3株真菌固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)木質(zhì)素降解酶的研究

錢(qián)靜亞++張正沛+季蓉蓉+馬真+陳菊++李佳少++張志才+葛才林

摘要：對(duì)菌株JS-1008、米曲霉CGMCC5992、黃孢原毛平革菌CICC40719等3株真菌固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)木質(zhì)素降解酶、纖維素酶、半纖維素酶進(jìn)行了研究。結(jié)果表明，3株菌株中，米曲霉發(fā)酵產(chǎn)木質(zhì)素降解酶活性最高，木質(zhì)素過(guò)氧化物酶和錳過(guò)氧化物酶活性可達(dá)2.08、1.79 U/g DS，產(chǎn)纖維素酶、半纖維素酶活性則相對(duì)較低，分別為1.69、4.19 U/g DS，木質(zhì)素降解率為7.23%；菌株JS-1008產(chǎn)木質(zhì)素降解酶、纖維素酶、半纖維素酶的活性均較低，木質(zhì)素降解率最低；黃孢原毛平革菌產(chǎn)木質(zhì)素降解酶的水平最低，木質(zhì)素過(guò)氧化物酶、錳過(guò)氧化物酶的活性分別為0.40、0.51 U/g DS，但產(chǎn)纖維素酶、半纖維素酶的活性最高，分別達(dá)到2.54、10.86 U/g DS，木質(zhì)素降解率達(dá)11.7%。

關(guān)鍵詞：菌株JS-1008；米曲霉；黃孢原毛平革菌；木質(zhì)素過(guò)氧化物酶；錳過(guò)氧化物酶

中圖分類(lèi)號(hào)： S182文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

文章編號(hào)：1002-1302（2017）05-0277-04

木質(zhì)素是自然界中除纖維素外的第2大聚合物，由苯丙烷單元通過(guò)醚鍵、碳碳鍵連接形成聚酚類(lèi)三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，由于其復(fù)雜、穩(wěn)定、多樣的無(wú)定形三維體型而成為農(nóng)作物秸稈中比纖維素更難降解的成分，導(dǎo)致秸稈營(yíng)養(yǎng)價(jià)值、利用率低[1]。要徹底降解纖維素，關(guān)鍵在于降解包裹在纖維素晶體外面的木質(zhì)素以及半纖維素。因此，秸稈利用研究從過(guò)去的降解纖維素的研究轉(zhuǎn)向了木質(zhì)素降解研究[2]。

木質(zhì)素降解過(guò)程中的關(guān)聯(lián)酶系主要有3類(lèi)：H2O2產(chǎn)生酶系（如葡萄糖氧化酶、乙二醛氧化酶等）、木質(zhì)素氧化酶系（木質(zhì)素過(guò)氧化物酶、錳過(guò)氧化物酶、漆酶等）、其他酶系（甲基化酶、纖維二糖脫氫酶等）[3]。在木質(zhì)素氧化酶系中，研究較多的酶主要有木質(zhì)素過(guò)氧化物酶、錳過(guò)氧化物酶、漆酶[4]。木質(zhì)素過(guò)氧化物酶是降解木質(zhì)素酶系的主要成分，在木質(zhì)素降解中起關(guān)鍵作用[5]。錳過(guò)氧化物酶在Mn2+、H2O2存在時(shí)，能氧化分解芳香環(huán)多聚體，被認(rèn)為是木質(zhì)素降解的關(guān)鍵酶之一[6]。

自然界中產(chǎn)生降解木質(zhì)素降解酶的微生物有真菌、放線(xiàn)菌、細(xì)菌等，其中可徹底將木質(zhì)素降解為CO2、H2O的是白腐真菌，如黃孢原毛平革菌（Phanerochaete chrysosporium）[7]、紅色毛癬菌（Trichophyton rubrum）[8]、栓菌屬（Trametes）[9]、側(cè)耳屬（Pleurotus）[10]、糖單孢菌屬（Saccharomonospora）[11]、不動(dòng)細(xì)菌屬菌株B-2（Acinetobacter sp. B-2.）、Pandoraea sp.B-6、纖孔菌屬菌株（Inonotus sp.）[12]等。但是白腐真菌在人工培養(yǎng)條件下產(chǎn)生的木質(zhì)素降解酶活性較低，造成木質(zhì)素酶生產(chǎn)成本較高，因此有必要探索木質(zhì)素降解酶活性高的真菌。

