotypes Ditylenchus destructor infected on the resistant and susceptible sweet by inoculation of different numbers of Ditylenchus destructor from different area in China were studied．The result showed that with the increase of DeYL，nematode population were significant increased in different varieties，and compared with the other 2 varieties，the amount of nematode propagation in Lizixiang sweet potato varieties were significantly different at 0．05 level;With the increase of inoculation rate in Lizixiang，sex ratio of nematode increased from 0．77 to 1．44 and showed the differentiation of female nematode;In Xushu-18 also shown as to the differentiation of female nematode，the correlation analysis showed that the fecundity and the ratio of nematode populations were positively correlated with three varieties of sweet potato，and their correlation coefficients were 0．987，0．477 and 0．984，respectively;Under the same quantity，the production and sex ratio of three different nematodes indicated that the different populations of nematodes had significant differences in different nutrition conditions，which was proved that the growth environment of the nematode had a certain effect on the growth and development of nematode;Three different nematode populations performed high production，high sex ratio and gender to female differentiation on Lizixiang sweet potato varieties．

Ditylenchus destructor;Nutrient environment;Production;Male and female ratio

S432．45

A

1001－4829(2017)1－0093－06

10．16213/j．cnki．scjas．2017．1．017

2016－01－20

江蘇省農(nóng)業(yè)科技自主創(chuàng)新資金項目［SCX(14) 5086］;淮安市農(nóng)科院院長基金(NKY20150518)

王宏寶(1982－)，男，山西大同人，碩士，助理研究員，從事植物病原線蟲防治與新技術(shù)開發(fā)，E-mail:wanghongbao252@126．com，*為通訊作者:趙桂東，研究員，主要從事植物病原線蟲的生物防治研究。