木質(zhì)纖維物質(zhì)中纖維素和半纖維素含量的測定

張文博++賀建龍++蔣浩++熊鵬

摘要：以稻草秸稈為樣品，通過美國國家可再生能源實(shí)驗(yàn)室（NREL）方法水解得到液體成分，采用苔黑酚比色法和蒽酮比色法測定其五碳糖（5C）和六碳糖（6C）的含量。結(jié)果表明，液體成分中5C和6C達(dá)到一定濃度比例時(shí)，會互相干擾測定的準(zhǔn)確度。對已有測定纖維素、半纖維素含量的方法進(jìn)行綜合應(yīng)用并加以改進(jìn)，分析測定液體中5C和6C在不同波長下互不干擾的最大濃度和可測范圍。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在620 nm波長下準(zhǔn)確測定水解液中6C含量時(shí)，要同時(shí)滿足[5C]<0.070 9 g/L和[5C]/[6C]<16；在660 nm波長下準(zhǔn)確測定液體中5C含量時(shí)，要同時(shí)滿足[6C]<0.023 3 g/L 和[6C]/[5C]<24。在可測范圍內(nèi)，可以通過稀釋法達(dá)到測定要求，此法適用于混合液中5C和6C含量的測定，與高效液相色譜（HPLC）法進(jìn)行對比，測定結(jié)果相對誤差的絕對值小于統(tǒng)計(jì)學(xué)上規(guī)定的5%，表明該法適用于木質(zhì)纖維物質(zhì)中纖維素和半纖維素含量快速、準(zhǔn)確的測定。

關(guān)鍵詞：美國國家可再生能源實(shí)驗(yàn)室（NREL）；纖維素；半纖維素；稻草秸稈；定量分析

中圖分類號： TK61文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

文章編號：1002-1302（2017）05-0281-03

木質(zhì)纖維素的主要成分是纖維素、半纖維素和木質(zhì)素，3種組分含量的多少及變化是木質(zhì)纖維素原料綜合利用的重要依據(jù)，因此，準(zhǔn)確測定木質(zhì)纖維素中纖維素、半纖維素及木質(zhì)素的含量十分必要[1]。目前常用72%濃硫酸法[2]測定木質(zhì)素含量，硫酸與重鉻酸鉀氧化法[3]、硝酸乙醇法[4]、差重法[5]等測定纖維素含量，堿液提取法[6]、2 mol/L鹽酸水解法[7]等測定半纖維素含量，它們的主要缺點(diǎn)是操作復(fù)雜、耗時(shí)長且無法進(jìn)行批量測樣。其中用2 mol/L鹽酸水解半纖維素時(shí)，難以控制水解程度，此法僅適用于對比性研究，應(yīng)用領(lǐng)域受到局限[7]。美國國家可再生能源實(shí)驗(yàn)室（NREL）方法[8]是用72%濃硫酸和4%稀硫酸2步水解樣品，得到濾液，然后用高效液相色譜（HPLC）法測定濾液中的單糖含量，雖然HPLC法測定結(jié)果較準(zhǔn)確，但是單位時(shí)間所測樣品有限，測定速度相對較慢，不適合批量測定。HPLC色譜柱一般采用的基質(zhì)相對脆弱且價(jià)格昂貴，批量測樣會很快損壞色譜柱。為了降低成本，方便、快速地測定木質(zhì)纖維物質(zhì)中纖維素和半纖維素的含量，以稻草秸稈為樣品，先用NREL法處理樣品得到濾液，然后分別用苔黑酚比色法[7]和蒽酮比色法[9]測定濾液中五碳糖（5C）和六碳糖（6C）的含量。在試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，測定濾液中5C和6C含量時(shí)會出現(xiàn)相互干擾現(xiàn)象，從而影響了測定結(jié)果的準(zhǔn)確性。因此本研究考察了濾液中5C和6C在不同波長下互不干擾測定結(jié)果的最大濃度和可測范圍，并與HPLC法[8]的測定結(jié)果進(jìn)行對比驗(yàn)證。

1材料與方法

1.1儀器、試劑與材料

9FZ-42型系列農(nóng)作物秸稈粉碎機(jī)；UV752紫外-可見分光光度計(jì)（上海佑科儀器儀表有限公司）；XFH-50CA電熱式壓力蒸汽滅菌鍋（浙江新豐醫(yī)療器械有限公司）；SHB-3循環(huán)水多用真空泵（鄭州杜甫儀器廠）；HH-4數(shù)顯恒溫水浴鍋（金壇市鴻科儀器廠）；分析天平（上海越平科學(xué)儀器有限公司）。

