轉(zhuǎn)基因成分的檢測(cè)方法綜述

阮先樂(lè)+張杰

摘要：隨著轉(zhuǎn)基因生物在全世界的廣泛應(yīng)用，轉(zhuǎn)基因成分檢測(cè)技術(shù)越來(lái)越受到廣大消費(fèi)者、各國(guó)政府及相關(guān)機(jī)構(gòu)人員的重視。本文從聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）檢測(cè)技術(shù)、環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增檢測(cè)技術(shù)、近紅外光譜檢測(cè)技術(shù)、生物傳感器檢測(cè)技術(shù)、生物芯片檢測(cè)技術(shù)和蛋白質(zhì)檢測(cè)技術(shù)等方面進(jìn)行綜述，并提出今后轉(zhuǎn)基因成分檢測(cè)技術(shù)的發(fā)展趨勢(shì)和研究方向。

關(guān)鍵詞：轉(zhuǎn)基因；成分；檢測(cè)方法

中圖分類號(hào)： Q785文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

文章編號(hào)：1002-1302（2017）05-0012-03

達(dá)及轉(zhuǎn)基因生物對(duì)環(huán)境、食用安全性的影響，從而建立一套高效的技術(shù)研究體系；另一方面，轉(zhuǎn)基因生物安全管理部門也有必要建立一套轉(zhuǎn)基因成分檢測(cè)技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)，使各項(xiàng)工作得以順利實(shí)施。2002年歐盟要求對(duì)轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品從生產(chǎn)、運(yùn)輸、保存、銷售等過(guò)程進(jìn)行全程的跟蹤和檢測(cè)[1]?，F(xiàn)在已有65個(gè)國(guó)家和地區(qū)對(duì)轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品采取強(qiáng)制性的標(biāo)志管理制度，但也有一些國(guó)家和地區(qū)采取自愿標(biāo)志模式[2]。2014年5月27日，我國(guó)農(nóng)業(yè)部發(fā)布《農(nóng)業(yè)部關(guān)于進(jìn)一步加強(qiáng)農(nóng)業(yè)轉(zhuǎn)基因生物安全監(jiān)管工作的通知》，要求各級(jí)農(nóng)業(yè)部門，要以水稻、玉米、大豆和油菜種子為重點(diǎn)，依法嚴(yán)厲查處非法生產(chǎn)、加工、銷售轉(zhuǎn)基因種子的行為。2015年10月1日起施行的《中華人民共和國(guó)食品安全法》第六十九條明確要求生產(chǎn)經(jīng)營(yíng)轉(zhuǎn)基因食品應(yīng)當(dāng)按照規(guī)定顯著標(biāo)志。

1轉(zhuǎn)基因成分檢測(cè)技術(shù)

1.1PCR檢測(cè)技術(shù)

PCR檢測(cè)技術(shù)是一種靈敏度高、技術(shù)較成熟的轉(zhuǎn)基因成分檢測(cè)方法。根據(jù)特異性的不同可把它分為篩查法、目的基因特異性、構(gòu)造特異性和事件特異性4種方法[3]。檢測(cè)的主要基因包括調(diào)控基因、標(biāo)記基因和目的基因，其中調(diào)控基因包括啟動(dòng)子和終止子。常用的啟動(dòng)子是花椰菜花葉病毒CaMV 35S，終止子是脂肪堿合成酶NOS，標(biāo)記基因有Barr（抗草丁膦基因）、Kmr（抗卡那霉素基因）、Neor（抗新霉素基因）、Hygr（抗潮霉素基因）[4]。目前，PCR檢測(cè)技術(shù)已經(jīng)成功地應(yīng)用在玉米、大豆、水稻和小麥的轉(zhuǎn)基因成分檢測(cè)上[5-8]。

轉(zhuǎn)入多個(gè)目標(biāo)基因，需要用多重PCR技術(shù)進(jìn)行檢測(cè)，這種技術(shù)不但能提高檢測(cè)效率，而且能夠有效地防止假陽(yáng)性。魏霜等研究表明，以水稻內(nèi)源基因SPS、外源抗蟲(chóng)基因CrylAb、外源抗蟲(chóng)基因CrylAb/Ac、外源抗蟲(chóng)基因Btc、報(bào)告基因GUS、NOS終止子和CaMV 35S啟動(dòng)子為檢測(cè)對(duì)象，建立的7重PCR體系能有效地檢測(cè)出水稻中的轉(zhuǎn)基因成分，檢測(cè)過(guò)程比較簡(jiǎn)便，特異性比較好[9]。利用此項(xiàng)技術(shù)，在煙葉、甘蔗、大豆、玉米、柑橘和棉花上都成功地檢測(cè)到轉(zhuǎn)基因成分[10-15]。

