小葉蓮有效成分對人乳腺癌細胞增殖、細胞周期及線粒體膜電位的影響Δ

孔 越，王慶輝，尚明英#，肖軍軍，孟書聰，蔡少青（.北京大學(xué)藥學(xué)院天然藥物學(xué)系，北京 009；2.國家知識產(chǎn)權(quán)局專利局專利審查協(xié)作北京中心，北京 0090；.北京大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院細胞生物學(xué)系，北京009）

小葉蓮有效成分對人乳腺癌細胞增殖、細胞周期及線粒體膜電位的影響Δ

孔 越1，2＊，王慶輝1，尚明英1#，肖軍軍3，孟書聰3，蔡少青1（1.北京大學(xué)藥學(xué)院天然藥物學(xué)系，北京 100191；2.國家知識產(chǎn)權(quán)局專利局專利審查協(xié)作北京中心，北京 100190；3.北京大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院細胞生物學(xué)系，北京100191）

目的：探討小葉蓮提取物、有效成分及成分組合對人乳腺癌細胞增殖的影響及機制。方法：采用酸性磷酸酶法測定小葉蓮4種提取物[乙醇提取物（Xc）、乙醇提取物石油醚萃取物（Xp）、乙醇提取物乙酸乙酯萃取物（Xe）、乙醇提取物正丁醇萃取物（Xz）]、5種有效成分[鬼臼毒素（S1）、去氧鬼臼毒素（S2）、4-去甲去氧鬼臼毒素（S3）、8-異戊烯基山柰酚（S4）、8，2′-二異戊烯基槲皮素-3-甲醚（S5）]以及3種有效成分組合{組合1[S1-S2-S3-S4-S5（2∶4∶1∶4∶32），Z1]、組合2[S2-S4（1∶1），Z2]、組合3[S3-S4（1∶4），Z3]}對人乳腺癌MDA-MB-231、MCF-7細胞增殖的影響；流式細胞儀檢測上述樣品對MDA-MB-231、MCF-7（或T47D）細胞周期和細胞線粒體膜電位的影響。結(jié)果：小葉蓮有效成分組合Z1對MDA-MB-231、MCF-7細胞具有顯著抑制作用，其半數(shù)抑制濃度（IC50）分別為（0.27±0.2）、（0.11±0.1）μg/mL；提取物Xc、Xp、Xe，有效成分S2、S4以及成分組合Z2、Z3對MDA-MB-231、MCF-7（或T47D）細胞的增殖均有較強抑制作用，IC50均小于15 μg/mL；各提取物和有效成分均可阻滯MDA-MB-231、MCF-7細胞周期于G2/M期；各有效成分組合均可阻滯MDA-MB-231、T47D細胞周期于G0/G1期，并能降低MDA-MB-231、T47D細胞線粒體膜電位。結(jié)論：小葉蓮有效成分及成分組合可通過影響細胞周期和線粒體膜電位，從而抑制乳腺癌細胞的增殖。

小葉蓮；有效成分；有效成分組合；人乳腺癌MDA-MB-231細胞；人乳腺癌MCF-7細胞；人乳腺癌T47D細胞；細胞周期；線粒體膜電位

本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，小葉蓮乙醇提取物、乙酸乙酯萃取物以及小葉蓮主要成分8，2′-二異戊烯基槲皮素-3-甲醚和槲皮素對人乳腺癌細胞MCF-7裸鼠移植瘤具有明顯的抑瘤作用，對人乳腺癌T47D、MCF-7和MDA-MB-231細胞增殖有明顯抑制作用[2，8]。在前期研究基礎(chǔ)上，本研究采用人乳腺癌T47D、MCF-7和MDAMB-231細胞株，對小葉蓮乙醇提取物及其不同極性萃取部分、從小葉蓮抗乳腺癌有效部位乙酸乙酯萃取物中分離得到的各種有效成分以及有效成分組合進行體外乳腺癌細胞增殖抑制試驗，并初步探討其對乳腺癌細胞周期和細胞線粒體膜電位的影響，為進一步明確小葉蓮抗乳腺癌的有效成分和作用機制提供實驗依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器

