巴西甘蔗DNA導(dǎo)入甘蔗03—75品系的SRAP分子驗證

呂平+檀小輝+張繼+韋麗君+黃秋偉+金剛+黃顯雅

摘 要：利用SDS方法提取純化供體巴西甘蔗B8總DNA，通過懸浮共培養(yǎng)方法將巴西甘蔗DNA轉(zhuǎn)入到桂熱甘蔗03-75品系中，篩選獲得轉(zhuǎn)化的甘蔗植株。對轉(zhuǎn)化植株、供體和受體進行SRAP分子驗證。結(jié)果表明，用瓊脂糖凝膠電泳從112對引物組合中篩選出13對擴增多態(tài)性好、條帶清晰、穩(wěn)定好的引物組合，再通過非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳進一步篩選出4對較好引物組合，選擇引物M5E8組合對巴西甘蔗、轉(zhuǎn)化植株和桂熱甘蔗03-75品系進行SRAP檢測，轉(zhuǎn)化植株檢出帶有供體差異條帶，證明巴西甘蔗DNA導(dǎo)入了桂熱甘蔗03-75品系，引起了甘蔗基因組的變化，說明通過懸浮共培養(yǎng)方法進行甘蔗總DNA導(dǎo)入是可行的。

關(guān)鍵詞：甘蔗 懸浮共培養(yǎng) SRAP

甘蔗是我國重要的糖料作物和能源作物。中國蔗區(qū)主要分布在廣西、云南、廣東等12個省（自治區(qū)）[1-5]。廣西是全國最大的蔗糖生產(chǎn)基地，但廣西甘蔗栽培品種單一化嚴(yán)重，長時間推廣新臺糖22號品種，導(dǎo)致品種種性退化、產(chǎn)量下降等嚴(yán)重問題[6-9]。高產(chǎn)、高效甘蔗新種質(zhì)的創(chuàng)新顯得迫在眉睫。長期以來，甘蔗育種采用常規(guī)雜交育種，需要耗費大量人力、物力和財力，且育種周期長、篩選困難。還有另一個重要原因是許多野生甘蔗種質(zhì)（或親緣關(guān)系較遠）與栽培甘蔗之間出現(xiàn)了雜交不親和現(xiàn)象。通過常規(guī)雜交方法將優(yōu)良的性狀轉(zhuǎn)入到甘蔗品種（品系）中難度大。此外，由于廣西氣候因素原因，種植在廣西區(qū)域的甘蔗開花十分困難，經(jīng)過人工技術(shù)調(diào)節(jié)開花難度大，且開花后花粉活力很弱，雜交育種非常困難，目前廣西甘蔗雜交育種主要在海南南繁育種基地進行，給本地的育種帶來許多不便，育種受到一定的障礙。隨著現(xiàn)代分子育種技術(shù)的快速發(fā)展，為遠緣種質(zhì)的創(chuàng)新利用開辟了新的途徑。在1974年，周光宇等人[10，11]在調(diào)查了植物遠緣雜交廣泛實踐的基礎(chǔ)上，提出了植物遠緣雜交存在著染色體水平以下的DNA片段雜交假說，在此基礎(chǔ)上進行了外源總DNA導(dǎo)入農(nóng)作物技術(shù)研究，達到種質(zhì)創(chuàng)新和改良品種的目的，外源總DNA導(dǎo)入技術(shù)已在水稻、大豆、玉米、小麥、花生和煙草等作物品種改良中得到了應(yīng)用[12-17]。同時對外源DNA導(dǎo)入后獲得的轉(zhuǎn)化植株進行了分子驗證。倪建福等人通過花粉管通道法將高粱DNA導(dǎo)入普通小麥后，RAPD鑒定表明高粱基因組部分片段整合到小麥染色體中[18]。

