SPE－UPLC－MS／MS法測(cè)定牛奶中β－內(nèi)酰胺類藥物殘留

孫 濤 劉圣紅 劉河疆 古麗斯坦 安 靜 王 成

（新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)與檢測(cè)技術(shù)研究所／農(nóng)業(yè)部農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估實(shí)驗(yàn)室（烏魯木齊）／新疆農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全實(shí)驗(yàn)室，烏魯木齊830091）

儀器應(yīng)用

SPE－UPLC－MS／MS法測(cè)定牛奶中β－內(nèi)酰胺類藥物殘留

孫 濤 劉圣紅 劉河疆 古麗斯坦 安 靜 王 成＊

（新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)與檢測(cè)技術(shù)研究所／農(nóng)業(yè)部農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估實(shí)驗(yàn)室（烏魯木齊）／新疆農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全實(shí)驗(yàn)室，烏魯木齊830091）

本試驗(yàn)應(yīng)用固相萃取技術(shù)（SPE），結(jié)合超高效液相色譜－串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用儀（UPLC－MS／MS），建立了快速測(cè)定生鮮乳中β－內(nèi)酰胺類藥物殘留的方法。樣品經(jīng)乙腈提取，Oaiss PRiME HLB固相萃取小柱凈化后，以0.1%甲酸乙腈溶液和0.1%水溶液為流動(dòng)相，Waters C18色譜柱進(jìn)行分離；多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（MRM）模式，外標(biāo)法進(jìn)行定量。方法回收率在70.1%～95.5%之間；相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（n＝3）范圍為1.0%～9.1%；線性范圍為0.002～0.100mg／L；檢出限為0.1～0.6μg／kg；定量限為0.3～1.8μg／kg。表明該方法專屬性強(qiáng)、靈敏度高，適用于生鮮乳中β－內(nèi)酰胺類藥物殘留的測(cè)定。

固相萃取 超高效液相色譜－串聯(lián)質(zhì)譜 牛奶β－內(nèi)酰胺類藥物

乳制品作為人類膳食結(jié)構(gòu)中動(dòng)物蛋白質(zhì)的主要來(lái)源之一，對(duì)提高生活質(zhì)量和均衡人類膳食結(jié)構(gòu)具有重要作用。隨著人民生活水平的不斷提高，乳及乳制品已成為人們生活 中不可缺少的食品之一。牛奶中的抗生素殘留，不僅會(huì)影響牛奶品質(zhì)，甚至危害人體健康。我國(guó)農(nóng)業(yè)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)《無(wú)公害食品生鮮牛乳》中明確規(guī)定生鮮乳中不得檢出抗生素。β－內(nèi)酰胺類抗生素（β－lactams antbiotics）屬于化學(xué)結(jié)構(gòu)中含有β－內(nèi)酰胺環(huán)的一類抗生素，主要包括青霉素類、頭孢菌素類、頭霉素類、碳?xì)涿赶╊悺⒀躅^孢類等［1］。

歐盟、中國(guó)、美國(guó)等國(guó)家及國(guó)際食品法典委員會(huì)都已對(duì)動(dòng)物源食品中β－內(nèi)酰胺類抗生素殘留量做出了最大殘留限量值的規(guī)定，用以嚴(yán)格控制β－內(nèi)酰胺類抗生素在畜牧業(yè)中的應(yīng)用［2］。檢測(cè)β－內(nèi)酰胺類抗生素的方法主要有微生物檢測(cè)法［3］，酶聯(lián)免疫分析法［4］，液相色譜法（HPLC）［5］，液相色譜－質(zhì)譜法（HPLC－MS）［68］等。本試驗(yàn)研究了牛奶中β－內(nèi)酰胺類抗生素前處理方法和UPLC－MS／MS檢測(cè)條件。結(jié)果表明，本方法簡(jiǎn)便、快速、高效，能提高牛奶中β－內(nèi)酰胺類抗生素檢測(cè)的工作效率。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

ACQUITY UPLC超高效液相色譜儀（美國(guó)Waters公司）；XEVO－TQ三重四級(jí)桿串聯(lián)質(zhì)譜儀（美國(guó)Waters公司），配有電噴霧離子源（ESI）；Milli－Q超純水設(shè)備（美國(guó)Millipore公司）；漩渦混合器（德國(guó)IKA公司）；CT18RT離心機(jī)（天美公司）；Oaiss PRiMe HLB小柱（3CC，60mg，美國(guó)Waters公司）；微孔濾膜0.20μm（美國(guó)Pall公司）。

