骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植治療缺血性心臟病的實(shí)驗(yàn)理論探索

陳雨　黃榕　張小瓊

【中圖分類號】R68 【文獻(xiàn)標(biāo)識碼】A 【文章編號】2095-6851（2017）03-0-01

缺血性心臟?。╥schemic heart disease，IHD），即冠狀動脈粥樣硬化性心臟（coronary atherosclerotic heart disease ），指冠狀動脈粥樣硬化或（和）冠狀動脈功能性改變使血管腔狹窄或阻塞，導(dǎo)致心肌缺血缺氧或壞死而引起的心臟病。隨著經(jīng)皮冠狀動脈介入治療（Percutaneous coronary intervention ，PCI）和冠狀動脈搭橋術(shù)（CABG）廣泛應(yīng)用于臨床，IHD治療效果明顯，但對于嚴(yán)重的IHD，如彌散性病變及梗死區(qū)遠(yuǎn)端心肌壞死、血管阻塞等，通過現(xiàn)有治療手段患者即使可以渡過急性期，因心肌再生能力不足，壞死心肌纖維化、瘢痕化仍不可逆轉(zhuǎn)，導(dǎo)致心力衰竭等嚴(yán)重并發(fā)癥的發(fā)生。近年，干細(xì)胞移植研究給心血管疾病帶來了新的曙光。其中，骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（陳雨bonemarrow mesenchymal stem cells， BMSCs ）由于其來源廣泛、容易獲取、擴(kuò)增能力強(qiáng)、多項分化潛能、易與宿主細(xì)胞建立聯(lián)系及免疫原性低、能歸巢、無醫(yī)學(xué)倫理學(xué)爭議等[1]優(yōu)越性被大量前臨床研究用于缺血性心臟病的細(xì)胞治療。

1.骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（bonemarrowmesenchymalstemcells，BMSCs）的概述：

血BMSCs屬于骨髓干細(xì)胞中的一種，具有高度自我更新能力和多向分化能力的成體干細(xì)胞群體，最早于1987年，F(xiàn)riendenstein等[2]發(fā)現(xiàn)在塑料培養(yǎng)皿中培養(yǎng)的貼壁的骨髓單個核細(xì)胞在一定條件下可分化成為成骨細(xì)胞、成軟骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞和成肌細(xì)胞，而且這些細(xì)胞經(jīng)過20～30個培養(yǎng)周期后仍能保持其多向分化潛能；研究顯示，人BMSCs在體外用5-氮胞苷（5-aza）處理24小時后可誘導(dǎo)成心肌細(xì)胞[3]Wang等人觀察到在“環(huán)境誘導(dǎo)分化“的作用下，不經(jīng)5-aza處理的BMSCs在體內(nèi)可分化為心肌細(xì)胞并與宿主心肌細(xì)胞之間形成閏盤聯(lián)系[4]。該類骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞不表達(dá)造血細(xì)胞系標(biāo)記CD14、CD34、CD45及CD133，不表達(dá)內(nèi)皮細(xì)胞系標(biāo)記如vonWillebrand因子、P選擇蛋白，而表達(dá)CD105、CD90及CD166抗原。后來的研究發(fā)現(xiàn)在體外培養(yǎng)條件下，BMSCs還具有向其他胚層細(xì)胞方向分化的能力，如肌腱、脂肪、肌肉、內(nèi)皮、神經(jīng)及心肌細(xì)胞等[5][6]。

2.取材：

不同組織來源的間充質(zhì)干細(xì)胞的表型、增值分化能力和基因表達(dá)有一定差異，骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞占有核細(xì)胞總數(shù)的0.001%—0.010%，并隨著年齡的增大而減少[7]，為實(shí)驗(yàn)研究的方便性和可行性，宜取幼齡小型哺乳動物的長骨骨髓。