筆者前期從污泥中分離得到了菌株JS-1008和米曲霉CGMCC5992，但未對(duì)其降解木質(zhì)素進(jìn)行系統(tǒng)研究。本研究比較菌株JS-1008、米曲霉CGMCC5992、黃孢原毛平革菌產(chǎn)木質(zhì)素降解酶、纖維素酶、半纖維素酶的能力，試圖找到1株產(chǎn)高活性木質(zhì)素降解酶活性的菌株，以期為降低木質(zhì)素酶的生產(chǎn)成本，實(shí)現(xiàn)其工業(yè)化生產(chǎn)應(yīng)用奠定基礎(chǔ)，也為真菌降解秸稈木質(zhì)纖維素并用于秸稈的資源化利用提供依據(jù)。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1菌種

JS-1008，分離自江蘇大學(xué)玉帶河污泥樣品中，初步鑒定為匍枝根霉。米曲霉，分離自江蘇大學(xué)玉帶河污泥樣品中，現(xiàn)保存于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保存編號(hào)為CGMCC5992。黃孢原毛平革菌CICC40719，購(gòu)自中國(guó)工業(yè)微生物菌種保藏中心。

1.1.2培養(yǎng)基

玉米芯粉固體發(fā)酵培養(yǎng)基：稱(chēng)取一定量玉米芯粉和水，按照質(zhì)量比1 ∶[KG-*3]3混合，分裝在直徑15 cm、無(wú)熱力學(xué)應(yīng)變性的塑料盤(pán)中，每盤(pán)60 g，并在121 ℃滅菌1 h。[HJ]

1.2方法

1.2.1玉米秸稈、玉米芯預(yù)處理

將同一批次、產(chǎn)地、采收季節(jié)的玉米秸稈、玉米芯，用小型藥物粉碎機(jī)粉碎成粉末，并將粉末過(guò)100目篩，密封于塑料保鮮袋中，于背光、干燥處儲(chǔ)藏備用。

1.2.2固態(tài)發(fā)酵

在無(wú)菌條件下，將試管斜面中的菌種接種到已滅菌的含15 g麥麩、20 mL水的250 mL三角瓶中，28 ℃培養(yǎng)4～7 d后轉(zhuǎn)接到玉米芯粉的發(fā)酵培養(yǎng)基中，每盤(pán)接種 6 g，混勻后28 ℃培養(yǎng)30 d。為在發(fā)酵過(guò)程中能保持培養(yǎng)基濕度，所有塑料盤(pán)均用保鮮膜密封。

1.2.3粗酶液制備

發(fā)酵結(jié)束后，稱(chēng)取5 g固態(tài)發(fā)酵基質(zhì)于250 mL三角瓶中，加入100 mL蒸餾水，28 ℃、150 r/min振蕩提取1 h，-4 ℃冷凍離心后獲得的上清液即為粗酶液，置于1.5 mL的離心管中-18 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.4.3纖維素酶活性的測(cè)定

采用測(cè)定羧甲基纖維素酶活性（CMC）的方法測(cè)定纖維素酶活性。

葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的制作：稱(chēng)取1 g于105 ℃烘至恒質(zhì)量的葡萄糖，加水定容至1 L，得1 g/L的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液。分別移取上述標(biāo)準(zhǔn)溶液0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2 mL，加水補(bǔ)至2 mL，加入2 mL DNS試劑，加塞后在沸水浴中加熱 10 min，冷卻后定容至15 mL，用分光光度計(jì)測(cè)550 nm波長(zhǎng)下的吸光度，以濃度-吸光度繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。

