葡萄籽原花青素對膽汁酸鹽在結腸腺細胞Caco-2中轉運的影響Δ

來麗華，葛 建（1.杭州市中醫(yī)院廣興堂國醫(yī)館中藥房，杭州 310007；2.中國計量大學藥學系，杭州310018）

葡萄籽原花青素對膽汁酸鹽在結腸腺細胞Caco-2中轉運的影響Δ

來麗華1＊，葛 建2#（1.杭州市中醫(yī)院廣興堂國醫(yī)館中藥房，杭州 310007；2.中國計量大學藥學系，杭州310018）

目的：研究葡萄籽原花青素（GSP）對甘氨膽酸鈉（GA）和?；悄懰徕c（TA）在結腸腺細胞Caco-2中跨膜轉運的影響。方法：利用Caco-2細胞模型，采用反相-高效液相色譜法測定細胞培養(yǎng)液中GA和TA的含量。試驗分為GSP組、GA組、TA組、GSP+ GA組和GSP+TA組，分別檢測0、2、4、8 h從Transwell小室頂端（AP）側透過Caco-2細胞向基底端（BL）側轉運GA和TA的透過量。結果：GA和TA檢測濃度的線性范圍均為0.05～1.2 mmol/L（R2＝0.999 9）。隨著時間的延長，GA組和TA組BL側GA和TA的透過量急劇增加；而加入GSP后，BL側GA和TA的透過量明顯較少，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。結論：GSP對GA和TA在Caco-2細胞中的跨膜轉運具有抑制作用。

葡萄籽原花青素；結腸腺細胞Caco-2；牛磺膽酸鈉；甘氨膽酸鈉；跨膜轉運

原花色素是廣泛存在于多種植物中，具有C6-C3-C6基本構架的一類多酚化合物的總稱，其中原花青素報道最多，分布最為廣泛。國內外研究表明，原花青素具有抗氧化、清除自由基、抗菌、抗癌以及保護肝和心腦血管系統(tǒng)等作用[1-3]。近年來，關于葡萄籽原花青素（GSP）在調控心腦血管系統(tǒng)功能方面的報道較多，尤其是GSP對機體脂質代謝過程改善方面的報道最多[4]。然而，關于GSP調控脂質代謝的分子機制研究報道較少。

膽汁酸是在肝中由膽固醇合成的物質，與甘氨酸或?；撬峤Y合生成甘氨膽酸鈉（GA）或?；悄懰徕c（TA）分泌入十二指腸，膽汁酸鹽可在盲腸末端被重吸收進入腸肝循環(huán)，以保持膽汁酸鹽的動態(tài)平衡[5]。有研究表明，部分水果、蔬菜或茶葉中某些組分可結合膽汁酸鹽，使其排出體外，阻止膽汁酸鹽的重吸收，可促進血漿及肝中膽固醇轉化為膽汁酸，從而降低膽固醇的含量，起到降血脂的效果[6-7]。

筆者前期研究表明，兒茶素類天然多酚化合物能顯著吸附膽汁酸鹽，從而抑制腸道脂質吸收，起到調控血脂代謝功能[8]。而GSP為兒茶素的天然聚合物，同樣能顯著吸附或結合膽汁酸鹽。本文主要研究GSP對膽汁酸鹽GA和TA在結腸腺細胞Caco-2中跨膜轉運的影響，旨在揭示其在調節(jié)脂質代謝方面的可能機制。

1 材料

1.1 儀器

LC-20ATvp高效液相色譜（HPLC）系統(tǒng)和Prominence SPD-20A紫外檢測器（日本Shimaduz公司）；CB53 CO2細胞培養(yǎng)箱（德國Binder公司）；24孔培養(yǎng)板用Transwell小室（美國Corning公司）；TS100-F倒置顯微鏡（日本Nikon公司）。