目前，許多國(guó)家和地區(qū)對(duì)轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品規(guī)定了最低閾值，如歐盟和俄羅斯為0.9%，日本和中國(guó)臺(tái)灣為5.0%，韓國(guó)為30%[16]。為此，須要采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)保證轉(zhuǎn)基因成分的定量檢測(cè)。沈元?jiǎng)碌扔脤?shí)時(shí)熒光定量PCR研究棉花黃萎病菌，檢測(cè)靈敏度為100 copies/μL[17]。仇有文等采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)檢測(cè)耐除草劑轉(zhuǎn)基因大豆 A5547-12，結(jié)果表明定量PCR檢測(cè)方法的LOD和LOQ分別是1、10 copies/μL[18]。王盛等采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)檢測(cè)轉(zhuǎn)基因煙草中外源綠色熒光蛋白基因（GFP）的拷貝數(shù)，在檢測(cè)的5株轉(zhuǎn)基因煙草中，GFP基因的拷貝數(shù)分別為5、8、19、28、45個(gè)，非轉(zhuǎn)基因煙草植株的GFP基因拷貝數(shù)為0[19]。

1.2環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增檢測(cè)技術(shù)

2000年Notomi等發(fā)明了一種新的DNA擴(kuò)增方法，即DNA環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)（loop mediated isothermal amplification，簡(jiǎn)稱LAMP）[20]。這種技術(shù)對(duì)目的基因6個(gè)不同區(qū)域分別設(shè)計(jì)了4種不同的特異性引物，利用鏈置換DNA聚合酶在恒溫條件下反應(yīng)，從而完成核酸的擴(kuò)增。邵碧英等研究表明，建立的LAMP檢測(cè)方法能穩(wěn)定、特異地檢測(cè)轉(zhuǎn)基因大豆 A2704-12品系，檢測(cè)限達(dá)到了0.1%[21]。閆興華等對(duì)玉米LY038中cordapA基因建立的LAMP擴(kuò)增技術(shù)靈敏度高、特異性好、穩(wěn)定性較高[22]。陳金松等用LAMP法針對(duì)玉米表達(dá)載體的花椰菜花葉病毒CaMV 35S進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果表明，這種方法特異性高、用時(shí)少、成本較低，為檢測(cè)轉(zhuǎn)基因玉米提供了一種更加簡(jiǎn)便快速的方法[23]。王永等建立的轉(zhuǎn)基因水稻中crylAc基因的LAMP檢測(cè)法比傳統(tǒng)的PCR檢測(cè)方法最低定性檢測(cè)限高10倍，它非常適合抗蟲(chóng)轉(zhuǎn)基因水稻的快速檢測(cè)[24]。

1.3近紅外光譜分析檢測(cè)技術(shù)

近紅外光譜是介于可見(jiàn)光譜和中紅外光譜之間的電磁波，波長(zhǎng)范圍在780～2 526 nm之間，它不會(huì)對(duì)人體有任何傷害，也不會(huì)對(duì)周圍的環(huán)境造成污染，同時(shí)這項(xiàng)技術(shù)對(duì)大多數(shù)樣品不需要進(jìn)行預(yù)處理就可以直接測(cè)量，真正地做到低成本、快速、實(shí)時(shí)和無(wú)損測(cè)量[25]。2002年，F(xiàn)arid首次提出利用近紅外光譜可以解決聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)法和酶聯(lián)免疫法在轉(zhuǎn)基因農(nóng)產(chǎn)品檢測(cè)中所存在的問(wèn)題[26]。

閆靈采集了金龍魚等6個(gè)品牌的菜籽油，利用近紅外光譜儀對(duì)117份樣品進(jìn)行了全譜段的光譜采集，結(jié)果表明，基于近紅外光譜的轉(zhuǎn)基因菜籽油快速鑒別方法是可行的[27]。翟亞鋒等對(duì)不同品種的9個(gè)轉(zhuǎn)基因小麥樣品種子分別建立了鑒別模型，通過(guò)近紅外光譜儀掃描獲得光譜數(shù)據(jù)，結(jié)果表明該方法具有較高的鑒別準(zhǔn)確度，可以作為一種快速無(wú)損的轉(zhuǎn)基因小麥種子鑒別方法[28]。吳江等利用近紅外光譜分析儀對(duì)大豆掃描得到反射光譜，應(yīng)用主成分分析結(jié)合反向傳播（backpropagation，簡(jiǎn)稱BP）神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)法分析鑒別，結(jié)果說(shuō)明近紅外光譜結(jié)合主成分分析和BP神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)法能無(wú)損快速準(zhǔn)確地鑒別轉(zhuǎn)基因大豆[29]。芮玉奎等以轉(zhuǎn)基因棉花及對(duì)照作為試驗(yàn)材料，利用近紅外光譜儀對(duì)轉(zhuǎn)基因棉花及對(duì)照根際土壤和非根際土壤中的全氮和有機(jī)質(zhì)進(jìn)行分析研究，同時(shí)利用標(biāo)準(zhǔn)的方法進(jìn)行對(duì)比檢測(cè)，結(jié)果表明近紅外檢測(cè)樣品的結(jié)果與標(biāo)準(zhǔn)方法結(jié)果無(wú)明顯的差別[30]。唐麗娟等運(yùn)用傅里葉變換紅外光譜儀（FTIR）技術(shù)分析過(guò)量表達(dá)HPS/PHI轉(zhuǎn)基因與野生型天竺葵在甲醛脅迫下體內(nèi)各物質(zhì)含量的變化規(guī)律及光譜表征，結(jié)果表明FTIR可作為一種鑒定有甲醛光合同化途徑的轉(zhuǎn)基因天竺葵與野生型天竺葵表型差異的新技術(shù)[31]。