乙腈、甲醇等均為色譜純；其他試劑均為分析純。水為超純水。

1.2 標(biāo)準(zhǔn)工作液配制

將阿莫西林（99.0%（純度，下同））、頭孢氨芐（99.0%）、青霉素G鉀鹽（99.4%）、青霉素V鉀鹽（99.8%）、苯唑西林（99.0%）、氯唑西林（99.5%）、頭孢哌酮（96.5%）、氨芐西林（99.5%）、雙氯西林（97.5%）和萘夫西林（91.0%）標(biāo)準(zhǔn)品購(gòu)自德國(guó)Dr.Ehrenstorfer公司；頭孢洛寧、阿洛西林、哌拉西林鈉和氟氯西林均為化學(xué)對(duì)照品，購(gòu)自中國(guó)生物制品檢定所。用50%乙腈水溶液配制成質(zhì)量濃度為100mg／L的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，依據(jù)需要稀釋成適當(dāng)質(zhì)量濃度的標(biāo)準(zhǔn)工作液，于4℃下保存。

1.3 色譜條件

色譜柱：Acquity C18（2.1mm×50mm，1.7μm）；柱溫：40℃；樣品室溫度：10℃；進(jìn)樣量：5μL；流動(dòng)相：溶劑A為0.1%甲酸乙腈溶液，溶劑B為0.1%甲酸水溶液；流速：0.20mL／min；梯度洗脫程序?yàn)?min，A5%，B95%；4min，A95%，B5%；5min，A5%，B95%；6min，A5%，B95%。

1.4 質(zhì)譜條件

離子源：電噴霧正離子源（ESI＋）；毛細(xì)管電壓：3.00kV；離子源溫度：150℃；錐孔反吹氣流量：50L／h；脫溶劑氣溫度：350℃；脫溶劑氣流量：650 L／h。碰撞氣：氬氣，流量：0.18mL／min，駐留時(shí)間100ms，多反應(yīng)監(jiān)測(cè)掃描模式（MRM）。質(zhì)譜參數(shù)見(jiàn)表1。

1.5 樣品采集

由市場(chǎng)、超市購(gòu)買(mǎi)牛奶樣品，混合均勻后，冷藏保存。

1.6 樣品處理

準(zhǔn)確稱取2g（0.001g）混勻后的樣品于25mL具塞離心管中，加入5mL乙腈，渦旋混勻1min，10000r／min離心3min，取上清液于10mL玻璃試管，再向25mL具塞離心管中加入3mL乙腈，漩渦混勻后，離心，上清液合并于10mL玻璃試管中，直接過(guò)Oaiss PRiMe HLB固相萃取柱，收集濾出液，35℃氮吹至約0.5mL，用水定容至1mL，過(guò)0.20μm微孔濾膜，待UPLC－MS／MS分析。

2 結(jié)果

2.1 質(zhì)譜條件的優(yōu)化

采用蠕動(dòng)泵自動(dòng)進(jìn)樣方式，以10μL／min速度將1.0μg／mLβ－內(nèi)酰胺類抗生素阿莫西林、頭孢洛寧、頭孢氨芐、氨芐西林、頭孢哌酮、阿洛西林、哌拉西林、青霉素G、青霉素V、苯唑西林、氯唑西林、雙氯西林、氟氯西林和萘夫西林標(biāo)準(zhǔn)溶液注入三重四級(jí)桿質(zhì)譜，采用正離子掃描方式進(jìn)行質(zhì)譜分析，在選定的ESI（＋）模式下，各組分產(chǎn)生穩(wěn)定的強(qiáng)峰母離子。再打開(kāi)碰撞氣氬氣，通過(guò)優(yōu)化碰撞能量等參數(shù)得到相應(yīng)組分的子離子，掃描出穩(wěn)定強(qiáng)峰子離子，通過(guò)比較響應(yīng)信號(hào)的強(qiáng)弱，選擇兩組信號(hào)較強(qiáng)離子對(duì)作為多反應(yīng)監(jiān)測(cè)子離子。對(duì)錐孔電壓、碰撞氣能量、離子源溫度、脫溶劑氣溫度、脫溶劑氣流量、錐孔反吹氣流量等參數(shù)進(jìn)行了優(yōu)化，優(yōu)化后的質(zhì)譜條件見(jiàn)1.4。

