胚蛋給養(yǎng)蛋氨酸對(duì)朗德鵝血液生化指標(biāo)和胸肌發(fā)育的影響

滕戰(zhàn)偉，劉 逍，李德生，徐 晗，周海柱，婁玉杰

（吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，吉林長春 130118）

胚蛋給養(yǎng)蛋氨酸對(duì)朗德鵝血液生化指標(biāo)和胸肌發(fā)育的影響

滕戰(zhàn)偉，劉 逍，李德生，徐 晗，周海柱，婁玉杰*

（吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，吉林長春 130118）

本試驗(yàn)采用胚蛋注射技術(shù)研究孵化后期補(bǔ)充外源性營養(yǎng)物質(zhì)蛋氨酸對(duì)血液生化指標(biāo)和胸肌發(fā)育的影響。選取300枚種蛋隨機(jī)分為2組，每組3個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)50枚種蛋。在孵化第24天進(jìn)行蛋氨酸注射，對(duì)照組不做任何處理，處理組注射1.5 mL 蛋氨酸營養(yǎng)液（Met 5 mg/mL、NaCl 7.5 mg/mL）。出雛后，每個(gè)重復(fù)選取體重均勻和健康的雛鵝20只進(jìn)行飼養(yǎng)試驗(yàn)，飼養(yǎng)28 d。結(jié)果表明：胚蛋給養(yǎng)蛋氨酸顯著提高了朗德鵝的初生重和7 d體重（P＜0.05），處理組顯著提高了0、7 d胸肌重（P＜0.05），有提高0 d胸肌指數(shù)的趨勢（0.05≤P＜0.10），并且顯著提高了0、7 d的肌纖維直徑（P＜0.05）；處理組有提高雛鵝血清中總蛋白含量的趨勢（0.05≤P＜0.10），顯著提高了白蛋白含量并降低了血清尿酸含量（P＜0.05）；處理組顯著提高了Myf5的相對(duì)表達(dá)量并降低了MSTN的相對(duì)表達(dá)量（P＜0.05）。試驗(yàn)結(jié)果顯示，胚蛋給養(yǎng)蛋氨酸可通過調(diào)節(jié)Myf5和MSTN的mRNA相對(duì)表達(dá)量來促進(jìn)胸肌的發(fā)育，促進(jìn)了機(jī)體的生長。

胚蛋給養(yǎng)；鵝；蛋氨酸；胸肌發(fā)育

骨骼肌是機(jī)體蛋白質(zhì)沉積的重要部位，而蛋氨酸能夠參與機(jī)體蛋白質(zhì)的合成，故日糧中的蛋氨酸水平對(duì)骨骼肌的發(fā)育有很大的影響。研究表明，日糧中的蛋氨酸缺乏時(shí)會(huì)抑制骨骼肌蛋白質(zhì)的合成[1]；而適當(dāng)提升日糧中的蛋氨酸水平可以促進(jìn)骨骼肌的生長發(fā)育[2]。蛋氨酸除能夠合成蛋白質(zhì)外還能夠參與調(diào)節(jié)機(jī)體的蛋白質(zhì)代謝。前人研究指出，隨著日糧中蛋氨酸水平的提高，血清中的尿酸含量是降低的，而血清中的總蛋白和白蛋白的含量是升高的[3-4]。胚蛋給養(yǎng)技術(shù)是在孵化后期將外源性的營養(yǎng)物質(zhì)注射到家禽的胚蛋中。研究表明，胚蛋給養(yǎng)可以提高鴨的能量儲(chǔ)備，促進(jìn)其胸肌的發(fā)育[5]。本試驗(yàn)利用胚蛋注射技術(shù)來探索蛋氨酸對(duì)朗德鵝血液生化指標(biāo)和胸肌發(fā)育的影響，為蛋氨酸在鵝生產(chǎn)中的應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料 試驗(yàn)所用種蛋購自吉林省梅河口市德坤禽類食品有限公司，種蛋保存時(shí)間均在7 d以內(nèi)。DL-蛋氨酸購自諾偉司飼料添加劑（上海）有限公司，其純度≥99%。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)與分組 試驗(yàn)采用單因素完全隨機(jī)區(qū)組設(shè)計(jì)。選擇母鵝產(chǎn)蛋史、產(chǎn)次和營養(yǎng)攝入相近的朗德鵝種蛋300枚，依據(jù)種蛋的儲(chǔ)存時(shí)間（7 d內(nèi)）、種蛋重及蛋形指數(shù)將其分為3個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)50枚種蛋。在種蛋孵化期的第24天進(jìn)行胚蛋給養(yǎng)，對(duì)照組不進(jìn)行任何處理，處理組每枚種蛋注射1.5 mL 的蛋氨酸營養(yǎng)液（Met 5 mg/mL、NaCl 7.5 mg/mL）。孵化至出雛后，每個(gè)重復(fù)挑選20只健康且體重?zé)o統(tǒng)計(jì)學(xué)差異的雛鵝進(jìn)行飼養(yǎng)，試驗(yàn)周期為28 d。