72% H2SO4溶液[9]：665 mL濃H2SO4（汕頭化工有限公司，分析純）加入300 mL蒸餾水中，冷卻至20 ℃，補(bǔ)加蒸餾水至1 000 mL。苔黑酚試劑[7]：A試劑，0.1 g FeCl3（天津市巴斯夫化工有限公司，分析純）溶于100 mL 37%濃HCl（上海振企化學(xué)試劑有限公司，分析純）中；B試劑，6 g苔黑酚（國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，分析純）溶于100 mL無水乙醇（天津基準(zhǔn)化學(xué)試劑有限公司）中，現(xiàn)用現(xiàn)配。蒽酮試劑[10]：0.2 g 蒽酮（國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，分析純）溶于 100 mL 濃H2SO4（汕頭化工有限公司，分析純）中，現(xiàn)用現(xiàn)配。葡萄糖（天津市大茂化學(xué)試劑廠，分析純）；D-木糖（國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，分析純）；所采用的其他試劑按常規(guī)法配制。稻草秸稈：產(chǎn)自江蘇省淮安市，原料粉碎至1～2 cm，80 ℃烘干備用。

1.2測定方法

本試驗(yàn)擬定的系統(tǒng)定量分析程序是將NREL法與苔黑酚比色法和蒽酮比色法的綜合應(yīng)用并加以改進(jìn)。以粉碎干燥后的稻草秸稈作為樣品，用72%濃H2SO4和4%稀H2SO4 2步水解樣品，樣品中的纖維素、半纖維素被水解成單糖，然后分別采用苔黑酚比色法和蒽酮比色法進(jìn)行定量，操作流程如圖1所示[1，10]。

1.3不同波長下吸收曲線的繪制

[CM（24]用蒽酮定糖法測定葡萄糖和木糖在不同波長下的吸光

[FL（2K2]度：取3支洗凈烘干的20 mL具塞刻度試管，其中1支為空白，配制0.05 g/L葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液和0.1 g/L木糖標(biāo)準(zhǔn)溶液，分別取1 mL標(biāo)準(zhǔn)溶液于另2支試管中，1 mL蒸餾水于空白試管中，再分別加入2 mL蒽酮試劑，混勻，100 ℃下煮沸 5 min，自來水冷卻至室溫，用10 mm玻璃比色皿，分別于 520～700 nm（波長間隔10 nm）波長下測定吸光度，繪制葡萄糖和木糖標(biāo)準(zhǔn)溶液在520～700 nm波長下的吸收曲線。

用苔黑酚比色定糖法測定葡萄糖和木糖在不同波長下的吸光度：取3支洗凈烘干的20 mL具塞刻度試管，其中1支為空白，配制0.02 g/L木糖標(biāo)準(zhǔn)溶液和0.10 g/L葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液，分別取1 mL標(biāo)準(zhǔn)溶液于另2支試管中，1 mL蒸餾水于空白試管中，再分別加入2.000 mL A試劑和0.134 mL B試劑，混勻，100 ℃下煮沸20 min，自來水冷卻至室溫，用10 mm玻璃比色皿，于580～760 nm（波長間隔10 nm）波長下測定吸光度，繪制木糖和葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液在580～760 nm波長下的吸收曲線。

2結(jié)果與分析

2.1混合液中5C和6C之間相互干擾的分析

用本試驗(yàn)方法測定純凈單糖時(shí)，結(jié)果準(zhǔn)確，但實(shí)際上所接觸到的往往是某些糖的混合溶液，例如預(yù)處理稻草秸稈后得到的預(yù)處理液和固體水解液。用本試驗(yàn)方法處理稻草秸稈得到的濾液就是一種同時(shí)存在5C和6C的混合溶液。由圖2和圖3可知，不同濃度的葡萄糖和木糖標(biāo)準(zhǔn)溶液在同一波長下用同一種方法測定時(shí)，都會呈現(xiàn)不同的吸光度，也就是說當(dāng)測定濾液中某一單糖的吸光度時(shí)，另一種單糖也會有吸光度。因?yàn)槲舛染哂屑雍托?，所?種糖之間必然會存在某種程度的干擾。若濾液中一種單糖的濃度減小，那么所測吸光度也會相應(yīng)減小，當(dāng)該糖該濃度下的吸光度減小到可以忽略不計(jì)而又不影響另一種單糖正常測定時(shí)，便可以消除干擾。