研究選擇以巴西甘蔗為供體，桂熱甘蔗03-75品系為受體， 通過懸浮共培養(yǎng)的方法將供體總DNA直接導(dǎo)入受體技術(shù)， 獲得在株型、株高等性狀有差異的類型，利用SRAP技術(shù)對其進行遺傳轉(zhuǎn)化分析，試圖通過生物技術(shù)手段將巴西甘蔗總DNA導(dǎo)入桂熱甘蔗03-75品系創(chuàng)新種質(zhì)，探索甘蔗新的遺傳轉(zhuǎn)化方法的可行性，進一步為高產(chǎn)、高效等甘蔗育種生產(chǎn)提供理論依據(jù)和技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 材料

供體：巴西甘蔗B8品種；受體： 桂熱甘蔗03-75品系。實驗所用到甘蔗品種/品系均來自廣西壯族自治區(qū)亞熱帶作物研究所/廣西農(nóng)墾甘蔗研究所種質(zhì)資源圃。

1.2 方法

1.2.1 DNA提取方法

采用王關(guān)林的SDS提取方法[19]提取新鮮甘蔗葉片的總DNA，瓊脂糖凝膠電泳法與紫外分光光度計法檢測DNA分子的濃度和純度。

1.2.2 懸浮共培養(yǎng)導(dǎo)入法

采用體細胞胚與供體巴西甘蔗B8總DNA懸浮共培養(yǎng)導(dǎo)入方法，具體步驟為：選取長至10～20 cm桂熱甘蔗03-75品系頂芽，消毒滅菌后接種到誘導(dǎo)培養(yǎng)基MS+2，4-D3.5 mg/L + NAA0.1 mg/L上誘導(dǎo)愈傷組織，愈傷組織培養(yǎng)在MS+2，4-D3.0 mg/L+NAA0.1 mg/L上增殖，挑選結(jié)構(gòu)疏松、顏色淡黃的胚性愈傷組織（結(jié)合顯微鏡挑選），搖床震蕩培養(yǎng)，用孔徑50目細胞篩濾去較大孔徑的組織，再用孔徑80～150目的細胞篩濾，得到直徑0.1～0.2 mm的較分散的微小細胞粒。轉(zhuǎn)移至MS+2，4-D1.0 mg/L+NAA0.1 mg/L培養(yǎng)基上，加入B8總DNA（濃度為200 g/mL），在搖床120 rpm的轉(zhuǎn)速進行懸浮共培養(yǎng)，后轉(zhuǎn)至MS+ 6-BA 2.0 mg/NAA0.1 mg/L培養(yǎng)基上分化不定芽，生根移栽，獲得甘蔗轉(zhuǎn)化植株。

1.2.3 SRAP引物、PCR體系與程序及PCR產(chǎn)物電泳

1.2.3.1 引物與PCR反應(yīng)程序、體系

本實驗所用的SRAP引物參考朱弦弦、Li和Quiros等[20，21]，由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成見表1，PCR反應(yīng)程序與反應(yīng)體系見表2、表3。

1.2.3.2 PCR產(chǎn)物電泳

瓊脂糖凝膠電泳檢測

取5 μl PCR產(chǎn)物，加入2 μl 6×Loading Buffer混勻后點樣，進行電泳分離，電泳的參數(shù)為120 v恒壓，EB染色法。

聚丙烯酰胺凝膠電泳

采用6 %的非變性聚丙烯酰胺凝膠，電泳的參數(shù)為180 v恒壓，銀染染色法。

2 結(jié)果與分析

2.1 供體巴西甘蔗B8總DNA提取與純度情況

用紫外分光光度計測定甘蔗總DNA A260/230、A260/280，瓊脂糖凝膠電泳鑒定相對分子量，其純度、濃度鑒定結(jié)果為：純度：A260/230=2.56>2，A260/280=1.95>1.8；濃度：ds =1250 μg/ml。從電泳圖1可以看出 ，DNA沉淀均為白色，通過瓊脂糖凝膠電泳檢測，DNA片段、帶型均一，沒有拖尾現(xiàn)象，說明蛋白雜質(zhì)與酚類物質(zhì)含量少，DNA的純度較高。上述檢測結(jié)果表明，純化后的總DNA溶液純度、濃度符合導(dǎo)入條件，以MS溶液配成相應(yīng)的DNA濃度，低溫保存?zhèn)溆谩?

