毛桃葉片愈傷組織誘導

譚彬+郭水歡+韓亞萍+鄭先波++葉霞?├羆潭?+馮建燦

摘要：分別以毛桃組培苗和胚培苗葉片為外植體，探討了不同植物生長調(diào)節(jié)劑質(zhì)量濃度組合對毛桃葉片愈傷組織誘導過程中愈傷組織形成率和愈傷組織相對生長量的影響，并對不同處理誘導產(chǎn)生的愈傷組織進行評價。結(jié)果表明適合毛桃組培苗葉片愈傷組織再生的最適培養(yǎng)基為MS+1.2 mg/L 2，4-D+1.0 mg/L 6-BA+ 0.5 mg/L AgNO3，其愈傷組織形成率和愈傷組織相對生長量分別為88.09%和3；適合毛桃胚培苗葉片愈傷組織再生的最適培養(yǎng)基為 MS+1.0 mg/L TDZ+1.5 mg/L NAA+0.5 mg/L AgNO3，其愈傷組織形成率和愈傷組織相對生長量分別為69.77%和4。2種來源葉片外植體最適培養(yǎng)基中誘導產(chǎn)生的愈傷組織其愈傷組織形成率和愈傷組織相對生長量雖有差異，但所產(chǎn)生的愈傷組織均為黃綠色，緊實有突起，具備良好的再生能力。

關鍵詞：毛桃（Prunus persica）；葉片；愈傷組織；誘導；再生

中圖分類號： S662.104+.3文獻標志碼： A

文章編號：1002-1302（2017）05-0037-03

我國是世界第一產(chǎn)桃大國，但桃砧木的利用還處在比較原始的狀態(tài)，生產(chǎn)上一般都是直接采用野生桃種子（如毛桃、山桃、甘肅桃等）或生產(chǎn)品種（如青州蜜桃）的種子做砧木[1]。其中野生毛桃（Prunus persica）是我國應用最為廣泛的桃樹砧木，其根系發(fā)達、生長健壯，與栽培品種嫁接親和性好[2]，抗根結(jié)線蟲能力較強，而抗真菌、耐旱性一般[3-4]。與常規(guī)桃育種相比，砧木育種周期更長，更加費時費力[1]?，F(xiàn)代生物技術，尤其是組織培養(yǎng)和轉(zhuǎn)基因技術的出現(xiàn)，為通過基因工程方法提高毛桃抗性、提高育種效率提供了可能。

高效穩(wěn)定再生體系是開展桃遺傳轉(zhuǎn)化工作的基礎，由于缺乏穩(wěn)定、高效的再生體系，桃基因工程、功能基因鑒定等方面研究與應用受到嚴重制約?；蛐?、外植體類型和狀態(tài)、基本培養(yǎng)基、植物生長調(diào)節(jié)劑、碳源、培養(yǎng)條件等均對桃離體再生有影響。劉航空等以早熟油桃華光和曙光為試材，對影響早熟油桃葉片產(chǎn)生胚性愈傷的多個因素進行研究，結(jié)果表明外源激素對誘導桃葉片產(chǎn)生胚性愈傷組織影響顯著[5]。齊賢等以黃水蜜桃為對象，研究了不同植物生長調(diào)節(jié)劑對其胚培苗莖段愈傷組織形成率的影響，結(jié)果表明添加2.0 mg/L 6-BA 和0.5 mg/L NAA的MS培養(yǎng)基為最適培養(yǎng)基，其愈傷組織形成率為85%[6]。目前國內(nèi)外關于桃砧木組織培養(yǎng)方面的研究較少，研究對象多為GF677和 Nemaguard[7-8]；所用外植體主要為莖尖、子葉[9-11]等，而葉片[8，12]報道較少?；诖?，本研究分別以桃砧木類型毛桃組培苗和胚培苗葉片為外植體，探討不同植物生長調(diào)節(jié)劑質(zhì)量濃度組合對愈傷組織誘導的影響，為高效穩(wěn)定再生體系建立和遺傳轉(zhuǎn)化奠定基礎。