測(cè)定步驟：取0.5 mL粗酶液，再分別吸取1.5 mL CMC溶液，50 ℃水浴保溫30 min；對(duì)照樣用0.5 mL稀釋酶液，加入1.5 mL醋酸緩沖液，50 ℃水浴30 min，再吸取DNS試劑 2 mL，搖勻后具塞，沸水浴反應(yīng)10 min，冷卻后補(bǔ)加水至 15 mL，振蕩混勻，用對(duì)照調(diào)零點(diǎn)，于550 nm下測(cè)吸光度[16]。1 min內(nèi)由底物生成1 μmol葡萄糖所需的酶量定義為1個(gè)酶活性單位（U）。纖維素酶（CMC）活性計(jì)算方法如下：

[JZ（]CMC酶活性=[SX（]葡萄糖質(zhì)量×2×1 00060[SX）]（U/g）。[JZ）][JY]（3）

1.2.4.4半纖維素（木聚糖酶）酶活性的測(cè)定

木糖標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的制作：稱(chēng)取1 g于105 ℃烘至恒質(zhì)量的木糖，加水定容至1 L，得1 g/L木糖標(biāo)準(zhǔn)溶液。分別移取上述標(biāo)準(zhǔn)溶液0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2 mL，加水補(bǔ)至2 mL，加入2 mL DNS試劑，加塞后在沸水浴中加熱10 min，冷卻后補(bǔ)水定容至 15 mL，用分光光度計(jì)在550 nm波長(zhǎng)下測(cè)吸光度，以濃度-吸光度繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。

測(cè)定步驟：取粗酶液0.5 mL，再吸取1%木聚糖溶液 1.5 mL，搖勻，50 ℃水浴1 h，取出后，再吸取2 mL DNS試劑搖勻，加塞立即沸水浴反應(yīng)10 min，冷卻后補(bǔ)加水定容到 15 mL，輕輕上下?lián)u勻，對(duì)照用0.5 mL稀釋酶液加1.5 mL醋酸緩沖液，不加木聚糖溶液。按上述步驟，用對(duì)照調(diào)零點(diǎn)，于550 nm下測(cè)吸光度[17]。1 min內(nèi)水解木聚糖生成相當(dāng)于 1 μmol 木糖等還原物質(zhì)的量為1個(gè)酶活性單位，以U/g表示。半纖維素（木聚糖酶）酶活性計(jì)算方法如下：

[HS2][JZ（]半纖維素酶活性=[SX（]木糖質(zhì)量×2×1 00050[SX）]（U/g）。[JZ）][JY]（4）

1.2.5木質(zhì)素降解率的測(cè)定

稱(chēng)取一定量（G）樣品（過(guò)40目篩）置于圓底燒瓶中，加入2 mol/L鹽酸100 mL，5～10 min內(nèi)煮沸，并持續(xù)保持微沸60 min。趁熱用已知質(zhì)量的玻璃坩堝抽濾，并用沸水反復(fù)沖洗玻璃坩堝及殘?jiān)翞V液呈中性。用少量丙酮沖洗殘?jiān)脸橄碌谋撼薀o(wú)色，并抽凈丙酮。將玻璃坩堝置于105 ℃烘箱中烘2 h后，在干燥器中冷卻 30 min 稱(chēng)質(zhì)量G1，直至恒質(zhì)量。將酸性洗滌纖維加入72%硫酸，在20 ℃消化3 h后過(guò)濾，并沖洗至中性。將殘?jiān)娓煞Q(chēng)質(zhì)量（G2），并灼燒灰化稱(chēng)質(zhì)量（G3），G3與G2的差值即為木質(zhì)素含量。木質(zhì)素降解率計(jì)算方法如下：

[HT9.，6"][JP2]木質(zhì)素降解率=[SX（]未發(fā)酵秸稈中木質(zhì)素含量-發(fā)酵后秸稈中木質(zhì)素含量未發(fā)酵秸稈中木質(zhì)素含量[SX）]×100%。[HT][JY]（5）[JP]

2結(jié)果與分析

[HTK]2.13株菌株產(chǎn)木質(zhì)素降解酶、纖維素酶、半纖維素酶的比較[HT]

2.1.1葡萄糖和木糖標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)如圖1所示，葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)方程為y=0.953 7x-0.090 3，r2為0.999 2；如圖2所示，木糖標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)為y=1.026x-0.022 5，r2為0.999 0。說(shuō)明其適合用于葡萄糖、木糖含量的測(cè)定。