2.2 色譜條件的選擇

β－內(nèi)酰胺類抗生素殘留分析多采用C18柱進(jìn)行分離，黃百芬等［9］選取ACQUITY BEH C18（100 mm×2.1mm，1.7μm）對(duì)19種β－內(nèi)酰胺類抗生素進(jìn)行分離，取得較好效果。本試驗(yàn)以ACQUITY BEH C18（50mm×2.1mm，1.7μm）作為分析柱，雖然青霉素V（4.51min）、苯唑西林（4.52min）、氯唑西林（4.53min）保留時(shí)間有重疊，但由于采用多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（MRM）方式，每種組分各開(kāi)一時(shí)間窗口，因此不影響各組分的定性與定量；運(yùn)用電噴霧電離源，采用正離子模式電離，加入甲酸可提高待測(cè)物質(zhì)的響應(yīng)信號(hào)；分別采用不同濃度的甲酸水溶液和甲酸乙腈溶液、甲酸甲醇溶液作為流動(dòng)相進(jìn)行優(yōu)化。最終選用的流動(dòng)相A為0.1%甲酸乙腈溶液，流動(dòng)相B為0.1%甲酸水溶液。同時(shí)選擇適當(dāng)?shù)奶荻认疵摮绦蚴?4種待測(cè)組分得到較好的分離，一次分析僅需6min?？傠x子流圖見(jiàn)圖1，圖1中1～14號(hào)組分依次為阿莫西林、頭孢洛寧、頭孢氨芐、氨芐西林、頭孢哌酮、阿洛西林、哌拉西林、青霉素G、青霉素V、苯唑西林、氯唑西林、雙氯西林、氟氯西林和萘夫西林。

表1 多反應(yīng)監(jiān)測(cè)掃描模式（MRM）的部分質(zhì)譜參數(shù)

圖1 14種β－內(nèi)酰胺類藥物總離子流（TIC）圖

2.3 前處理?xiàng)l件的選擇

生鮮乳品中藥物殘留提取試劑通常有乙腈、甲醇、丙酮。由于大部分β－內(nèi)酰胺類抗生素在酸性條件下不穩(wěn)定，無(wú)法采用酸沉淀法來(lái)處理牛奶中的蛋白質(zhì)，黃百芬等［9］通過(guò)試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)采用乙酸鉛提取法可以得到較好的沉淀效果和理想的回收率；本試驗(yàn)選取乙腈與奶液體積比為3∶1進(jìn)行提取，不僅蛋白沉淀效果好，而且提取液中干擾物少。β－內(nèi)酰胺類藥物常用的固相萃取柱有C18柱和HLB柱等［69］，以上兩種固相萃取小柱用前均需活化，上樣后均需淋洗和洗脫的步驟；本試驗(yàn)應(yīng)用Oaiss PRiMe HLB固相萃取柱，無(wú)需活化、淋洗和洗脫的步驟，采取直接過(guò)濾凈化的方式，提高了樣品前處理的速度。

2.4 線性關(guān)系、方法準(zhǔn)確度及精密度、檢出限及定量限

2.4.1 線性關(guān)系

選取空白樣本提取液配制系列基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行定量，線性關(guān)系和相關(guān)系數(shù)見(jiàn)表2。在0.002～0.100mg／L范圍內(nèi)，14種β－內(nèi)酰胺類藥物線性相關(guān)系數(shù)r≥0.9968。

表2 β－內(nèi)酰胺類藥物線性范圍、線性關(guān)系和相關(guān)系數(shù)

2.4.2 方法準(zhǔn)確度及精密度、檢出限及定量限

對(duì)β－內(nèi)酰胺類藥物分別按0.002、0.010、0.050mg／kg添加水平對(duì)生鮮乳進(jìn)行了加標(biāo)回收試驗(yàn)，得到了較好的結(jié)果，回收率及其相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD（n＝3）見(jiàn)表3。在3個(gè)添加水平，平均回收率在70.1%～95.5%，RSD≤9.1%；以添加標(biāo)準(zhǔn)樣品0.002mg／kg時(shí)按3倍信噪比計(jì)算方法檢出限（LOD），10倍信噪比計(jì)算定量限（LOQ）。

表3 β－內(nèi)酰胺類藥物添加回收率、LOD與LOQ

續(xù)表3

3 結(jié)論

試驗(yàn)選取生鮮乳作為測(cè)試樣品，SPE法凈化結(jié)合液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法；采用電噴霧離子源（ESI＋），Acquity C18超高效液相色譜柱對(duì)生鮮乳中β－內(nèi)酰胺類藥物進(jìn)行分離；建立了超高效液相色譜－串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定生鮮乳中β－內(nèi)酰胺類藥物殘留的分析方法，該方法簡(jiǎn)便、快速、靈敏，測(cè)定結(jié)果滿足生鮮乳中β－內(nèi)酰胺類藥物殘留的檢測(cè)要求。

［1］白國(guó)濤，儲(chǔ)曉剛，潘國(guó)清，等.β－內(nèi)酰胺類抗生素殘留檢測(cè)技術(shù)研究進(jìn)展.食品科學(xué)，2008，2（7）：485－489.

