淫羊藿苷和淫羊藿多糖對氣管切開插管大鼠肺部炎癥的影響

鄧淑蓉 潘宇政 彭玲玲 陳銘堅 董菲菲

廣西醫(yī)科大學(xué)第一臨床附屬醫(yī)院 廣西壯族自治區(qū)南寧市 530021

淫羊藿苷和淫羊藿多糖對氣管切開插管大鼠肺部炎癥的影響

鄧淑蓉 潘宇政 彭玲玲 陳銘堅 董菲菲

廣西醫(yī)科大學(xué)第一臨床附屬醫(yī)院 廣西壯族自治區(qū)南寧市 530021

目的：觀察淫羊藿兩種主要有效成分：淫羊藿苷（ICA）和淫羊藿多糖（EPS）對氣管切開插管大鼠肺部炎癥的不同作用。方法：將SPF級健康雄性SD大鼠隨機分成正常組（A組）、氣管切開插管模型組（B組）、淫羊藿苷用藥組（C組）、淫羊藿多糖用藥組（D組），制作氣管切開插管模型，造模成功6h后，C組開始給予淫羊藿苷灌胃，D組給予淫羊藿多糖灌胃，A、B兩組以等量生理鹽水，每日一次。分別在1d、3d、7d三個時間段每組分別處死6只大鼠，觀察各組肺組織病理學(xué)變化，并用Simith評分測定肺損傷情況；采用酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）測定支氣管肺泡灌洗液中TNF-α和IL-6的濃度。結(jié)果：（1）光鏡下B、C、D三組大鼠肺組織病理三個時段均有不同程度的炎癥等改變，Smith評分均高于A組；但C、D兩組病變在三個時段均明顯小于B組。Smith評分顯示C組病變明顯小于D組。（2）支氣管肺泡灌洗液中B、C、D三組TNF-α、IL-6含量變化趨勢基本一致，在不同時間段均明顯高于A組，24h時達到峰值，隨后下降。兩者在三組含量比較，B組最高，其次D組。結(jié)論：ICA 和EPS均能起到抗炎作用，而ICA明顯優(yōu)于EPS。

氣管切開插管留置；淫羊藿苷；淫羊藿多糖；炎癥

臨床上氣管切開插管患者容易并發(fā)肺部感染，目前臨床上多使用抗感染治療，患者經(jīng)常容易耐藥或者治療效果欠佳，且經(jīng)濟負擔(dān)重。傳統(tǒng)補益中藥淫羊藿，具有補腎壯陽、祛風(fēng)除濕等功效，在臨床上經(jīng)常用于治療支氣管哮喘和慢性支氣管炎等肺部疾病[1,2]。中藥成分復(fù)雜,一味藥中不同有效組分或單體具有不同的作用。ICA和EPS是淫羊藿的主要有效成分，因此，本實驗通過動態(tài)觀察肺組織病理學(xué)改變以及支氣管肺泡灌洗液中TNF-α、IL-6水平的變化，評估淫羊藿兩種不同成分的抗炎作用。

1 材料和方法

1.1 實驗動物及給藥

SD雄性大鼠,體重150±30g(廣西醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心提供,合格證號∶SCΧK (桂)2014-0002），隨機分成A、 B、C、D四組，A組為正常對照組，B組為氣管切開插管留置模型非用藥組, C組為氣管切開插管留置模型淫羊藿苷用藥組，D組為氣管切開插管留置模型淫羊藿多糖用藥組，每組18只大鼠。飼養(yǎng)環(huán)境溫度為25±2℃，自由進水，普通飼料喂養(yǎng)。動物模型制作成功后6h進行給藥干預(yù)。根據(jù)人臨床用藥劑量估算實驗動物用藥[3]， C組給淫羊藿苷灌胃（60mg/kg），D組給淫羊藿多糖灌胃（12mg/kg），A、B組予等量生理鹽水灌胃,每日1次。

1.2 實驗藥物

淫羊藿苷標(biāo)準(zhǔn)品（CAS號：489-32-7，貨號：B21576）， HPLC≥98%；淫羊藿多糖(批號：C22A6Y2480)，純度為50%，均購于上海源葉生物科技有限公司。

圖1：光鏡下大鼠肺組織病理學(xué)改變（HE染色，20X）

1.3 主要試劑

腫瘤壞死因子ELISA試劑盒（TNF-α：CSB-E11987r）濃度及白介素-6ELISA試劑盒（IL-6：CSB-E04640r）均購自于成都華美生物醫(yī)藥有限公司。