1.2 藥品與試劑

GSP原料藥（寧波禾普生物科技有限公司，批號：20101012，純度：＞95%）；TA標準品（批號：C1319058，純度：95%）和GA標準品（批號：D1303029，純度：98%）均購于杭州邦易化工有限公司；苯酚紅（批號：P110947，純度：＞99%）和二甲基亞砜（批號：D103281，純度：＞99.9%）均購于上海阿拉丁有限公司。

1.3 細胞與培養(yǎng)液

結腸腺細胞Caco-2購于中國科學院上海細胞典藏中心，用DMEM細胞培養(yǎng)液（含1%非必需氨基酸、1% L-谷氨酰胺、100 u/mL青霉素、100 u/mL鏈霉素和10%胎牛血清）培養(yǎng)，使用前以一次性過濾頭除菌后密封，備用。

2 方法

2.1 GA和TA的含量測定

2.1.1 色譜條件 將文獻[9]方法略作修改，以反相（RT）-HPLC法測定GA和TA的含量。色譜柱：Thermal BDS C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：甲醇-0.6%磷酸二氫鉀（65∶35，V/V）；流速：1.0 mL/min；檢測波長：205 nm；進樣量：20 μL。

2.1.2 方法學考察 用空白培養(yǎng)基分別制備濃度為1.2、0.6、0.3、0.15、0.1、0.05 mmol/L的TA和GA的混合溶液，其中TA和GA濃度相同。另稱取5 g三氯乙酸，加入50 mL水，制備成10%三氯乙酸溶液。分別取TA和GA的混合溶液0.1 mL，置于1.5 mL離心管中，加0.1 mL的培養(yǎng)基，再加入0.2 mL10%三氯乙酸溶液，12 000 r/min（離心半徑5 cm）離心2 min。取上清進樣測定GA和TA的峰面積，繪制標準曲線。按上述方法制備分別含GA和TA 0.05、0.15、0.6 mmol/L的質控樣品，進樣分析，每個濃度重復5次，以質控樣品中GA和TA峰面積與其直接溶于流動相后測得的峰面積的比值計算GA和TA的回收率。每日測定質控樣品5次考察日內精密度，連續(xù)測定5 d考察日間精密度。

2.2 苯酚紅的含量測定

2.2.1 色譜條件 將文獻[10]方法略作修改，以RTHPLC法測定苯酚紅的含量。色譜柱：Thermal BDS C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：甲醇-水-磷酸（55∶45∶0.2，V/V/V）；流速：1.0 mL/min；檢測波長：276 nm；進樣量：20 μL。

2.2.2 方法學考察 取500 mg苯酚紅溶于1 L水中制備成500 mg/L苯酚紅溶液。將500 mg/L苯酚紅溶液倍比稀釋成125、62.5、31.25、15.6、7.8、3.91、1.95 mg/L的溶液，進樣測定苯酚紅的峰面積，繪制標準曲線。按上述方法制備含苯酚紅1.95、7.80、31.25 mg/L的質控溶液，進樣分析，每個濃度重復5次，以質控溶液中苯酚紅的峰面積與其直接溶于流動相后測得的峰面積的比值計算苯酚紅的回收率。每日測定質控溶液5次考察日內精密度，連續(xù)測定5 d考察日間精密度。

2.3 Caco-2細胞的培養(yǎng)

將Caco-2細胞置于含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中，于37℃下培養(yǎng)，每隔1 d更換1次培養(yǎng)基。待細胞長至滿壁后分裝于新的培養(yǎng)瓶傳代，直至培養(yǎng)足量的細胞用于試驗所需為止。將多余細胞保存在凍存管中，于液氮罐中凍存，備用。

2.4 Caco-2細胞的鋪板

取出無菌Trans-well小室中24孔培養(yǎng)板的中間部位并做好標記。取出長勢良好的Caco-2細胞，消毒后棄原培養(yǎng)基，加適量消化液，倒置顯微鏡下觀察細胞形態(tài)，待細胞輪廓清晰時棄去消化液，加適量新鮮培養(yǎng)液，吹打瓶壁，將細胞吹打至培養(yǎng)液中，混勻。每個小室加400 μL含細胞的培養(yǎng)液，其余孔加400 μL磷酸鹽緩沖液（PBS）作為空白對照，培養(yǎng)2 h。