2.2測定6C含量時(shí)，5C的最大干擾濃度和可測范圍

配制不同濃度梯度的木糖標(biāo)準(zhǔn)溶液，用蒽酮比色法測定木糖的吸光度，采用5點(diǎn)法作圖。因?yàn)?C與蒽酮反應(yīng)生成的有色物質(zhì)在可見光區(qū)吸收峰為620 nm，所以以620 nm波長為中心，繪制580～650 nm波長下的木糖標(biāo)準(zhǔn)曲線。

選取所用紫外-可見分光光度計(jì)讀數(shù)的最小可信值為 0.05，那么6C的吸光度≥0.05時(shí)，視為可信的吸光度，根據(jù)620 nm波長下葡萄糖的標(biāo)準(zhǔn)曲線（y=13.090x-0.006，r2=0999 9，y： 吸光度；x：濃度，g/L） 可以得到吸光度為0.05時(shí)

6C的濃度為0.004 3 g/L，此濃度即為6C的最小可測濃度。同理，5C的吸光度<0.05時(shí)，不會影響6C的吸光度，根據(jù)不同波長下木糖的標(biāo)準(zhǔn)曲線可以得到吸光度為0.05時(shí)5C的濃度，只有混合液中5C小于此濃度時(shí)，才不會干擾6C的測定結(jié)果，此時(shí)的5C濃度即為不干擾6C測定的最大濃度。因此，測定6C含量時(shí)，5C的濃度要小于最大干擾濃度，6C的濃度要大于最小可測濃度（0.004 3 g/L），即5C與6C濃度的比值會恒小于某個(gè)數(shù)。由5C和6C濃度的比值可以得到不同波長下的可測范圍。

2.3測定5C含量時(shí)，6C的最大干擾濃度和可測范圍

配制不同濃度梯度的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液，用苔黑酚比色法測定葡萄糖的吸光度，采用5點(diǎn)法作圖。因?yàn)樘诜颖壬y定木糖在660 nm波長下有最大吸光度，所以以 660 nm 波長為中心，繪制620～690 nm波長下的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線。

選取所用紫外-可見分光光度計(jì)讀數(shù)的最小可信值為 0.05，5C的吸光度≥0.05時(shí)，視為可信的吸光度，根據(jù) 660 nm 波長下木糖的標(biāo)準(zhǔn)曲線（y=62.870x-0.012，r2=0.999 9，y：吸光度；x：濃度，g/L）可以得到吸光度為0.05時(shí)5C的濃度為0.986 mg/L，此濃度即為5C的最小可測濃度。同理，6C的吸光度<0.05時(shí)，不會影響5C的吸光度，根據(jù)不同波長下葡萄糖的標(biāo)準(zhǔn)曲線可以得出吸光度為0.05時(shí)6C的濃度，只有混合液中的6C小于此濃度時(shí)，才不會干擾5C的測定結(jié)果，此時(shí)6C的濃度即為不干擾5C測定的最大濃度。因此，測定5C含量時(shí)，6C的濃度要小于最大干擾濃度，5C的濃度要大于最小可測濃度（0.986 mg/L），即6C與5C濃度的比值會恒小于某個(gè)數(shù)。由5C和6C濃度的比值可以得到不同波長下的可測范圍（

3結(jié)論與討論

本試驗(yàn)所采用的方法操作簡便，成本低，測定結(jié)果準(zhǔn)確，可以進(jìn)行多個(gè)試樣的分析，在具有一般化學(xué)分析條件的實(shí)驗(yàn)室內(nèi)都可以使用。用本法準(zhǔn)確測定混合液中6C含量時(shí)，需要同時(shí)滿足[5C]<0.070 9 g/L和[5C]/[6C]<16；準(zhǔn)確測定5C含量時(shí)，需要同時(shí)滿足[6C]<0.023 3 g/L和 [6C]/[5C]<24。在測定混合液中5C和6C含量時(shí)，可以通過稀釋的方法控制濃度大小，通過標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算得到的糖濃度符合表1和表2所列的互相不干擾范圍，即認(rèn)為測定結(jié)果準(zhǔn)確。用本法測定稻草秸稈中纖維素含量38.74%、半纖維素含量21.84%，與HPLC法測定結(jié)果一致。此方法對測定木質(zhì)纖維素原料中纖維素和半纖維素的含量提供了幫助，也為進(jìn)一步利用木質(zhì)纖維素這一寶貴的資源提供了資料。

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