1.3 種蛋的孵化 選擇德州科裕孵化設(shè)備有限公司制造的科裕CFZ微電腦全自動(dòng)孵化機(jī)進(jìn)行孵化。根據(jù)鵝的胚胎發(fā)育規(guī)律孵化分為前期（1～14 d）、中期（15～28 d）、后期（29～30 d）3個(gè)階段。孵化期采用全進(jìn)全出制變溫孵化。3個(gè)階段的濕度和溫度各不相同，分別控制在70%和37.8℃、65%和37.5℃以及72%和36.5℃。由于鵝蛋蛋殼相對(duì)較厚，蛋殼的表面積相對(duì)小，孵化后期產(chǎn)熱增加，影響胚蛋內(nèi)羊水和卵黃囊營養(yǎng)吸收，導(dǎo)致胚胎提前出殼或者死胚。所以，從孵化的第18天開始至第24天，每天中午涼蛋1次，第25～28天，每天涼蛋3次。在孵化的29 d將胚蛋轉(zhuǎn)入出雛機(jī)內(nèi)繼續(xù)孵化直至出殼。其他孵化管理按常規(guī)孵化程序進(jìn)行。

1.4 胚蛋給養(yǎng) 胚蛋給養(yǎng)參照Tako等[6]介紹的方法，但進(jìn)行了修改，具體步驟如下：首先通過照蛋，確定注射部位羊膜腔的位置，然后用75%的酒精棉球?qū)︹g端注射部位進(jìn)行消毒，在消毒過的區(qū)域鉆適宜大小的孔，用5 mL注射器垂直進(jìn)針（深度為2 cm左右），將營養(yǎng)液注射到羊膜腔中（1.5 mL/枚），為避免感染，每枚胚蛋用1枚針頭。注射完畢后經(jīng)再次消毒后，用滅菌的石蠟迅速封口，然后按照正常的孵化程序繼續(xù)孵化直至出殼。

表1 基礎(chǔ)日糧組成及營養(yǎng)成分（風(fēng)干基礎(chǔ)）

1.5 飼養(yǎng)管理 參照NRC（1994）推薦的鵝營養(yǎng)需要來配制飼糧[7]（表1），出殼后雛鵝分為3個(gè)重復(fù)進(jìn)行飼養(yǎng)，在出殼后12 h內(nèi)開水、24 h內(nèi)開食，并嚴(yán)格控制飼養(yǎng)環(huán)境條件。雛鵝的飼養(yǎng)管理和免疫按照常規(guī)程序進(jìn)行。