680型Microplate Reader酶標儀（美國Bio-Rad公司）；FACS Clibur型流式細胞儀（美國Becton Dickinson公司）。

1.2 藥品與試劑

注射用順鉑（無菌分裝粉針劑，齊魯制藥有限公司，批號：1060171DB，規(guī)格：10 mg）；紫杉醇注射液（揚子江藥業(yè)集團有限公司，批號：10031812，規(guī)格：16.7 mL∶100 mg）；鬼臼毒素（S1）、去氧鬼臼毒素（S2）、4′-去甲去氧鬼臼毒素（S3）、8-異戊烯基山柰酚（S4）和8，2′-二異戊烯基槲皮素-3-甲醚（S5）為筆者從小葉蓮中分離得到，通過1H-NMR、13C-NMR譜等方法鑒定其化學(xué)結(jié)構(gòu)，經(jīng)高效液相色譜（HPLC）-二級管陣列檢測（DAD）面積歸一化法測定各化合物純度均高于98%；小葉蓮有效成分組合1[S1-S2-S3-S4-S5（2∶4∶1∶4∶32），m/m/m/m，Z1]、組合2[S2-S4（1∶1），m/m，Z2]、組合3[S3-S4（1∶4），m/m，Z3]；小葉蓮乙醇提取物（Xc）、乙醇提取物石油醚萃取物（Xp）、乙醇提取物乙酸乙酯萃取物（Xe）、乙醇提取物正丁醇萃取物（Xz）按文獻[8]方法制備，單體化合物和有效成分組合以二甲基亞砜（DMSO）制備成濃度均為10μmol/mL的貯備液，即S1、S2、S3、S4的質(zhì)量濃度分別為4.14、3.98、3.84、3.54、4.52 mg/mL，Z1、Z2、Z3的質(zhì)量濃度分別為4.34、3.76、3.60 mg/mL；將小葉蓮提取物以DMSO制備成質(zhì)量濃度均為10 mg/mL的貯備液；DMEM培養(yǎng)基、新生小牛血清（美國Gibco公司）；硝基苯磷酸鹽（美國Fluka公司）；其余試劑均為國產(chǎn)分析純，均由北京化工廠生產(chǎn)。

1.3 細胞株

人乳腺癌MDA-MB-231細胞株、人乳腺癌MCF-7細胞株和人乳腺癌T47D細胞株由北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部腫瘤生物中心杜曉娟副教授提供。

2 方法

2.1 細胞培養(yǎng)

當?shù)刂饕N植荔枝、柑桔、木瓜、番石榴、火龍果等經(jīng)濟作物。近兩年，當?shù)卮罅ν菩兴室惑w化種植，這是轉(zhuǎn)變農(nóng)業(yè)施肥方式的一項先進農(nóng)作物科學(xué)施肥技術(shù)。目前當?shù)刂魍扑室惑w化配套水溶肥、液體肥，很多農(nóng)民都參加了培訓(xùn)。從今年開始，農(nóng)藥價格較去年同期上漲3.6%，化肥價格同比上漲7%，經(jīng)銷商積極性雖然提高，但仍不囤貨。

人乳腺癌MDA-MB-231細胞株、人乳腺癌MCF-7細胞株和人乳腺癌T47D細胞株均用含10%新生小牛血清、100 u/mL青霉素和100 u/mL鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基于37℃、95%濕度、5%CO2的孵箱中培養(yǎng)，細胞接近融合時用2.5 g/L胰蛋白酶消化傳代，同時接種細胞進行試驗。

2.2 酸性磷酸酶法檢測細胞增殖及增殖抑制率

按照文獻[15]方法，取對數(shù)生長期細胞消化后制成細胞懸液，按1.5×103個/孔的密度接種于96孔培養(yǎng)板中，培養(yǎng)24 h待細胞完全貼壁后，實驗組分別加入1、5、25、50、100μg/mL質(zhì)量濃度的小葉蓮提取物或者濃度為1、5、10、50、100μmol/L的單體化合物和有效成分組合；陰性對照組加入DMEM培養(yǎng)液；順鉑組（陽性對照）分別加入1、2、4、6、8、10μg/mL質(zhì)量濃度的順鉑溶液。每個濃度設(shè)6個復(fù)孔，分別于作用24、48、72 h后棄去培養(yǎng)基，各孔用磷酸鹽緩沖液（PBS）100μL洗2遍，棄PBS，加入10 mmol/L的硝基苯磷酸鹽溶液100μL（0.1 mol/L醋酸緩沖液制備，含0.1%Triton X-100），置于37℃孵育2 h后，每孔加入1 mol/L氫氧化鈉溶液10μL終止反應(yīng)。用酶標儀檢測405 nm波長處吸光度（A），重復(fù)試驗3次。計算細胞的增殖抑制率[增殖抑制率（%）＝（1－實驗組平均A值/陰性對照組平均A值）×100%]。采用SPSS 21.0軟件計算半數(shù)抑制濃度（IC50）。