1.4生物傳感器檢測(cè)技術(shù)

生物傳感器是利用細(xì)胞、組織、酶或免疫制劑等生物識(shí)別元件的特異性生物化學(xué)反應(yīng)，借助光、電等各種信號(hào)對(duì)化學(xué)物質(zhì)進(jìn)行檢測(cè)的一類裝置[32]。該技術(shù)具有高靈敏度、高特異性、實(shí)時(shí)和快速等優(yōu)點(diǎn)，在環(huán)境檢測(cè)、食品和發(fā)酵等方面得到了廣泛的應(yīng)用[33-35]。近年來(lái)，隨著轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品逐漸走入人們的生活及生物產(chǎn)業(yè)的迅猛發(fā)展，生物傳感器在轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品檢測(cè)方面也發(fā)揮了越來(lái)越重要的作用。王學(xué)亮等利用DNA電化學(xué)生物傳感器對(duì)外源草甘膦乙酰轉(zhuǎn)移酶基因片段進(jìn)行檢測(cè)，檢出限是0.032 nmol/L[36]。許凱等利用DNA電化學(xué)生物傳感器定量檢測(cè)根癌農(nóng)桿菌終止子基因片段，檢出限是0081 nmol/L[37]。茹柿平以轉(zhuǎn)基因作物中常見(jiàn)的CrylAb蛋白為檢測(cè)對(duì)象，利用電化學(xué)免疫生物傳感器技術(shù)實(shí)現(xiàn)了對(duì)CrylAb蛋白的定量檢測(cè)[38]。王健通過(guò)研究表明，DNA生物傳感器對(duì)NPT-[QX（Y15]Ⅱ[QX）]基因中特異片段的準(zhǔn)確檢測(cè)可作為一種通用方法應(yīng)用于許多轉(zhuǎn)基因植物的快速鑒定[39]。肖守斌建立的表面等離子共振生物傳感檢測(cè)系統(tǒng)能夠靈敏、快速、簡(jiǎn)單地用于轉(zhuǎn)基因玉米的檢測(cè)[40]。

目前生物傳感器的應(yīng)用受到穩(wěn)定性、重現(xiàn)性和使用壽命的限制，再加上轉(zhuǎn)基因生物成分的復(fù)雜性，使得實(shí)現(xiàn)商業(yè)化的生物傳感器數(shù)量受到制約。但隨著計(jì)算機(jī)技術(shù)、微制造技術(shù)和生物材料的不斷發(fā)展，生物傳感器技術(shù)在轉(zhuǎn)基因成分檢測(cè)領(lǐng)域的應(yīng)用會(huì)越來(lái)越廣泛。

1.5生物芯片檢測(cè)技術(shù)

所謂生物芯片是指采用微加工技術(shù)在玻璃、尼龍膜等固體材料上構(gòu)建微型生物化學(xué)分析系統(tǒng)，從而對(duì)細(xì)胞、核酸片段、蛋白質(zhì)、糖類及脂類等進(jìn)行準(zhǔn)確、快速和高通量的檢驗(yàn)。按照生物芯片上固化材料的不同，可分為蛋白質(zhì)芯片、基因芯片、組織芯片和細(xì)胞芯片等。汪琳等建立的對(duì)Cry1Ac蛋白、植酸酶蛋白、Cry1Ah蛋白等3種轉(zhuǎn)基因成分的蛋白芯片檢測(cè)技術(shù)，具有較高的靈敏性、特異性和可靠性[41]。武海斌等采用基因芯片技術(shù)結(jié)合多重PCR，能夠在l張芯片上同時(shí)有效地檢測(cè)及鑒定7種轉(zhuǎn)基因玉米，大大提高了檢測(cè)的準(zhǔn)確率和效率[42]。劉烜等利用基因芯片技術(shù)對(duì)轉(zhuǎn)基因玉米中相關(guān)轉(zhuǎn)基因成分的研究表明，此項(xiàng)技術(shù)的檢測(cè)靈敏度可達(dá)到01%[43]。周萍萍等建立的轉(zhuǎn)基因大豆基因芯片檢測(cè)技術(shù)，對(duì)CaMV 35S啟動(dòng)子、NOS終止子和外源基因[WTBX][STBX]CP4EPSPS[WTBZ][STBZ]的檢測(cè)靈敏度均達(dá)到0.45%[44]。