1材料與方法

1.1材料

試驗材料毛桃幼嫩枝條和自交果實分別于2015年4月和8月采自河南農(nóng)業(yè)大學三區(qū)桃資源圃。

1.2方法

1.2.1無菌組培苗的獲得

毛桃幼嫩枝條在晴天10：00左右，取田間新梢裝入潔凈塑料袋帶回室內(nèi)，去掉葉片并保留部分葉柄；用洗衣粉漂洗20 min，經(jīng)流水沖洗2 h。然后在無菌條件下，剪取帶有腋芽的莖段（1.5～2.0 cm），用70%乙醇浸泡30 s，用無菌水沖洗2～3遍，再用0.1%的HgCl2處理 6 min，再用無菌水沖洗2～3遍，接種于初代培養(yǎng)基，培養(yǎng)2周后統(tǒng)計萌芽率；培養(yǎng)4周后將萌發(fā)的芽切下后繼代培養(yǎng)，以獲得的無菌組培苗葉片為外植體進行后續(xù)試驗。初代培養(yǎng)所用培養(yǎng)基為MS+6-BA 1.0 mg/L+IBA 0.1 mg/L+GA3 0.5 mg/L+AgNO3 0.5 mg/L培養(yǎng)基，繼代培養(yǎng)是在原培養(yǎng)基中再添加200 mg/L頭孢霉素、蔗糖30 g/L、瓊脂6.8 g/L，PH值5.7，培養(yǎng)條件為溫度（26±2） ℃，相對濕度60%～70%，光照度為1 500～2 000 lx，每日光照14 h（下同）。

1.2.2胚培苗的獲得

毛桃胚培苗的獲得參照齊賢等的方法[6]略作修改。具體操作步驟如下：將采摘的毛桃果實去除果肉，沖洗干凈后將桃核用5%（體積分數(shù)）的次氯酸鈉消毒20 min，用錘子砸開桃核取出核仁，在超凈工作臺上用70%酒精浸泡核仁30 s，用無菌水沖洗2～3遍，然后用0.1%（質(zhì)量濃度）的HgCl2消毒5 min，用無菌水沖洗5次，將滅菌的核仁接種在WPM培養(yǎng)基上，放進4 ℃培養(yǎng)箱內(nèi)暗培養(yǎng)45 d后轉(zhuǎn)入光照培養(yǎng)室培養(yǎng)。光照培養(yǎng)14 d和28 d后分別調(diào)查萌芽率和成苗率，并以獲得的胚培苗葉片為外植體進行后續(xù)試驗。

1.2.3毛桃愈傷組織的誘導

葉片外植體分別取自組培苗和胚培苗，選取生長良好、完全展開的幼嫩葉片，垂直主脈橫切2～3刀，不傷及葉緣，將近軸面向上平鋪于培養(yǎng)基上。不同處理所用基本培養(yǎng)基為MS+0.5 mg/L AgNO3，不同處理培養(yǎng)基中添加植物生長調(diào)節(jié)劑種類及濃度如表1所示。每處理接種30個外植體，重復3次。接種后進行暗培養(yǎng)，暗培養(yǎng)4周后轉(zhuǎn)入光培養(yǎng)，光培養(yǎng)1周后分別調(diào)查不同處理愈傷組織形成率和愈傷組織相對生長量，并記錄愈傷組織生長狀態(tài)。暗培養(yǎng)溫度為（26±2） ℃，相對濕度 60%～70%。

2結(jié)果與分析

[HTK]2.1不同植物生長調(diào)節(jié)劑對毛桃組培苗葉片愈傷組織誘導的影響[HT]

將帶有腋芽的毛桃莖段經(jīng)消毒處理后接種至培養(yǎng)基（圖1-A），培養(yǎng)1周后腋芽開始萌發(fā)（圖1-B），培養(yǎng)2周后統(tǒng)計萌芽率為69.02%，繼續(xù)培養(yǎng)2周后將萌發(fā)的腋芽切下轉(zhuǎn)移至新鮮培養(yǎng)基進行伸長培養(yǎng)，培養(yǎng)4周后獲得生長旺盛的無菌組培苗（圖1-C）。將獲得的無菌組培苗葉片分別接種至添加不同種類和濃度植物生長調(diào)節(jié)劑的培養(yǎng)基中，暗培養(yǎng)1周后，部分葉片葉柄處和切口開始產(chǎn)生愈傷組織，隨著暗培養(yǎng)的時間的延長，產(chǎn)生愈傷組織的葉片數(shù)明顯增多，暗培養(yǎng)4周后轉(zhuǎn)入光下培養(yǎng)1周，5個處理大部分葉片切口處均產(chǎn)生愈傷組織（圖1-D至圖1-H）。此時觀察不同處理愈傷組織顏色和生長狀態(tài)（圖1-D至圖1-H，表2），其中處理1誘導產(chǎn)生的愈傷組織為淺綠色，松散，輕微褐化，有光澤（圖1-D）；處理2誘導產(chǎn)生的愈傷組織為白色，較松散，成海綿狀（圖1-E）；處理3誘導產(chǎn)生的愈傷組織為黃綠色，緊實有突起，表面光滑（圖1-F）；處理4誘導產(chǎn)生的愈傷組織黃綠色，且有白色，松散，成海綿狀，褐化（圖1-G）；處理5誘導產(chǎn)生的愈傷組織為綠色，有突起，輕微褐化