1.6 樣品采集 在出殼當(dāng)天（出殼2 h以內(nèi)，0 d）、第7天（7 d）、28天（28 d）從每組選取6羽（每個(gè)重復(fù)2羽）鵝胚/雛鵝進(jìn)行組織樣品采集。在雛鵝第7、28天頸靜脈取血液樣品5 mL于離心管中，3 000×g離心15 min，將上清液分裝于0.5 mL的EP管中，置于-80℃低溫冰箱中保存待測。試驗(yàn)雛鵝采血完畢，頸部放血致死，將胸肌樣品完整取出，用預(yù)冷的生理鹽水小心沖洗并去除其上附屬的其他組織，然后將左側(cè)胸肌分成3份，迅速放入準(zhǔn)備好的液氮中冷凍，置于-80℃超低溫冰箱中保存用于后續(xù)胸肌發(fā)育相關(guān)基因表達(dá)的測定；將右側(cè)胸肌稱重后置于4%的福爾馬林溶液中，用于肌纖維形態(tài)學(xué)分析。

1.7 測定指標(biāo)與方法

1.7.1 體重及胸肌指數(shù)的測定 于出殼當(dāng)天、7 d、28 d取樣前稱取雛鵝的重量并將分離的胸肌進(jìn)行稱重，根據(jù)記錄的體重和胸肌重計(jì)算胸肌指數(shù)。

1.7.2 血液生化指標(biāo)分析 采用日立7170A型全自動(dòng)生化分析儀對(duì)血清中的葡萄糖、甘油三酯、膽固醇、總蛋白、白蛋白、尿酸、谷丙轉(zhuǎn)氨酶以及谷草轉(zhuǎn)氨酶進(jìn)行分析，試驗(yàn)所用試劑盒均購自于南京建成生物工程研究所。

1.7.3 胸肌纖維直徑的測定 取出福爾馬林溶液中的胸肌樣品，制作成石蠟切片，并進(jìn)行HE染色，用光學(xué)顯微鏡和Toup View視頻成像裝置于10×40倍鏡下進(jìn)行切片觀察，并對(duì)圖像進(jìn)行采集。每圖隨機(jī)選取視野，測量20根肌纖維直徑。

1.7.4 胸肌發(fā)育相關(guān)基因表達(dá)量的測定 本試驗(yàn)中以鵝β-actin作為內(nèi)參，β-actin、Myf5和MSTN基因的引物設(shè)計(jì)參考NCBI基因庫進(jìn)行設(shè)計(jì)，利用Primer 5.0設(shè)計(jì)引物，最終引物序列見表2。

提取肌肉組織的總RNA，用瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA質(zhì)量，用核酸定量儀測定總RNA濃度以及吸光度D260/D280的值，此值在1.8～2.0范圍內(nèi)說明RNA純度較高，適宜進(jìn)行下一步的實(shí)驗(yàn)。應(yīng)用熒光定量PCR技術(shù)測定各基因的表達(dá)量，反應(yīng)體系：dH2O 12.5 μL，上、下游引物以及樣品各1 μL，SYBRR Premix Ex TaqⅡ 9.5 μL，總反應(yīng)體系為25 μL。反應(yīng)條件：預(yù)變性95℃ 30 s,變性95℃ 5 s,

表2 測定基因引物序列

退火60℃ 30 s,延伸95℃ 15 s,60℃ 1 min，95℃ 15 s，35個(gè)循環(huán)。

以β-actin為內(nèi)參基因，采用2-△△Ct法計(jì)算目的基因的相對(duì)表達(dá)量，其中各目的基因在胸肌樣品中的△△Ct值均以該基因在0 d胸肌的△Ct作為對(duì)照。