2.3 流式細胞術(shù)檢測細胞周期

小葉蓮提取物和單體化合物的實驗組采用人乳腺癌MDA-MB-231和MCF-7細胞，Xc和Xe加入的質(zhì)量濃度均為25μg/mL，S2、S3、S4加入的質(zhì)量濃度分別為3.98、3.84、17.7μg/mL；有效成分組合的實驗組采用人乳腺癌MDA-MB-231和T47D細胞，Z1、Z2、Z3加入的質(zhì)量濃度分別為0.217、0.94、51.8μg/mL；陰性對照組加入DMEM培養(yǎng)液；紫杉醇組（陽性對照）加入紫杉醇2μg/mL。上述各組分別于作用24、48 h后，用胰蛋白酶溶液消化細胞，PBS洗滌，加入冰預(yù)冷的70%乙醇3 mL，4℃固定1 h，PBS洗滌2次，加入0.2 mg/mL RNA酶室溫保溫30min，加入終質(zhì)量濃度為20 mg/L的碘化丙啶，溫育30 min。應(yīng)用流式細胞儀檢測樣品對乳腺癌細胞周期的影響，不同分期細胞所占比例采用ModFit LT細胞周期分析軟件進行分析。

2.4 流式細胞術(shù)檢測細胞線粒體膜電位

人乳腺癌MDA-MB-231和T47D細胞株在DMEM培養(yǎng)液中培養(yǎng)。小葉蓮有效成分組合實驗組Z1、Z2、Z3加入質(zhì)量濃度分別為0.217、0.94、1.8μg/mL，陰性對照組加入DMEM培養(yǎng)液，紫杉醇組（陽性對照）加入紫杉醇2 μg/mL。作用24 h后，經(jīng)胰蛋白酶溶液消化細胞，冷PBS洗滌，500 μL PBS重懸細胞，再加入500 μL Rhodamine 123（10 mg/L）用以標記活細胞，終濃度為0.14 μmol/L。37Ⅴ孵育30 min后，PBS洗滌細胞3次，PBS重懸細胞，流式細胞儀檢測細胞線粒體膜電位（激發(fā)波長為488 nm，發(fā)射波長為525 nm）。

3 結(jié)果

3.1 小葉蓮提取物、有效成分和成分組合對人乳腺癌細胞增殖的影響

3種小葉蓮提取物Xc、Xp、Xe均可較好地抑制MDAMB-231細胞的增殖，Xz作用不明顯；5種單體化合物對MDA-MB-231細胞的增殖均有一定抑制作用，以S3作用最強；在高濃度（100μmol/L）時2種異戊烯基黃酮類成分S4、S5表現(xiàn)出較強的抑制作用，其抑制率分別為94.8%、98.6%，其作用強于3種木脂素類成分S1、S2、S3（抑制率分別為50.0%、60.2%、69.9%）；3種有效成分組合中以Z1作用最強。

各樣品對MCF-7細胞的增殖均有一定的抑制作用，4種不同極性小葉蓮提取物中以Xe的作用最強；5種單體化合物中以S2作用最強，S4、S5則在高濃度（100 μmol/L）下表現(xiàn)出較強的抑制活性（抑制率分別為81.2%、92.1%）；3種有效成分組合中以Z1作用最強。IC50測定結(jié)果見表1。

3.2 小葉蓮提取物、有效成分和成分組合對細胞周期的影響

3.2.1 小葉蓮提取物及有效成分對MDA-MB-231和MCF-7細胞周期的影響 小葉蓮各提取物和單體化合物與MDA-MB-231細胞分別作用24 h后，與陰性對照組比較，各實驗組G0/G1期細胞比例明顯降低，G2/M期細胞比例明顯升高；小葉蓮各提取物和單體化合物與MCF-7細胞分別作用24 h后，與陰性對照組比較，各實驗組G0/G1期細胞比例顯著升高、S期細胞比例明顯降低；紫杉醇組也表現(xiàn)出同樣的抑制作用，結(jié)果見表2。

3.2.2 小葉蓮有效成分組合對MDA-MB-231、T47D細胞周期的影響 小葉蓮有效成分組合與MDA-MB-231、T47D細胞分別作用24 h后，與陰性對照組比較，各實驗組G0/G1期細胞比例明顯降低，G2/M期細胞比例明顯升高；紫杉醇組也表現(xiàn)出同樣的抑制作用，結(jié)果見表3。