1.4 模型制備與取材

采用一次性硬膜外麻醉導(dǎo)管制作氣管切開插管留置大鼠模型[4]。在1d、3d、7d三個時段每組分別處死6只大鼠。結(jié)扎右主支氣管，用4℃預(yù)冷的滅菌生理鹽水3ml反復(fù)灌洗肺部3次，共回收肺泡灌洗液6ml, 4℃1500rpm離心10分鐘，取上清分裝于-80℃保存待檢TNF-α及IL-6；無菌分離右肺用4%多聚甲醛固定液固定，行石蠟包埋、切片待行光鏡觀察肺組織變化。

1.5 觀察指標(biāo)與檢測

1.5.1 肺組織病理學(xué)觀察

取肺組織病理切片作蘇木精-伊紅染色（HE染色），用顯微鏡觀察制好的切片中肺組織的病理學(xué)改變，采用Smith評分方法[5]評估肺部病變程度。

1.5.2 TNF-α及IL -6濃度測定

均采用雙抗體夾心ELISA法，按試劑盒說明進行檢測。使用Curve Exert1.4軟件制作標(biāo)準(zhǔn)曲線并計算出樣本的實際濃度值。

1.6 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 16. 0軟件進行統(tǒng)計分析，計量資料做方差齊性檢驗，方差齊，組間均數(shù)比較釆用單因素方差分析(OnewayANOVA)，兩兩之間比較采用LSD檢驗；檢驗結(jié)果以（±s）表示。顯著性水準(zhǔn)取P＜0.05表示有統(tǒng)計學(xué)差異。

2 結(jié)果

2.1 肺組織病理學(xué)改變

結(jié)果見圖1、表1。B組光鏡下可見肺間質(zhì)及肺泡內(nèi)出血，炎癥細胞浸潤，肺泡間隔增寬，并隨著時間的增加而加重。C、D兩組，光鏡下肺泡內(nèi)少量出血，炎癥細胞少量浸潤，肺泡壁稍增寬。Smith評分結(jié)果顯示，其他三組Smith評分在三個時間段均高于A組；兩組用藥組在第1d時與B組無明顯差異，在3d、7d時兩個時段明顯低于B組；C組與D組同時段比較，1d時無明顯差異，3d、7d時D組評分明顯高于C組（P＜0.05）。

2.2 支氣管肺泡灌洗液中TNF-α的含量變化

結(jié)果見表2。B、C、D三組TNF-α水平與A組在三個時段均比較高（P＜0.05）；C、D兩組TNF-α水平三個時段均比B組低（P＜0.05）；C組TNF-α水平三個時段均比D組低。C、D兩組組內(nèi)同時段比較均隨著時間的延長而明顯下降。

2.3 支氣管肺泡灌洗液中IL-6的含量變化

結(jié)果見表3。B、C、D三組IL-6含量與A組相比在三個時段均比較高（P＜0.05）；C、D兩組IL-6含量三個時段均比B組低（P＜0.05）；C組IL-6含量三個時段均比D組低（P＜0.05）； C、D兩組組內(nèi)同時段比較均隨著時間的延長而下降。

表1：Smith評分（±s）

表1：Smith評分（±s）

注：1.不同組相同時段比較：與A組比較*P＜0.05；與B組比較#＜0.05；與C組比較◆＜0.05。2.同組內(nèi)不同時段比較：與1d比較◇P＜0.05；與3d比較△P＜0.05。

D 6

表2：各組支氣管肺泡灌洗液中TNF-α含量的變化（±s，pg/ml）

表2：各組支氣管肺泡灌洗液中TNF-α含量的變化（±s，pg/ml）

注：1.不同組相同時段比較：與A組比較*P＜0.05；與B組比較#＜0.05；與C組比較◆＜0.05。2.同組內(nèi)不同時段比較：與1d比較◇P＜0.05；與3d比較△P＜0.05。

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表3：各組支氣管肺泡灌洗液中IL-6含量的變化（±s，pg/ml）

表3：各組支氣管肺泡灌洗液中IL-6含量的變化（±s，pg/ml）

注：1.不同組相同時段比較：與A組比較*P＜0.05；與B組比較#＜0.05；與C組比較◆＜0.05。2.同組內(nèi)不同時段比較：與1d比較◇P＜0.05；與3d比較△P＜0.05。