2.5 Caco-2細胞緊密度的測定

取出“2.4”項下鋪板培養(yǎng)后的Caco-2細胞，消毒后加入4.5 mg/mL的苯酚紅溶液200 μL，置于已標記的2個Transwell小室頂端（AP）側，小室基底端（BL）側加入100 μL空白培養(yǎng)液。2 h后，分別從小室的AP、BL側各取100 μL培養(yǎng)液，測定其中苯酚紅濃度。根據(jù)AP側和BL側苯酚紅濃度的比值，評價細胞緊密度。

2.6 分組和透過量的測定

試驗分為GSP組、GA組、TA組、GSP+GA組和GSP+TA組。將GSP制備成2 mg/mL的溶液，GA、TA制成0.24 mmol/L的溶液，按分組將GSP溶液和GA、TA溶液加入Transwell小室AP側，使GSP最終質量濃度為1 mg/mL，GA、TA濃度均為0.12 mmol/L。分別于0、2、4、8 h后吸取BL側100 μL培養(yǎng)液于已標記離心管中，同時補充等量空白培養(yǎng)液，測定培養(yǎng)液中GA、TA的含量。試驗重復6次。

3 結果

3.1 GA、TA測定的方法學考察結果

以GA、TA濃度（c）為橫坐標、峰面積（A）為縱坐標繪制標準曲線，得回歸方程為GA：A＝631 408c+1 747.8（R2＝0.999 9），TA：A＝381 762c－1 278.5（R2＝0.999 9），線性范圍均為0.05～1.20 mmol/L。0.05、0.15、0.6 mmol/L濃度下GA的回收率分別為（98.2±4.2）%、（98.7± 2.5）%、（99.4±2.3）%（n＝3），日內RSD分別為3.26%、2.53%、2.31%（n＝5），日間RSD分別為2.37%、2.06%、1.62%（n＝5）；TA的回收率分別為（98.6±3.6）%、（98.5±1.2）%、（99.9±1.4）%（n＝3），日內RSD分別為3.65%、1.22%、1.40%（n＝5），日間RSD分別為1.97%、1.29%、1.12%（n＝5）。

3.2 苯酚紅測定的方法學考察結果

以苯酚紅質量濃度（c）為橫坐標、峰面積（A）為縱坐標繪制標準曲線，得回歸方程為A＝20 280c+451.66（R2＝0.999 6），線性范圍為1.95～125 mg/L。苯酚紅在1.95、7.80、31.25 mg/L質量濃度下回收率分別為（98.7± 2.2）%、（99.8±2.5）%、（100.1±1.7）%（n＝3），日內RSD分別為2.23%、2.51%、1.69%（n＝5），日間RSD分別為1.17%、1.67%、2.29%（n＝5）。

3.3 Caco-2細胞緊密度

Caco-2細胞緊密度測定結果見表1。

表1 Caco-2細胞緊密度測定結果Tab 1 Determination results of Caco-2 cell compactness

由表1可知，僅有約3%的苯酚紅能通過Caco-2細胞的間隙，說明Caco-2細胞緊密度較高。

3.4 GA和TA的透過量

各組GA和TA的透過量測定結果見表2。

表2 各組GA和TA的透過量測定結果（s，n＝6）Tab 2 Determination results of transport volume of GAand TAin each group（s，n＝6）

表2 各組GA和TA的透過量測定結果（s，n＝6）Tab 2 Determination results of transport volume of GAand TAin each group（s，n＝6）