2.1.23株菌株產(chǎn)木質(zhì)素過(guò)氧化物酶的分析

如圖3所示，米曲霉在固態(tài)培養(yǎng)18 d時(shí)木質(zhì)素過(guò)氧化物酶活性達(dá)到最大值，為1.79 U/g DS。JS-1008菌株產(chǎn)酶活性較低，在培養(yǎng) 9 d 時(shí)酶活性達(dá)到最大值，為0.39 U/g DS。黃孢原毛平革菌培養(yǎng)15 d時(shí)產(chǎn)酶活性最大， 為0.40 U/g DS。米曲霉產(chǎn)木質(zhì)

素過(guò)氧化物酶能力高于菌株JS-1008、黃孢原毛平革菌，但是米曲霉產(chǎn)酶活性出現(xiàn)最大值的時(shí)間較JS-1008菌株、黃孢原毛平革菌明顯滯后，這可能是因?yàn)槟举|(zhì)素降解酶是次生代謝產(chǎn)物，米曲霉菌在生長(zhǎng)后期限氮的條件下利于酶的產(chǎn)生，生長(zhǎng)前期米曲霉菌體利用培養(yǎng)基中的氮等營(yíng)養(yǎng)成分進(jìn)行細(xì)胞快速生長(zhǎng)，后期氮源消耗到一定程度才進(jìn)入產(chǎn)酶期。而該培養(yǎng)基對(duì)于JS-1008菌株、黃孢原毛平革菌沒(méi)有產(chǎn)生限制作用，產(chǎn)酶時(shí)期提前。

2.1.33株菌株產(chǎn)錳過(guò)氧化物酶的分析

如圖4所示，米曲霉能產(chǎn)生較高的錳過(guò)氧化物酶活性，在發(fā)酵12 d時(shí)酶活性最高，為2.27 U/g DS，而菌株JS-1008、黃孢原毛平革菌產(chǎn)錳過(guò)氧化物酶活性相對(duì)較低，最高僅分別為0.52、0.51 U/g DS。JS-1008菌株不能促進(jìn)產(chǎn)酶的原因可能是匍枝根霉能分泌大量淀粉酶，這種酶降解秸稈中的淀粉后產(chǎn)生部分β-環(huán)糊精，有研究表明β-環(huán)糊精對(duì)錳過(guò)氧化物酶的產(chǎn)生有一定抑制作用[18]，此外淀粉酶會(huì)降解淀粉，產(chǎn)生大量葡萄糖，造成碳源過(guò)剩抑制菌體生長(zhǎng)，從而也抑制了錳過(guò)氧化物酶的分泌。

2.1.43株菌株產(chǎn)纖維素酶的分析

纖維素酶是使纖維素

降解生成葡萄糖的酶的總稱(chēng)，主要有葡聚糖內(nèi)切酶、葡聚糖外切酶、β-葡萄糖苷酶，這3種酶協(xié)同作用可將天然纖維素降解為葡萄糖。如圖5所示，在發(fā)酵20 d時(shí)，黃孢原毛平革菌、米曲霉產(chǎn)纖維素酶活性都達(dá)到最大值，分別為2.54、1.69 U/g DS，JS-1008菌株在發(fā)酵8 d時(shí)酶活性最高，為218 U/g DS。黃孢原毛平革菌在發(fā)酵6 d時(shí)酶活性迅速上升，12～20 d時(shí)酶活性趨于穩(wěn)定。米曲霉在發(fā)酵12 d后到達(dá)酶活性迅速增長(zhǎng)期，16～20 d是酶的穩(wěn)定生產(chǎn)期，但酶活性并不高，是3株菌株中產(chǎn)酶活最低且產(chǎn)酶時(shí)間最遲的菌株，這種現(xiàn)象可能是由于米曲霉能產(chǎn)生葡聚糖內(nèi)切酶、外切酶，但產(chǎn)生β-葡萄糖苷酶能力弱，使纖維二糖積累造成產(chǎn)物抑制。JS-1008 菌株的產(chǎn)酶能力較米曲霉強(qiáng)，且產(chǎn)酶時(shí)間明顯提前，但酶活性達(dá)到最高后很快降低，并沒(méi)有出現(xiàn)產(chǎn)酶的穩(wěn)定期。