1.8 統(tǒng)計(jì)分析 試驗(yàn)數(shù)據(jù)經(jīng)Excel 2010進(jìn)行整理歸納后，用SPSS18.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，采用t檢驗(yàn)進(jìn)行差異顯著性檢驗(yàn)，以P＜0.05為顯著性判斷標(biāo)準(zhǔn)，以0.05≤P＜0.10為有趨勢判斷標(biāo)準(zhǔn)。所有數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 胚蛋給養(yǎng)蛋氨酸對(duì)朗德鵝體重和血液生化指標(biāo)的影響 由表3可知，胚蛋給養(yǎng)蛋氨酸顯著提高了朗德鵝的初生重和7日齡的體重（P＜0.05）。由表4可知，處理組有提高7 d血清中總蛋白含量的趨勢（0.05≤P＜0.10），顯著提高了7 d血清中白蛋白含量（P＜0.05），并有提高28 d血清中白蛋白含量的趨勢（0.05≤P＜0.10）。處理組顯著降低了7 d和28 d血清中尿酸含量（P＜0.05）。處理組對(duì)不同時(shí)間點(diǎn)血清中的血糖、甘油三酯、膽固醇、谷丙轉(zhuǎn)氨酸和谷草轉(zhuǎn)氨酶無顯著性影響（P＞0.10）。

2.2 胚蛋給養(yǎng)蛋氨酸對(duì)朗德鵝胸肌發(fā)育的影響 由表5可知，胚蛋給養(yǎng)蛋氨酸顯著提高了0、7 d的胸肌重（P＜0.05），并有提高0 d胸肌指數(shù)的趨勢（0.05≤P＜0.10）。由表6可知，處理組顯著提高了0、7 d朗德鵝胸肌肌纖維直徑（P＜0.05），并有提高28 d胸肌纖維直徑的趨勢（0.05≤P＜0.1）。由圖1和圖2可知，處理組提高了Myf5基因的相對(duì)表達(dá)量并降低了MSTN基因的相對(duì)表達(dá)量（P＜0.05）。

3 討 論

表3 胚蛋給養(yǎng)蛋氨酸對(duì)朗德鵝體重的影響 g

表4 胚蛋給養(yǎng)蛋氨酸對(duì)朗德鵝血液生化指標(biāo)的影響

表5 胚蛋給養(yǎng)蛋氨酸對(duì)朗德鵝胸肌重及其指數(shù)的影響

表6 胚蛋給養(yǎng)蛋氨酸對(duì)朗德鵝胸肌纖維直徑的影響 μm

圖1 胚蛋給養(yǎng)蛋氨酸對(duì)朗德鵝MSTN表達(dá)量的影響

3.1 胚蛋給養(yǎng)蛋氨酸對(duì)朗德鵝體重的影響 家禽與哺乳動(dòng)物不同，其胚胎處于一個(gè)相對(duì)封閉的環(huán)境內(nèi)，孵化期胚胎生長發(fā)育所需的營養(yǎng)物質(zhì)均來自于種蛋。在孵化后期，胚胎的生長發(fā)育較快，由于可吸收利用的營養(yǎng)物質(zhì)有限，其生長發(fā)育不能夠達(dá)到最大化。Isa Coskun等[8]研究表明，胚蛋給養(yǎng)蛋氨酸顯著提高了雞的出殼重。李世召等[9]研究表明，胚蛋給養(yǎng)3 mg維生素C顯著提高了肉仔雞的初生重，并顯著降低了1～42 d的飼料增重比，促進(jìn)了生長。本試驗(yàn)研究表明，胚蛋給養(yǎng)蛋氨酸提高了朗德鵝的初生重，同上述研究結(jié)果一致。

圖2 胚蛋給養(yǎng)蛋氨酸對(duì)朗德鵝Myf5表達(dá)量的影響

3.2 胚蛋給養(yǎng)蛋氨酸對(duì)朗德鵝血清生化指標(biāo)的影響血液生化指標(biāo)反映了機(jī)體的一般營養(yǎng)利用狀態(tài)。家禽上常用血清中尿酸的含量來表示機(jī)體對(duì)氨基酸的利用狀態(tài)。本試驗(yàn)研究表明，胚蛋給養(yǎng)蛋氨酸降低了血清中的尿酸含量，同時(shí)提高了血清中的總蛋白和白蛋白的含量，這表明胚蛋給養(yǎng)蛋氨酸促進(jìn)了機(jī)體對(duì)蛋白的利用。這與李德生[10]在吉林白鵝上的研究相一致。血清中轉(zhuǎn)氨酶活性的高低可用來判斷肝臟是否受到損傷。謝明[11]研究指出，在北京鴨日糧中添加過量的蛋氨酸或者其羥基類似物可以對(duì)肝臟造成損傷。本試驗(yàn)研究表明，胚蛋給養(yǎng)蛋氨酸對(duì)血清中的谷丙及谷草轉(zhuǎn)氨酶的含量無顯著影響。由此可以看出，胚蛋給養(yǎng)蛋氨酸沒有造成朗德鵝肝臟的損傷。