組別n1d3d7d A 6 9.51±1.319.33±3.029.30±2.16 B 6 290.31±12.45*23.72±10.24*41.52±6.63*103.95±31.64*#23.77±21.41*#17.02±15.06*#D 6 154.57±57.34*#◆35.28±10.92*#29.17±17.58*#◆C 6

3 討論

臨床報道顯示[6]，氣管切開患者肺部感染發(fā)生率較高，氣切后氣道開放，病原菌侵入機體，侵入機體的病原菌可釋放毒素，引起巨噬細胞等釋放促炎及抑炎因子，如IL-6、TNF-α等，在嚴(yán)重時促炎因子引起機體組織細胞組織自我損傷，甚至出現(xiàn)全身炎癥反應(yīng)。本實驗結(jié)果氣切大鼠TNF-α及IL-6明顯升高，與上述臨床報道相符[6]。

本實驗通過為時1周的動態(tài)觀察肺組織病理改變及支氣管肺泡灌洗液中TNF-α和IL-6含量變化，結(jié)果顯示ICA組和EPS組大鼠肺部炎癥均有明顯改善。有研究表明ICA可能作用于脂多糖炎癥模型鼠PI3K/Akt 信號通路，抑制NF-kB 活化，減輕外周血中TNF-α、IL-6含量等，減輕急性肺部炎癥[7]。本實驗發(fā)現(xiàn)ICA和EPS兩者均可作用于氣管切開并發(fā)肺部感染模型鼠，降低支氣管肺泡灌洗液中TNF-α、IL-6含量，并隨著用藥時間的延長作用更明顯。提示ICA和EPS均可減輕氣管切開后并發(fā)的肺部感染，ICA效果較佳。

中醫(yī)學(xué)認為，肺主宣發(fā)，衛(wèi)氣達而外邪不入，氣切后則“金破不鳴”，即利器損傷后肺氣損傷難以發(fā)音。肺主行氣，腎主納氣，肺腎陰虛則肺燥而郁熱，陰液不能上承，失于濡潤?！毒霸廊珪?雜證謨》卷二十八記載：“聲由氣而發(fā)，肺病則氣奪，此氣為聲音之戶也。腎藏精，精化氣，陰虛則無氣，此腎為聲音之根也?！币虼酥我搜a益肺腎。淫羊藿乃補腎之要藥，腎氣得以充盈，助肺氣宣發(fā)，因而可以減輕氣切大鼠肺部炎癥。

（通訊作者：潘宇政）

[1]李煉,代建中.淫羊藿善治久咳虛喘[J].中醫(yī)雜志,2000(01):12.

[2]金華良,王利民,羅清莉,厲蓓,杜懿杰,呂玉寶,董競成.淫羊藿對哮喘大鼠氣道高反應(yīng)性的影響[J].中國實驗方劑學(xué)雜志,2014(23):169-173.

[3]朱翠香,彭玲玲,潘宇政等.一次性硬膜外麻醉導(dǎo)管氣管切開插管留置大鼠模型建立[J].中華實驗外科雜志,2015,10(32):2480.

[4]徐叔云主編.藥理實驗方法學(xué)[M].北京:人民衛(wèi)生出版社,2002:1647-1664

[5]Smith K M,Mrozek J D,Simonton S C,et al.Prolonged partial liquid ventilation using conventional and high-frequency ventilatory techniques:gas exchange and lung pathology in an animal model of respiratory distress syndrome[J]. Crit Care Med,1997,25(11):1888-1897.

[6]貴艷玲,蔡萍,程明琨,等.ICU氣管切開患者肺部感染病原菌對血清細胞因子影響的研究[J].中華醫(yī)院感染學(xué)雜志,2016(11):2494-2496.

[7]Xu C Q,Liu B J,Wu J F,et al.Icariin attenuates LPS-induced acute inflammatory responses: involvement of PI3K/Akt and NF-kappaB signaling pathway[J].Eur J Pharmacol,2010,642(1-3):146-153.

國家自然科學(xué)基金（NSFC.81460687）。

鄧淑蓉（1989-），女，碩士研究生，廣西醫(yī)科大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院。

潘宇政(1961-)，男，碩士研究生導(dǎo)師，廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院。