LC-MS測(cè)定火腿腸中4種硝基呋喃類代謝物殘留

白亞敏，毛慶，秦劍，肖陳，沈銳

（1.重慶市食品藥品檢驗(yàn)所，重慶市藥物過(guò)程與質(zhì)量控制工程技術(shù)研究中心，重慶401121；2.黔江縣藥品檢驗(yàn)所，重慶409000；3.永川市藥品檢驗(yàn)所，重慶402160）

LC-MS測(cè)定火腿腸中4種硝基呋喃類代謝物殘留

白亞敏1，毛慶1，秦劍1，肖陳2，沈銳3

（1.重慶市食品藥品檢驗(yàn)所，重慶市藥物過(guò)程與質(zhì)量控制工程技術(shù)研究中心，重慶401121；2.黔江縣藥品檢驗(yàn)所，重慶409000；3.永川市藥品檢驗(yàn)所，重慶402160）

建立同時(shí)測(cè)定火腿腸中4種硝基呋喃類藥物代謝物殘留量的液相色譜-質(zhì)譜方法?；鹜饶c樣品均質(zhì)后，用0.2mol/L鹽酸水解，經(jīng)鄰硝基苯甲醛衍生后過(guò)固相萃取小柱凈化，收集洗脫液用氮?dú)獯蹈啥ㄈ莺?，采用多反?yīng)監(jiān)測(cè)模式進(jìn)行檢測(cè)，同位素內(nèi)標(biāo)法定量。添加濃度為0.498 ng/mL～5.070ng/mL時(shí)，4種硝基呋喃類藥物代謝物的回收率為76.7%～109.6%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為3.0%～8.9%。該方法靈敏度高，檢出限低，準(zhǔn)確性好，可用于火腿腸中硝基呋喃類藥物代謝物殘留量的測(cè)定。

硝基呋喃類；液相色譜-質(zhì)譜法；固相萃??；火腿腸；同位素內(nèi)標(biāo)

硝基呋喃是一類人工合成的廣譜抗菌藥，最常見(jiàn)的包括呋喃它酮、呋喃西林、呋喃妥因和呋喃唑酮，其對(duì)應(yīng)的代謝物分別是：5-嗎啉甲基-3-氨基-2-噁唑烷基酮（AMOZ）、氨基脲（SEM）、1-氨基-2-內(nèi)酰脲（AHD）和3-氨基-2-噁唑烷基酮（AOZ）。硝基呋喃類藥物具有非常好的抗菌作用，曾廣泛用于畜禽和水產(chǎn)品的養(yǎng)殖過(guò)程。已有研究表明，硝基呋喃類藥物對(duì)人體具有潛在的致癌性，可能導(dǎo)致基因變異且具有遺傳毒性[1-2]。歐盟和美國(guó)分別在1995年和2002年全面禁止將硝基呋喃類藥物用于食源性動(dòng)物。2008年我國(guó)也將全部硝基呋喃類藥物列入違法添加的非食用物質(zhì)名單。火腿腸的主要原料為畜禽肉和魚肉，其產(chǎn)品標(biāo)準(zhǔn)中并未將硝基呋喃類獸藥殘留列入必檢項(xiàng)目，所以少量不法商家將硝基呋喃類獸藥殘留量不合格的畜禽肉和魚肉用作火腿腸的生產(chǎn)，使人民群眾的健康安全受到威脅。目前檢測(cè)火腿腸中硝基呋喃類代謝物殘留量的文獻(xiàn)尚未見(jiàn)報(bào)道，因此，建立此方法對(duì)于保障人民群眾的食品安全具有重要意義。硝基呋喃類藥物在動(dòng)物體內(nèi)代謝迅速，所以待測(cè)組織中通常不太可能檢出硝基呋喃原藥殘留，但其代謝產(chǎn)物因和蛋白質(zhì)結(jié)合而相當(dāng)穩(wěn)定，故利用對(duì)代謝產(chǎn)物的檢測(cè)通?？梢苑从吵鱿趸秽愃幬锏臍埩魻顩r[3-4]。本文擬采用液相色譜-質(zhì)譜法檢測(cè)火腿腸中硝基呋喃類代謝物殘留量。鄰硝基苯甲醛作為衍生化試劑與在酸性條件下水解游離出來(lái)硝基呋喃類代謝物的自由氨基反應(yīng)，從而可以增大待測(cè)物的分子量，提高質(zhì)譜檢測(cè)靈敏度。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