3.分離純化及鑒定

目前對于骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的分離純化常用的方法有：貼壁細(xì)胞離心法、密度梯度離心法、流式細(xì)胞儀法與免疫磁珠分離法等。貼壁細(xì)胞分離法是根據(jù)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞貼壁生長的特性，通過反復(fù)換液去除懸浮細(xì)胞，使其與造血干細(xì)胞分離。培養(yǎng)所得的原代骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞貼壁增殖快，細(xì)胞活性高，缺點(diǎn)是所得細(xì)胞成分復(fù)雜，分離難度高。密度梯度離心法是根據(jù)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞與其他細(xì)胞的密度差異進(jìn)行細(xì)胞分離。這種方法與貼壁分離法結(jié)合，分離得到的細(xì)胞純度相對更高，獲得廣泛采用。免疫磁珠分離法是利用的表面特異性抗原，利用免疫磁珠進(jìn)行分離，它是目前所能獲得BMSCs純度最高的方法。[8]但由于BMSCs表面缺乏特異性標(biāo)志，及分選后的細(xì)胞出現(xiàn)了增殖緩慢等問題，而且費(fèi)用昂貴、操縱復(fù)雜、目前應(yīng)用較少[9]。由于間充質(zhì)干細(xì)胞表面具有多種標(biāo)記物，但目前尚未篩選到獨(dú)有的標(biāo)志分子，給間充質(zhì)干細(xì)胞的鑒定帶來可一定的困難，2006年，國際細(xì)胞治療協(xié)會提出了關(guān)于間充質(zhì)干細(xì)胞鑒定的最低標(biāo)準(zhǔn)，包括3方面內(nèi)容：在標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)條件下能貼塑料瓶壁生長。95%以上的細(xì)胞表達(dá)CD105、CD73、CD90，同時95%以上的細(xì)胞不表達(dá)CD45、CD14或CD11b、CD79a或HLA-DR。能分化為骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞及軟骨細(xì)胞。

4.預(yù)處理：

4.1 低氧處理：間充質(zhì)干細(xì)胞在培養(yǎng)基中一般呈單細(xì)胞層生長，在低氧條件下，其增擴(kuò)率可增加30倍。低氧條件下預(yù)處理BMSCs能增強(qiáng)BMSCs對心肌細(xì)胞凋亡的保護(hù)作用。

4.2 基因轉(zhuǎn)染MSCs：目前認(rèn)為血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）是最有效刺激血管生成的細(xì)胞因子之一，人類至少有4種VEGF，分別由121、165、189和206個氨基酸組成，其中VEGF165是發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)的主要成分。Carmeliet等人發(fā)現(xiàn)VEGF表達(dá)水平對獲得性血管生成是非常重要的。VEGF基因轉(zhuǎn)染的MSCs能分泌較高水平的VEGF。研究顯VEGF基因轉(zhuǎn)染的MSCs移植在1個月后能產(chǎn)生較強(qiáng)的成血管反應(yīng)，導(dǎo)致血管密度顯著增加，且絕大多數(shù)新生血管是宿主源性的。

由于新生血管受多種生長因子的調(diào)控，單一生長因子生成的血管存在不穩(wěn)定和易滲漏問題，聯(lián)合基因治療是非常重要的。缺氧誘導(dǎo)因子-1α（HIF-1α）是細(xì)胞在缺氧條件下產(chǎn)生的具有轉(zhuǎn)錄活性的蛋白，不僅可以結(jié)合多種促血管因子如血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）、轉(zhuǎn)化生長因子β（TGF-β）等及其受體基因啟動子上的缺氧反應(yīng)元件，從而增強(qiáng)相應(yīng)蛋白表達(dá)，啟動血管新生的過程，提高血流灌注。

4.3 胰島素樣生長因子（insulin-likegrowthfactor-1，IGF-1）具有誘導(dǎo)細(xì)胞增殖、移植細(xì)胞凋亡、緩解心力衰竭過程中心肌細(xì)胞外基質(zhì)重構(gòu)作用的一類生長激素。研究顯示IGF-1預(yù)處理的MSCs對心肌梗死后心肌有顯著的抗炎作用，并且IGF-1預(yù)處理通過增強(qiáng)MSCs歸巢效率及抗炎作用進(jìn)一步提高心肌再生能力。

4.4 信號通路：MSCs中存在分化為各種功能細(xì)胞的目的基因，在分化的不同階段，會有不同的基因表達(dá)，這種事件是隨機(jī)的受微環(huán)境、細(xì)胞因子及信號通路的影響。如果加入誘導(dǎo)因子或細(xì)胞及信號通路調(diào)節(jié)子，增強(qiáng)目的基因表達(dá)，抑制其他基因的表達(dá)，就可使干細(xì)胞向目的細(xì)胞分化。目前有學(xué)者研究表明Notch信號通路對于干細(xì)胞分化為心肌細(xì)胞起著重要的調(diào)節(jié)作用。