2.1.53株菌株產(chǎn)半纖維素酶（木聚糖酶）的分析

微生物產(chǎn)生的半纖維素酶主要是指β-D-l，4-木聚糖酶、β-木糖苷酶，β-D-1，4-木聚糖酶的主要水解產(chǎn)物為木二糖及其以上的低木聚糖，β-木糖苷酶可以作用于低聚木糖的末端，釋放木糖。如圖6所示，與米曲霉、菌株JS-1008相比，黃孢原毛平革菌產(chǎn)半纖維素酶的酶活性最高，在固態(tài)發(fā)酵16 d產(chǎn)生高達(dá)10.86 U/g DS的木聚糖酶活性。菌株JS-1008在發(fā)酵8 d時(shí)即達(dá)到酶活性最大值，為5.64 U/g DS，但菌株 JS-1008 無(wú)產(chǎn)酶的穩(wěn)定期；米曲霉酶活性最低，12～20 d是產(chǎn)酶較為穩(wěn)定的時(shí)期，但酶活性最高時(shí)也僅為4.42 U/g DS。木聚糖酶是一種誘導(dǎo)酶，需要將秸稈中的淀粉降解為小分子物質(zhì)后才能誘導(dǎo)菌株產(chǎn)生，3株菌株產(chǎn)木聚糖酶的趨勢(shì)與產(chǎn)纖維素酶的趨勢(shì)大致相同。

2.23株菌株降解木質(zhì)素的比較

[CM（24]如圖7所示，米曲霉木質(zhì)素降解率達(dá) 7.23%；菌株

JS-1008 木質(zhì)素降解率僅為4.14%；而黃孢原毛平革菌對(duì)木質(zhì)素的降解率最高，達(dá)到11.00%。米曲霉能產(chǎn)生活性較高的與降解木質(zhì)素有關(guān)的酶，因此降解率較高；而黃孢原毛平革菌能產(chǎn)生高活性的纖維素酶、半纖維素酶，破壞木質(zhì)素與半纖維素之間緊密結(jié)合的化學(xué)鍵，使木質(zhì)素游離被降解，所以木質(zhì)素降解率最高，雖然黃孢原毛平革菌分泌錳過(guò)氧化物酶和木質(zhì)素過(guò)氧化物酶的酶活性不高，但能分泌葡萄糖氧化酶和乙二醇氧化酶等產(chǎn)H2O2的酶，這可能也是造成黃孢原毛平革菌降解率最高的原因。

3結(jié)論

米曲霉CGMCC5992產(chǎn)木質(zhì)素過(guò)氧化物酶、錳過(guò)氧化物酶等與降解木質(zhì)素有關(guān)的酶的活性最高，但產(chǎn)纖維素酶、半纖維素酶的能力較弱，對(duì)木質(zhì)素的降解率為7.17%，可認(rèn)為米曲霉是產(chǎn)酶專(zhuān)一性較強(qiáng)的菌株，具有用于生產(chǎn)木質(zhì)素降解酶的潛力，也可考慮與產(chǎn)纖維素酶、半纖維素酶活性高的菌株進(jìn)行混菌發(fā)酵，降解秸稈木質(zhì)素和纖維素。

菌株JS-1008雖然具有一定的降解木質(zhì)素的能力，但與黃孢原毛平革菌、米曲霉CGMCC5992相比，產(chǎn)降解木質(zhì)素相關(guān)的酶及纖維素酶、半纖維素酶的活性較低，且降解木質(zhì)素的能力較差，對(duì)菌株JS-1008的應(yīng)用范圍需要進(jìn)一步研究。

黃孢原毛平革菌產(chǎn)木質(zhì)素過(guò)氧化物酶、錳過(guò)氧化物酶的水平低于米曲霉，但產(chǎn)纖維素酶、半纖維素酶的活性最高，且木質(zhì)素降解率也最高。因此，黃孢原毛平革菌常被廣泛應(yīng)用于纖維素和木質(zhì)素材料的降解中。

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