［2］袁萍，劉亞風(fēng)，祝偉霞，等 .動(dòng)物源性食品中β－內(nèi)酰胺類藥物殘留檢測(cè)研究進(jìn)展.檢驗(yàn)檢疫學(xué)刊，2010，20（3）：65－68.

［3］李延華，王偉君，張?zhí)m威，等 .微生物法檢測(cè)牛乳中β－內(nèi)酰胺類抗生素殘留的對(duì)比研究 .中國(guó)抗生素雜志，2009，34（1）：63－66.

［4］姜侃，陳宇鵬，金燕飛，等 .應(yīng)用酶聯(lián)免疫法快速檢測(cè)乳品中β－內(nèi)酰胺類抗生素殘留 .中國(guó)乳品工業(yè)，2010，38（1）：51－54.

［5］孫艷俠 .高效液相色譜在乳品抗生素殘留檢測(cè)中的應(yīng)用.山西農(nóng)業(yè)科學(xué)，2010，38（3）：10－13.

［6］孫雷，張?bào)P，汪霞，等 .超高效液相色譜－串聯(lián)質(zhì)譜法對(duì)動(dòng)物源性食品中13種β－內(nèi)酰胺類藥物殘 留的檢測(cè) .分析測(cè)試學(xué)報(bào)，2009，28（5）：576－578.

［7］宋志超 .動(dòng)物源食品中β－內(nèi)酰胺類抗生素殘留的超高效液相色譜－串聯(lián)質(zhì)譜分析方法研究.鄭州：鄭州大學(xué)，2009.

［8］賈濤 .液相色譜－串聯(lián)質(zhì)譜法檢測(cè)牛奶中β－內(nèi)酰胺類藥物殘留的研究.中國(guó)乳業(yè)，2014，156（12）：53－57.

［9］黃百芬，吳丹青，蔡增軒，等 .超高效液相色譜－串聯(lián)質(zhì)譜法同時(shí)測(cè)定牛奶中19種β－內(nèi)酰胺類抗生素 .中國(guó)衛(wèi)生檢驗(yàn)雜志，2010，20（1）：1－6.

Determination ofβ－lactams residues in milk by SPE－UPLC－MS／MS.

Sun Tao，Liu Shenghong，Liu He－ jiang，Gulisitan，An Jing，Wang Cheng＊
（Institute of Quality Standards ＆Testing Technology for Agro－Products，XinJiang Academy of Agricultural Science，Laboratory of Quality and Safety Risk Assessment for Agro－Products（Urumqi），Key Laboratory of Agro－Products Quality and Safety of Xinjiang，Urumqi 830091，China）

The samples were extracted by acetonitrile and purified with Oaiss an PRiME HLB cartridge.The UPLC analyses were performed on an Acquity UPLC C18column with gradient elution using acetonitrile（containing 0.1%formic）and water（containing 0.1%formic）as mobile phase.The mass spectrometric acquisitions were carried out by means of multiple reaction monitoring（MRM）in electrospray positive ionization mode.The average recoveries ofβ－lactams antibiotics ranged from 70.1%to 95.5%，with the relative standard deviation from 1.0%to 9.1%，the calibration curve was liner from 0.002to 0.100mg／L，the detection limits ofβ－lactams antibiotics were 0.1－0.6μg／kg and the limit of quantitation were 0.3－1.8μg／kg.This method is specific，sensitive and suitable for determination ofβ－lactams antibiotics in the milk.

SPE；UPLC－MS／MS；Milk；β－lactams antibiotics

10.3936／j.issn.1001－232x.2017.01.002

2016－06－27

自治區(qū)公益性科研院所基本科研項(xiàng)目（KYGY2016094）；2016年生鮮乳農(nóng)獸藥、重金屬和生物毒素等危害因子摸底排查與驗(yàn)證評(píng)估項(xiàng)目（GJFP201600802）

孫濤，男，1978年出生，高級(jí)實(shí)驗(yàn)師；E－mail：suntaotxy＠126.com。

王成，男，1971年出生，研究員，主要從事農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全工作。