3.3 胚蛋給養(yǎng)蛋氨酸對(duì)朗德鵝胸肌發(fā)育的影響 在胚胎后期由于機(jī)體快速生長，為使胚胎能夠更好地適應(yīng)外界環(huán)境和內(nèi)部生理代謝的變化，家禽的骨骼肌往往會(huì)發(fā)生大量降解，動(dòng)員蛋白質(zhì)產(chǎn)生氨基酸作為糖異生的底物和腸道發(fā)育所需的氨基酸，造成肌纖維萎縮，影響后期的生長發(fā)育。陳偉[5]研究表明，在鴨的胚蛋后期胸肌發(fā)生了動(dòng)員，為機(jī)體的發(fā)育提供能量；但是通過胚蛋給養(yǎng)的方法向鴨胚補(bǔ)充二糖可以緩解機(jī)體能量缺乏的狀態(tài)。本試驗(yàn)研究表明，胚蛋給養(yǎng)蛋氨酸提高了朗德鵝0、7 d的胸肌重，并有提高0 d胸肌指數(shù)的趨勢。李德生[10]研究表明，胚蛋給養(yǎng)二糖和蛋氨酸可以提高吉林白鵝的胸肌纖維直徑，本試驗(yàn)研究結(jié)果與其一致。研究表明，在日糧中添加蛋氨酸可以提高低出生重肉仔雞Myf5 mRNA的相對(duì)表達(dá)量，并降低MSTN基因的甲基化水平及其相對(duì)表達(dá)量，促進(jìn)其胸肌的發(fā)育[12]。本試驗(yàn)研究表明，通過注射蛋氨酸提高了朗德鵝胸肌Myf5 mRNA的相對(duì)表達(dá)量，同時(shí)降低了MSTN mRNA的相對(duì)表達(dá)量。綜上，胚蛋給養(yǎng)蛋氨酸提高了朗德鵝的胸肌重，提高了胸肌纖維直徑，通過調(diào)節(jié)Myf5和MSTN mRNA的相對(duì)表達(dá)量促進(jìn)了胸肌的發(fā)育。

4 結(jié) 論

本試驗(yàn)研究表明，胚蛋給養(yǎng)蛋氨酸提高了朗德鵝0、7 d的體重，提高了血清中總蛋白和白蛋白的含量，降低了血清中的尿酸含量；提高了朗德鵝的胸肌重及其指數(shù)，提高了胸肌肌纖維直徑，提高了Myf5基因的相對(duì)表達(dá)量并降低了MSTN基因的相對(duì)表達(dá)量。

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更正

2017年第1期刊出文章題為：“BMPR1B基因在細(xì)毛羊皮膚毛囊中的表達(dá)及與羊毛性狀的關(guān)系的研究”，作者排名為：王小佳1，賀建寧1，程 明2，劉開東2，劉積鳳1，柳 楠1*，需更正為王小佳1，劉開東2，賀建寧1，程 明2，劉積鳳1，柳 楠1*。

S835.5

A

10.19556/j.0258-7033.2017-04-093

2016-08-10；

2016-09-01

國家自然科學(xué)基金（31372331）

滕戰(zhàn)偉（1988-），男，河南鄢陵人，碩士研究生，動(dòng)物營養(yǎng)與飼料科學(xué)專業(yè)，E-mail: tengwei416@126.com

* 通訊作者：婁玉杰，教授，博士生導(dǎo)師，E-mail: lyjjlau@163. com