乙腈（色譜純）：Burdick＆Jackson公司；甲酸（色譜純）：成都市科龍化工試劑廠；乙酸銨（分析純）：重慶川東化工有限公司；乙酸乙酯（分析純）：重慶川東化工有限公司；正己烷（分析純）：成都科龍化工試劑廠；AMOZ（含量99.8%）：Sigma公司；SEM（含量99.5%）：Dr.Ehrenstorfer GmbH公司；AHD（含量99.0%）：Dr. Ehrenstorfer GmbH公司；AOZ（含量98%）：Toronto公司；同位素內(nèi)標(biāo)物D5-AMOZ：Dr.Ehrenstorfer GmbH公司；13C15N-SEM、13C3-AHD、D4-AOZ：均為WITEGA公司；鄰硝基苯甲醛（含量＞99%）：TGI公司；OASISHLB固相萃取柱：美國(guó)Waters公司。

液相色譜-質(zhì)譜儀UPLC-TQD：美國(guó)Waters公司；漩渦混合器：海門市其林貝爾公司；恒溫水浴振蕩器（SHA-C型）：金壇市華峰儀器公司；臺(tái)式高速離心機(jī)：TD16-WS型長(zhǎng)沙湘儀公司。

1.2 色譜條件和質(zhì)譜條件

色譜柱：Waters Acquity UPLC BEH C18（2.1mm× 50mm，1.7μm），流動(dòng)相A相為乙腈（含0.1%甲酸），B相為10mmol/L乙酸銨水溶液（含0.1%甲酸），梯度洗脫程序?yàn)椋?0%A 0min～0.5min；10%～50%A 0.5min～1.5 min；50%A 1.5min～2.4min；50%～90%A 2.4min～2.5min；90%A 2.5min～4.4min；90%～10%A 4.4min～4.5min；10%A 4.5min～6min，流速0.3mL/min，柱溫40℃，進(jìn)樣體積5μL，毛細(xì)管電壓3.5 kV，離子源溫度120℃，脫溶劑氣溫度400℃，脫溶劑氣流速12 L/min，錐孔氣流速0.2 L/min，碰撞氣為氬氣，離子源ESI+，MRM模式檢測(cè)見(jiàn)表1。

1.3 樣品的處理

稱取2.0 g均質(zhì)后的火腿腸樣品置離心管，用甲醇-水混合溶液（1∶1）洗滌（10mL×2）后，加入50 ng/mL混合內(nèi)標(biāo)溶液0.2 mL、0.2 mol/L鹽酸溶液20 mL及0.1mol/L鄰硝基苯甲醛衍生化試劑0.3mL，渦旋振蕩1min，置37℃恒溫振蕩水浴中避光反應(yīng)16 h。上述衍生溶液放置至室溫后，加入0.1mol/L磷酸氫二鉀溶液5mL，用1mol/L氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH為7.4～7.8，6 000 r/min離心10min。上清液用正己烷脫脂（5mL× 2）后以2mL/min的流速通過(guò)OasisHLB固相萃取柱（已分別用10mL甲醇和10mL水活化），用10mL水洗滌抽干，最后用10mL乙酸乙酯洗脫，收集洗脫液40氮?dú)獯抵两?，以甲?水溶液（1∶1）定容至1mL，過(guò)0.22μm微孔濾膜。

表1 衍生后的4種硝基呋喃代謝物和相應(yīng)內(nèi)標(biāo)物的質(zhì)譜參數(shù)Table1 MS parameters of four nitrofuran metabolites

1.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備

分別取適量20ng/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液加入50ng/mL的混合內(nèi)標(biāo)溶液0.2mL，按上述1.3樣品的處理方法衍生凈化后用甲醇-水溶液（1∶1）定容為0.5、1、2、5、10、20 ng/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)使用溶液，其中4種內(nèi)標(biāo)物的濃度均為10 ng/mL。

2 結(jié)果與討論

2.1 色譜條件的選擇

4種硝基呋喃類藥物代謝物的極性和結(jié)構(gòu)非常類似，因此液相色譜中采用梯度洗脫的方式來(lái)改善4種物質(zhì)的分離度。此外，待測(cè)物都是弱堿性化合物，適用于正離子監(jiān)測(cè)模式，故在流動(dòng)相中添加了乙酸銨和甲酸作為離子化助劑，以提高離子化效率，增強(qiáng)質(zhì)譜的靈敏度。

2.2 樣品前處理?xiàng)l件的選擇

火腿腸的輔助原料包括淀粉、食鹽、香辛料、防腐劑以及護(hù)色劑等。其中的食鹽和亞硝酸鈉等強(qiáng)電解質(zhì)會(huì)抑制樣品中的待測(cè)物質(zhì)離子化，降低質(zhì)譜的靈敏度，因此先將樣品用甲醇-水的混合溶液洗滌兩次以除去其中水溶性的強(qiáng)電解質(zhì)。此外，火腿腸中的脂肪也會(huì)影響待測(cè)物質(zhì)離子化過(guò)程，且容易堵塞固相萃取小柱，因此用正己烷脫脂兩次。固相萃取小柱可以凈化火腿腸樣品并減少雜質(zhì)干擾。