表1 小葉蓮提取物、有效成分和成分組合作用48 h后對細胞的IC50測定結(jié)果（s，μg/mL，n＝6）Tab 1 Determination results of IC50of Sinopodophylli Fructus extracts，active constituents，constituent combination on cell after 48 h（s，μg/ mL，n＝6）

表1 小葉蓮提取物、有效成分和成分組合作用48 h后對細胞的IC50測定結(jié)果（s，μg/mL，n＝6）Tab 1 Determination results of IC50of Sinopodophylli Fructus extracts，active constituents，constituent combination on cell after 48 h（s，μg/ mL，n＝6）

注：“-”表示IC50＞100μg/mLNote：“-”means IC50＞100μg/mL

MDA-MB-231MCF-7 21.27±0.3 14.01±0.1 1.00±0.4 0.62±0.1 -2.68±0.2 2.10±0.3 0.28±0.1 10.20±0.5 11.50±0.4 0.27±0.2 2.72±0.3 1.27±0.2組別陰性對照組順鉑組Xc組Xp組Xe組Xz組S1組S2組S3組S4組S5組Z1組Z2組Z3組25.96±0.4 2.67±0.2 2.08±0.3 1.26±0.1 16.59±0.5 9.08±0.4 1.00±0.1 16.55±0.4 10.24±0.6 24.40±0.5 0.11±0.1 5.43±0.4 0.74±0.1

表2 小葉蓮提取物及有效成分作用24 h后對MDAMB-231、MCF-7細胞周期的影響（%%）Tab 2 Effects of Sinopodophylli Fructus extracts and active constituents on MDA-MB-231，MCF-7 cell cycle after 24 h（%%）

表3 小葉蓮有效成分組合作用24 h后對MDA-MB-231、T47D細胞周期的影響（%%）Tab 3 Effects of Sinopodophylli Fructus active constituents on MDA-MB-231 and T47D cell cycle after 24 h（%%）

3.3 小葉蓮有效成分組合對細胞線粒體膜電位的影響

小葉蓮有效成分組合Z1、Z2、Z3作用MDA-MB-231、T47D細胞24 h后，弱熒光細胞（M1）與陰性對照組比較開始增多，常熒光細胞（M2）相應(yīng)地減少，提示MDAMB-231和T47D細胞在不同的小葉蓮有效成分組合作用下，線粒體跨膜電位受到影響而下降，使得進入細胞內(nèi)的熒光染料減少、M1百分比增高。

表4 小葉蓮有效成分組合對人乳腺癌MDA-MB-231和T47D細胞線粒體膜電位的影響（%%）Tab 4 Effects of Sinopodophylli Fructus active constituents on mitochondrial membrane potential in MDA-MB-231，T47D cell after 24 h（%%）

4 討論

本研究在前期研究工作的基礎(chǔ)上通過細胞試驗進一步證明了小葉蓮提取物乙酸乙酯部位為小葉蓮抑制乳腺癌的有效部位。從小葉蓮乙酸乙酯萃取物中分離得到的5種單體化合物，其中3種鬼臼毒素類木脂素S1、S2和S3對2種類型乳腺癌細胞均表現(xiàn)出了較強的抑制作用，S3對MDA-MB-231細胞的抑制作用最強，S2則對MCF-7細胞的抑制作用最強；異戊烯基黃酮類化合物S4和S5在高濃度（100μmol/L）下對人乳腺癌細胞MDAMB-231和MCF-7的增殖表現(xiàn)出較強的抑制作用。3種有效成分組合分別為根據(jù)各單體化合物在小葉蓮藥材中的含量比例配合而成，其中Z1為3種鬼臼毒素類木脂素和2種異戊烯基黃酮類成分按一定比例組合而成，其對乳腺癌細胞的抑制作用強于各單體化合物。結(jié)果提示，小葉蓮中所含的木脂素類和異戊烯基黃酮類化合物可能通過不同的作用途徑發(fā)揮抗乳腺癌活性，各有效成分組合會產(chǎn)生疊加作用。