不同植物生長調(diào)節(jié)劑種類和濃度對毛桃組培苗葉片愈傷組織形成率和愈傷組織相對生長量的影響如表2所示。MS培養(yǎng)基中添加1.2 mg/L 2，4-D和1.0 mg/L 6-BA組合（處理3）的愈傷組織形成率最高，為88.09%；當2，4-D濃度一定時，1.0 mg/L 6-BA組合（處理3）的愈傷組織形成率明顯高于1.0 mg/L TDZ組合（處理1）和1.0 mg/L KT組合（處理2），而愈傷組織相對生長量則相反；當TDZ濃度一定時，TDZ與2，4-D組合（處理1）的愈傷組織形成率和愈傷組織相對生長量高于TDZ與NAA組合（處理4）；培養(yǎng)基中沒有添加TDZ和2，4-D時，一定濃度6-BA和IBA組合（處理5）的愈傷組織形成率和愈傷組織相對生長量最低，分別為6714%和1。綜合分析可知，適合毛桃組培苗葉片愈傷組織誘導的最適培養(yǎng)基為MS+0.5 mg/L AgNO3+1.2 mg/L 2，4-D+1.0 mg/L 6-BA（處理3）。

[HTK]2.2不同植物生長調(diào)節(jié)劑對毛桃胚培苗葉片愈傷組織誘導的影響[HT]

將滅菌的毛桃核仁接種在WPM培養(yǎng)基上（圖2-A），4 ℃ 培養(yǎng)箱內(nèi)暗培養(yǎng)45 d后轉(zhuǎn)入光照培養(yǎng)室培養(yǎng)，培養(yǎng)14 d和28 d后分別調(diào)查萌芽率和成苗率，均為95%。從生長健壯的胚培苗（圖2-B）上取葉片接種到愈傷組織誘導培養(yǎng)基上，暗培養(yǎng)1周后，部分葉片葉柄處和切口開始產(chǎn)生愈傷組織，隨著暗培養(yǎng)的進行產(chǎn)生愈傷組織的葉片數(shù)明顯增多，暗培養(yǎng)4周后轉(zhuǎn)入光下培養(yǎng)1周，發(fā)現(xiàn)5個處理大部分葉片切口處均產(chǎn)生愈傷組織（圖2-C至圖2-G），但不同處理產(chǎn)生的愈傷組織顏色和狀態(tài)存在一定差異（圖2 C-G，表3）。其中處理1誘導產(chǎn)生的愈傷組織為黃綠色，略帶白色，松散（圖2-C）；處理2誘導產(chǎn)生的愈傷組織為黃色，松散，成海綿狀（圖2-D）；處理3誘導產(chǎn)生的愈傷組織為黃白色，松散，輕微褐化（圖2-E）；處理4誘導產(chǎn)生的愈傷組織黃綠色，緊實有突起（圖2-F）；處理5誘導產(chǎn)生的愈傷組織為黃白色，有突起（圖2-G）。此外，不同處理中愈傷組織主要產(chǎn)生的部位也有差異（圖2-C至圖2-G）， 除處理5誘導產(chǎn)生的愈傷組織主要