2.3 靈敏度的差異

呋喃妥因的代謝物經(jīng)衍生后質(zhì)譜的靈敏度與其他3種化合物的靈敏度差別較大，僅從分子結(jié)構(gòu)上分析，4種化合物均含有2～3個(gè)氨基，離子化程度及靈敏度應(yīng)該相似，而且對(duì)照品溶液的濃度和處理過(guò)程相同，故推斷是其衍生化效率不同而導(dǎo)致質(zhì)譜靈敏度的差異。

2.4 線性范圍、回歸方程和檢出限

在最佳分析條件下，以4種硝基呋喃代謝物的衍生物的定量離子對(duì)的峰面積與對(duì)應(yīng)內(nèi)標(biāo)峰面積之比對(duì)濃度作圖，即得標(biāo)準(zhǔn)曲線方程，取標(biāo)準(zhǔn)曲線的最低濃度分別稀釋2、5、10倍進(jìn)樣，按S/N=3∶1計(jì)算檢出限見(jiàn)表2。

表2 線性范圍、回歸方程和檢測(cè)限Table2 Linear analysis and limited of detection of four nitrofuran metabolites

2.5 回收率

均質(zhì)后的火腿腸樣品，添加不同濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液對(duì)樣品處理后進(jìn)行回收率和精密度實(shí)驗(yàn)，測(cè)定4種硝基呋喃代謝物的衍生物的回收率為76.7%～109.6%，RSD為3.0%～8.9%見(jiàn)表3。

2.6 樣品測(cè)定

抽取市場(chǎng)上4個(gè)品牌14批火腿腸樣品進(jìn)行檢測(cè)，其中5批檢出1～2種硝基呋喃類藥物代謝物，含量為0.072μg/kg～3.856μg/kg，其余9批未檢出上述4種硝基呋喃類藥物代謝物。

3 結(jié)論

本文建立了以LC-MS方法檢測(cè)火腿腸中的硝基呋喃代謝物的殘留量的最佳檢測(cè)條件。由于采用硝基呋喃類代謝物的同位素內(nèi)標(biāo)法進(jìn)行定量分析，提高了檢測(cè)的穩(wěn)定性和定性定量分析的準(zhǔn)確性；固相萃取法提取火腿腸中的硝基呋喃代謝物回收率高、重現(xiàn)性好，完全可以滿足實(shí)際檢測(cè)需要。

表3 方法回收率及精密度（n=6）Table3 Recovery of four nitrofuran metabolites

[1]吳永寧,邵兵,沈建忠．獸藥殘留檢測(cè)與監(jiān)控技術(shù)[M]．北京:化學(xué)工業(yè)出版社,2007:461-474

[2]Leitner A,Zollner P,Lindner W．Determination of the metabolites of nitrofuran antibiotics in animal tissue by high-performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry[J]．Chromatogr A,2001, 939:49-53

[3]孫濤,胡開(kāi)峰,喬昆云,等．超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定水產(chǎn)品中硝基呋喃代謝物殘留[J]．分析儀器,2010(5):27-31

[4]徐英江,任傳博,田秀慧,等．海產(chǎn)品中硝基呋喃類原藥的超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜測(cè)定[J]．分析測(cè)試學(xué)報(bào),2010,29(4):327-330

Determination of Metabolites of Nitrofuran Antibiotics in Sausage by LC-MS

BAI Ya-min1，MAO Qing1，QIN Jian1，XIAO Chen2，SHEN Rui3
（1.Chongqing Institute for Food and Drug Control，Chongqing 401121，China；2.Qianjiang Institute for Drug Control，Chongqing409000，China；3.Yongchuan Institute for Drug Control，Chongqing402160，China）

A method was established to determine metabolites of nitrofuran antibiotics in sausage.Homogenized samples were hydrolyzed with 0.2 mol/L hydrochloric acid，and then derivatized by 2-nitrobenzaldehyde. Analytes were cleaned by solid phase extraction（SPE）and reconstituted after dried under nitrogen.LC-MS detection was performed using multiple reaction monitoring module.The quantification was obtained utilizing the homologous internal standards.Recoveries of metabolites of nitrofuran antibiotics were from 76.7%to 109.6%at fortified levels of 0.498 ng/mL-5.070 ng/mL.The RSDs of the method were3.0%-8.9%.The established method is sensitive，accurate and suitable for the determination of nitrofuran metabolites in sausage.

Nitrofuran；liquid chromatography/mass spectrometry（LC-MS）；solid phase extraction；sausage；homologous internal standard

10.3969/j.issn.1005-6521.2014.010.026

2013-01-05

重慶市科技攻關(guān)計(jì)劃項(xiàng)目(cstc2012ggB10001)

白亞敏（1977—），女（漢），工程師，研究生，主要從事食品藥品檢驗(yàn)與研究工作。