注：與GA組比較，＊P＜0.01；與TA組比較，#P＜0.01Note：vs.GAgroup，＊P＜0.01；vs.TAgroup，#P＜0.01

時間，GSP+TA組0 0.001 1±0.000 26#0.001 9±0.000 31#0.35±0.052#h0 2 4 8 GA，μmol GSP組TA，μmol GSP組0 0 0 0 GA組0 2.20±0.11 18.01±2.81 31.00±1.52 GSP+GA組0 0.15±0.01＊0.32±0.03＊1.90±0.36＊0 0 0 0 TA組0 3.61±0.49 16.00±2.40 47.01±5.81

由表2可知，隨著時間的延長，GA和TA的透過量均有所增加，但是GSP+GA組細胞的GA透過量明顯低于GA組（P＜0.01），GSP+TA組細胞的TA透過量明顯低于TA組（P＜0.01）。

4 討論

本研究結果表明，GSP能顯著抑制GA和TA透過Caco-2細胞。其原因可能是GSP與膽汁酸鹽發(fā)生了吸附結合作用，造成膽汁酸鹽的理化性質發(fā)生改變。膽汁酸鹽的細胞跨膜方式為自由擴散和主動轉運，其中以主動轉運為主，而GSP與膽汁酸鹽的氫鍵吸附改變了膽汁酸鹽的空間位阻效應，因此阻礙了其跨膜轉運，從而降低了膽汁酸鹽通過細胞膜的轉運能力[11]。通過比較發(fā)現(xiàn)，GSP對TA透過Caco-2細胞的抑制作用強于GA，這可能是GSP羥基對TA的氫鍵作用強于GA所致。

本研究中GSP可能通過與GA和TA吸附結合，從而顯著抑制了膽汁酸鹽的小腸跨膜轉運，阻斷其腸道重吸收，促進了膽汁酸鹽的排泄或降解。由此發(fā)現(xiàn)，一方面GSP可抑制腸道脂質吸收，另一方面GSP又促進了血液中膽固醇向膽汁酸鹽轉化，起到雙重降血脂作用。

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Effects of Grape Seed Proanthocyanidin on the Transport of Bile Salts in Colon Glandular Cell Caco-2

LAI Lihua1，GE Jian2（1.Dept.of TCM，Guangxingtang Traditional Chinese Medicine，Hangzhou Hospital of TCM，Hangzhou 310007，China；2.Dept.of Pharmacy，China Jiliang University，Hangzhou 310018，China）

OBJECTIVE：To study the effects of grape seed proanthocyanidin（GSP）on the transmembrane transport of sodium glycocholate（GA）and sodium taurocholate（TA）in colon glandular cell Caco-2.METHODS：Caco-2 model was used，and RP-HPLC was conducted to determine the contents of GA and TA in cell culture medium.The test was divided into GSP group，GA group，TA group，GSP+GA group and GSP+TA group，the transport volumes of transporting GA and TA from Transwell apical（AP）side to basolateral（BL）side by Caco-2 cell at 0，2，4，8 h were detected，respectively.RESULTS：The linear ranges of GA and TA were 0.05-1.2 mmol/L（R2＝0.999 9）.With the time passing，transport volumes of GA and TA in BL site in GA group and TA group were sharply increased；while the transport volumes were obviously decreased after adding GSP，with statistical significance（P＜0.01）.CONCLUSIONS：GSP has inhibitory effect on the transmembrane transport of GA and TA in Caco-2 cell.

Grape seed proanthocyanidin；Colon glandular cell caco-2；Sodium glycocholate；Sodium taurocholate；Transmembrane transportation

R361+.3；R932

A

1001-0408（2017）10-1323-03

2016-06-16

2016-08-28）

（編輯：鄒麗娟）

國家自然科學基金資助項目（No.31100499）

＊中藥師。研究方向：中草藥活性。電話：0571-87881603。E-mail：xskathy@163.com

#通信作者：副教授，碩士生導師。研究方向：天然藥物。電話：0571-86835702。E-mail：gejian16888@163.com

DOI10.6039/j.issn.1001-0408.2017.10.07