植物生長調(diào)節(jié)劑種類和濃度對毛桃胚培苗葉片愈傷組織形成率和愈傷組織相對生長量的影響如表3所示。當 1.2 mg/L 2，4-D和1.0 mg/L KT（處理2）共同使用時，愈傷組織形成率最高，為80.68%，但此處理產(chǎn)生的愈傷組織松散、成海綿狀，此種狀態(tài)愈傷組織不具備再生能力；而當培養(yǎng)基中沒有添加TDZ和2，4-D時，一定濃度6-BA和IBA組合（處理5）的愈傷組織形成率最低（66.02%），這一結(jié)果與毛桃組培苗葉片誘導產(chǎn)生愈傷組織結(jié)果一致（67.14%，最低），但該處理誘導產(chǎn)生的愈傷組織沒有發(fā)生褐化；當2，4-D濃度一定時，1.0 mg/L 6-BA組合（處理3）的愈傷組織形成率低于1.0 mg/L TDZ組合（處理1）和1.0 mg/L KT組合（處理2）；當TDZ濃度一定時，TDZ和2，4-D組合（處理1）的愈傷組織形成率與TDZ和NAA組合差異不顯著（處理4），此結(jié)果與毛桃組培苗葉片誘導產(chǎn)生愈傷組織結(jié)果相反，但處理4的愈傷組織相對生長量高于處理3，且處理4產(chǎn)生的愈傷組織為黃綠色，緊實有突起，此種狀態(tài)的愈傷組織具備良好的再生能力。綜合愈傷組織顏色和狀態(tài)、愈傷組織形成率和愈傷組織相對生長量可知，適合毛桃組培苗葉片愈傷組織誘導的最適培養(yǎng)基為MS+0.5 mg/L AgNO3+1.0 mg/L TDZ+1.5 mg/L NAA（處理4）。

3結(jié)論與討論

外源植物生長調(diào)節(jié)劑對桃葉片的愈傷組織誘導影響顯著，其中TDZ和BA被認為是誘導效果比較好的細胞分裂素，而生長素常用的有2，4-D和NAA。叢芳等以桃栽培品種曙光、金童5號和甜桃王試管苗[JP2]葉片為外植體，研究了植物生長調(diào)節(jié)劑種類及濃度對葉片再生的影響，結(jié)果表明3種基因型試管苗葉片在LP+0.4 mg/L

TDZ培養(yǎng)基中生長較好，且愈傷組織形成率均最高，分別達到72.2%、78.8%和71.3%[13]；張永慶等以奉化玉露桃不同外植體進行離體培養(yǎng)試驗，其中以幼葉為外植體得到的愈傷組織誘導率為70%，且得到的愈傷組織為深綠色，硬實，粉狀，多次繼代培養(yǎng)后發(fā)褐衰老[14]；而本研究中以毛桃組培苗葉片為外植體研究不同植物生長調(diào)節(jié)物質(zhì)對愈傷組織誘導的影響，結(jié)果表明愈傷組織誘導的最適培養(yǎng)基為 MS+0.5 mg/L AgNO3+1.2 mg/L 2，4-D+1.0 mg/L 6-BA，愈傷組織形成率為88.09%，明顯高于叢芳等的研究結(jié)果[11-12]，且誘導產(chǎn)生的愈傷組織為黃綠色，緊實有突起，表面光滑。

此外，同一基因型相同外植體因其來源不同其愈傷組織形成率、愈傷組織相對生長量及愈傷組織狀態(tài)均有差異?，F(xiàn)有關于桃葉片離體培養(yǎng)的報道中所用葉片主要取自田間枝條消毒處理后培養(yǎng)獲得的無菌苗[8，12，15]，而用胚培苗葉片的尚未見報道。本研究分別以毛桃組培苗和胚培苗葉片為外植體進行愈傷組織誘導，2種來源葉片在不同培養(yǎng)基中均成功誘導產(chǎn)生愈傷組織，不同處理中愈傷組織形成率最高分別可達88.09%和88.68%；但結(jié)合愈傷組織形成率、愈傷組織相對生長量及愈傷組織狀態(tài)綜合分析發(fā)現(xiàn)，2種來源的葉片愈傷組織誘導的最適培養(yǎng)基卻不相同，其中組培苗葉片誘導愈傷組織的最適培養(yǎng)基中添加的是2，4-D和 6-BA，而胚培苗葉片誘導愈傷組織的最適培養(yǎng)基中添加的是TDZ和NAA，這種差異的產(chǎn)生可能與2種來源葉片本身的生理狀態(tài)有關。

桃樹通過愈傷組織和體細胞再生系統(tǒng)途徑再生的研究進展相當緩慢，而植物遺傳轉(zhuǎn)化的眾多研究已經(jīng)證明通過愈傷組織再生系統(tǒng)轉(zhuǎn)化率較高，因此，建立一個高效且適宜于桃遺傳轉(zhuǎn)化的通過愈傷組織或胚狀體再生途徑的再生系統(tǒng)已成為開展轉(zhuǎn)基因工作的關鍵環(huán)節(jié)[16]。本研究初步獲得了大量生長狀態(tài)良好、穩(wěn)定一致的毛桃愈傷組織，為后續(xù)通過愈傷組織途徑建立再生體系和通過基因工程方法進行毛桃種質(zhì)的改良奠定基礎。

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