5.移植途徑的選擇：

（1）經(jīng)外周靜脈注射：操作簡單，與干細(xì)胞歸巢有關(guān)，但也存在以下缺點(diǎn)細(xì)胞在血中循環(huán)時間較其他方法長，存在滯留現(xiàn)象，丟失的數(shù)量也較多；對其它臟器有影響，在肺、肝、脾中發(fā)現(xiàn)標(biāo)記的干細(xì)胞；歸巢有賴于趨化因子的濃度梯度，如心肌梗死時間過久，歸巢的效果會受到影響；④異種的細(xì)胞移植不能用此種方式。（2）經(jīng)冠狀動脈注入：經(jīng)心導(dǎo)管將MSCs選擇性的直接注入缺血損傷區(qū)域的冠狀動脈，MSCs易于進(jìn)入損傷心肌內(nèi)，為干細(xì)胞歸巢提供了有利條件，但晚期缺血性心臟病患者冠狀動脈增厚，MSCs無法通過細(xì)胞壁，移植效果欠佳，且目前可行性差。（3）骨髓動員：并不對干細(xì)胞進(jìn)行分離、培養(yǎng)及灌注，而是應(yīng)用粒細(xì)胞集落刺激因子、干細(xì)胞因子靜脈注射使來自骨骼的干細(xì)胞、祖細(xì)胞進(jìn)入血液，方法簡單，但動員的細(xì)胞并非BMSCs一種，實(shí)驗(yàn)中也難以確定細(xì)胞進(jìn)入血液的細(xì)胞的量（4）心肌內(nèi)注射：心肌內(nèi)注射分為心外膜注射和經(jīng)心內(nèi)膜注射。心內(nèi)膜注射法定位雖然更加準(zhǔn)確，但對技術(shù)水平和設(shè)備要求高，目前臨床廣泛開展困難；開胸在直視下對梗死區(qū)域心肌進(jìn)行MSCs移植的心外膜法，定位性好，Zhang等報道該途徑可使MSCs準(zhǔn)確移植于梗死區(qū)及周邊區(qū)，最大限度的達(dá)到細(xì)胞移植的效果，改善移植后患者心功能的恢復(fù)。

6.6 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞治療缺血性心臟病的機(jī)制：（1）分化為心?。汗撬栝g充質(zhì)干細(xì)胞多通過磷脂酰肌醇-3激酶（PI3-K）/絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶途徑參與心肌細(xì)胞分化。PI3-K是一種與細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)有關(guān)的胞內(nèi)蛋白激酶，可被多種細(xì)胞因子激活。目前研究最多的細(xì)胞因子是轉(zhuǎn)化生長因子-β（TGF-β）和骨形態(tài)發(fā)生蛋白2（BMP-2）。（2）促進(jìn)血管新生，改善心肌血液供應(yīng)：BMSC已經(jīng)被證實(shí)可以分化為血管內(nèi)皮細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞等血管結(jié)構(gòu)細(xì)胞，這些細(xì)胞參與血管發(fā)生、發(fā)育及生成。[21]（3）旁分泌機(jī)制：旁分泌機(jī)制依賴于骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞各種因子的釋放，包括血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）、肝細(xì)胞生長因子和基質(zhì)細(xì)胞源性生長因子，通過組織間隙作用于周圍細(xì)胞，發(fā)揮其血管再生、抗凋亡、促進(jìn)有絲分裂和免疫調(diào)節(jié)等生理作用。（4）歸巢理論：BMSCs在多種因素的作用下可定向趨向性遷移越過血管內(nèi)皮細(xì)胞至靶向組織并定值存活。[22]（5）信號通路：MSCS在特定環(huán)境下可分化為多種組織細(xì)胞，通過精確調(diào)控其信號通路，可誘導(dǎo)其向特定的細(xì)胞分化。MSCS在增殖及分化過程中存在Notch信號通路，在干細(xì)胞分化為心肌細(xì)胞的過程中Notch信號上調(diào)。7.實(shí)驗(yàn)結(jié)果評價指標(biāo)的選擇：（1）心肌酶學(xué)（2）心臟彩超（3）病理（4）通過微積分等方法計算壞死心肌面積（5）冠狀動脈造影（6）核素心肌顯像（7）免疫熒光標(biāo)志物示蹤法

8.討論：

（1）移植時間、移植途徑、移植細(xì)胞量的選擇。（2）是否對骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞進(jìn)行預(yù)處理。（3）移植后處理：如服用他汀類調(diào)脂藥物可抑制骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向成脂細(xì)胞分化。

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