生物芯片技術(shù)在轉(zhuǎn)基因成分檢測(cè)中所發(fā)揮的作用越來(lái)越受到人們的重視，但還需要依賴生物基因數(shù)據(jù)庫(kù)的不斷建立和完善，依賴于該技術(shù)可靠性和特異性的不斷提高，才能夠在以后的轉(zhuǎn)基因成分檢測(cè)中發(fā)揮更大的作用。

1.6蛋白質(zhì)檢測(cè)技術(shù)

1.6.1酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定（ELISA）法

利用抗原抗體反應(yīng)，對(duì)樣品中的蛋白質(zhì)進(jìn)行定性或定量檢測(cè)。王新桐等采用雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附法定量檢測(cè)轉(zhuǎn)基因棉花中新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶（NPT Ⅱ）基因，結(jié)果表明該方法具有良好的應(yīng)用價(jià)值和應(yīng)用前景[45]。劉志浩等采用雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附法定量檢測(cè)轉(zhuǎn)基因玉米中膦絲菌素乙酰轉(zhuǎn)移酶（PAT）基因，結(jié)果表明該方法對(duì)轉(zhuǎn)基因玉米中的PAT蛋白能夠進(jìn)行準(zhǔn)確、特異和有效的檢測(cè)[46]。

1.6.2蛋白質(zhì)印跡（Western Blot）雜交法

利用Western Blot分子雜交技術(shù)特異性檢測(cè)目的蛋白質(zhì)，它可以確定一個(gè)樣品中是否含有低于或高于一定水平的目標(biāo)蛋白質(zhì)，特別適合不溶性蛋白質(zhì)的檢測(cè)和分析。楊爍等采用Western Blot分子雜交技術(shù)對(duì)轉(zhuǎn)基因水稻中的HPT蛋白質(zhì)進(jìn)行分析，結(jié)果表明只需要單粒種子的1/10就可以確定是否含有HPT蛋白質(zhì)成分[47]。蘭金蘋等采用Western Blot分子雜交技術(shù)對(duì)NPTⅡ蛋白質(zhì)在轉(zhuǎn)基因水稻中的表達(dá)特征進(jìn)行了研究，結(jié)果表明苗期葉片中這種蛋白質(zhì)的含量約為其鮮質(zhì)量的0.08‰[48]，該蛋白質(zhì)在水稻不同的發(fā)育時(shí)期、不同的器官和組織中表達(dá)量有所不同。

2討論

PCR和LAMP這2種檢測(cè)技術(shù)在實(shí)際運(yùn)用中，存在引物設(shè)計(jì)的特異性、核酸的提取質(zhì)量、產(chǎn)品在加工過(guò)程中產(chǎn)生的抑制劑等問(wèn)題，在一定程度上限制了這2種檢測(cè)技術(shù)的應(yīng)用。蛋白質(zhì)檢測(cè)技術(shù)的問(wèn)題是由于蛋白質(zhì)在深加工過(guò)程中容易失去抗原性，此項(xiàng)技術(shù)也不適合深加工轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品的檢測(cè)。近紅外光譜技術(shù)、生物傳感器技術(shù)和生物芯片要求技術(shù)含量高，操作比較復(fù)雜，數(shù)據(jù)分析也比較麻煩。綜上所述，在進(jìn)行轉(zhuǎn)基因成分檢測(cè)時(shí)，無(wú)論采用哪一種方法，都需要針對(duì)轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品進(jìn)行大量的試驗(yàn)，弄清楚如何提取DNA、如何建立反應(yīng)體系、如何進(jìn)行分析和描述等工作。綜合運(yùn)用基因水平、蛋白質(zhì)水平的檢測(cè)技術(shù)，綜合運(yùn)用定性和定量檢測(cè)技術(shù)。從而為轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品的研究和安全評(píng)估提供可靠的技術(shù)保障體系。

隨著轉(zhuǎn)基因技術(shù)的發(fā)展，將來(lái)會(huì)有越來(lái)越多的轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品走進(jìn)人們的生活，對(duì)轉(zhuǎn)基因成分的檢測(cè)技術(shù)也提出了更高的要求，向著快捷、簡(jiǎn)便、靈敏、高效的方向發(fā)展，同時(shí)向著一次性、可視性的轉(zhuǎn)基因成分檢測(cè)方向發(fā)展。

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