本研究用實驗樣品對3種乳腺癌細胞周期的影響不同（因不同實驗階段實驗室內(nèi)細胞生長等原因，小葉蓮提取物和單體化合物選擇MDA-MB-231和MCF-7細胞株，化合物組合樣品選擇MDA-MB-231和T47D細胞株）。對于乳腺癌細胞株MDA-MB-231，Xc、Xe及S2、S3、S4及成分組合Z1、Z2、Z3均將細胞阻滯在G2/M期；對于乳腺癌細胞株T47D，各有效成分組合Z1、Z2、Z3均將細胞阻滯在G2/M期；而對于乳腺癌細胞株MCF-7，提取物及各單體化合物將細胞阻滯在G0/G1期。小葉蓮提取物、有效成分及成分組合對不同的乳腺癌細胞周期產(chǎn)生的影響不同，各有效成分組合均能降低MDA-MB-231細胞和T47D細胞線粒體膜電位，具體作用機制有待進一步研究。

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Effects of Active Constituents ofSinopodophylli Fructuson Cell Proliferation，Cell Cycle and Mitochondrial Membrane Potential of Human Breast Cancer Cell

KONG Yue1，2，WANG Qinghui1，SHANG Mingying1，XIAO Junjun3，MENG Shucong3，CAI Shaoqing1（1.Dept.of Natural Medicines，School of Pharmaceutical Sciences，Peking University，Beijing 100191，China；2.Patent Examination Cooperation Center of State Intellectual Property Office，Beijing 100190，China；3.Dept.of Cell Biology，School of Basic Medical Sciences，Peking University，Beijing 100191，China）

OBJECTIVE：To explore the effects and mechanism of extracts，active constituents and constituent combination of Sinopodophylli Fructus on cell proliferation of human breast cancer.METHODS：Acid phosphatase method was conducted to determine the effects of 4 extracts[ethanol extract（Xc），petroleum ether extract from ethanol extract（Xp），ethyl acetate extract from ethanol extract（Xe），n-butanol extract from ethanol extract（Xz）]，5 active constituents[podophyllotoxin（S1），deoxypodophyllotoxin（S2），4-desmethyl deoxypodophyllotoxin（S3），8-isopentenyl kaempferol（S4），8，2′-diisoprenyl quercetin-3-methyl ether（S5）]and 3 active constituent combination[combination 1，S1-S2-S3-S4-S5（2∶4∶1∶4∶32），Z1；combination 2，S2-S4（1∶1），Z2；combination 3，S3-S4（1∶4），Z3]on the MDA-MB-231，MCF-7 cell proliferation；flow cytometry was adopted to detect the effects of above-mentioned samples on MDA-MB-231，MCF-7（T47D）cell cycle and mitochondrial membrane potential.RESULTS：The active constituent combination Z1showed significant inhibitory effects on MDA-MB-231，MCF-7 cells，the half inhibitory concentrations（IC50）were（0.27±0.2），（0.11±0.1）μg/mL；extracts Xc，Xp，Xe，active constituents S2，S4and active constituent combination Z2，Z3showed relatively strong inhibitory effects on MDA-MB-231，MCF-7（T47D）cell proliferation（IC50＜15 μg/mL）. Both extracts and active constituents can block MDA-MB-231，MCF-7 cell cycle in G2/M phase；all active constituents can block MDA-MB-231，T47D cell cycle in G0/G1phase，and can reduce MDA-MB-231，T47D cell mitochondrial membrane potential. CONCLUSIONS：The active constituents and constituent combination of Sinopodophylli Fructus can inhibit cell proliferation of breast cancer by affecting cell cycle and mitochondrial membrane potential.

Sinopodophylli Fructus；Active constituent；Active constituent combination；Human breast cancer MDAMB-231 cells；Human breast cancer MCF-7 cells；Human breast cancer T47D cells；Cell cycle；Mitochondrial membrane potential

R931.6

A

1001-0408（2017）10-1368-04

2016-05-14

2016-12-23）

（編輯：林 靜）

國家科技重大專項重大新藥創(chuàng)制項目（No.2013ZX09103002-006，2009ZX09308-004）；中草藥物質(zhì)基礎(chǔ)與資源利用教育部重點實驗室項目（No.2010JZ-W-01）

＊碩士。研究方向：中藥活性成分。電話：010-62413792。E-mail：kong.yue@foxmail.com

#通信作者：副教授，碩士生導(dǎo)師，博士。研究方向：中藥藥效物質(zhì)與質(zhì)量標準。電話：010-82802534。E-mail：myshang@bjmu.edu.cn

DOI10.6039/j.issn.1001-0408.2017.10.19