2.2 轉(zhuǎn)化甘蔗試管苗的形態(tài)表現(xiàn)

轉(zhuǎn)化的植株經(jīng)過培養(yǎng)后與CK相比，其形態(tài)特征有明顯的差異，結(jié)果見圖2。從圖2中可以看出，轉(zhuǎn)化后的植株從葉片、莖粗等特征差異較大，轉(zhuǎn)化的植株葉片濃綠，植株較粗壯，長勢較好。另外，實驗中也發(fā)現(xiàn)有些轉(zhuǎn)化植株的長勢比對照差。說明通過懸浮共培養(yǎng)法將巴西甘蔗B8 DNA導(dǎo)入受體桂熱甘蔗03-75品系后，受體甘蔗發(fā)生了不同程度的變化，這可能是巴西甘蔗的某些基因片段在桂熱甘蔗03-75品系進行了重組整合而發(fā)生了變化。

2.3 SRAP分析

2.3.1 適合SRAP實驗要求的DNA純度

甘蔗基因組DNA質(zhì)量的好壞直接影響后續(xù)的分子生物學(xué)實驗的成敗。采用SDS法提取甘蔗DNA后用核酸測定儀測定所有供試的DNA樣品。本實驗提取的21份甘蔗樣品DNA的濃度介于200 ng/μl到1300 ng/μl之間，21份樣品A260/280的比值均在1.8～2.0之間、A260/230的比值均大于2.0，說明本次實驗提取的甘蔗DNA的質(zhì)量較好，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測，蛋白質(zhì)等雜質(zhì)少，純度較純（見圖3），可以滿足后續(xù)SRAP等分子生物學(xué)的實驗要求。

2.3.2 SRAP引物的篩選

上下游引物搭配組成112對引物組合，先用瓊脂糖凝膠電泳從中篩選出13對擴增多態(tài)性好、條帶清晰、穩(wěn)定好的引物組合（見圖4）。再用6 %的非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳對13對引物組合進行進一步篩選，從中篩選出4對較好引物組合，分別為M4E8、M5E1、M5E8、M6E2。

2.3.3 SRAP圖譜分析

從圖5可以看出（圖示僅標(biāo)注了差異明顯的條帶），甘蔗03-75品系轉(zhuǎn)化植株的SRAP分子標(biāo)記多態(tài)性比較豐富，多態(tài)性有差異條帶的主要集中在50 bp～150 bp范圍間。甘蔗03-75轉(zhuǎn)化植株在①②位置出現(xiàn)了供體巴西甘蔗B8品種特有的而受體甘蔗03-75品系未有條帶。在①位置，編號5、7、12轉(zhuǎn)化植株的條帶強弱與供體巴西甘蔗B8品種一致；在②位置，編號8、9、12、13轉(zhuǎn)化植株的條帶出現(xiàn)比供體巴西甘蔗B8品種條帶更強的條帶；在③位置轉(zhuǎn)化植株出現(xiàn)了供體巴西B8甘蔗品種、受體甘蔗03-75品系都沒有的新條帶；在④位置轉(zhuǎn)化植株出現(xiàn)了條帶顏色更深的加強條帶；在⑤位置受體甘蔗03-75品系有弱條帶而轉(zhuǎn)化植株沒有，出現(xiàn)了缺失條帶。SRAP標(biāo)記結(jié)果表明：通過懸浮共培養(yǎng)方法將巴西甘蔗總DNA導(dǎo)入甘蔗03-75品系后，獲得的甘蔗轉(zhuǎn)化植株可能為巴西甘蔗基因部分片段插入受體甘蔗03-75品系，或缺失了受體甘蔗的基因片段，或出現(xiàn)了供受體未有的新片段，說明巴西甘蔗的DNA導(dǎo)入受體甘蔗后使其基因組發(fā)生了不同程度的重組。

3 討論

植物外源總DNA導(dǎo)入技術(shù)是在20世紀(jì)80年代發(fā)展起來的，并被許多科研工作者發(fā)展應(yīng)用，在水稻、玉米、小麥和煙草等作物取得成功，培育出的許多優(yōu)良品種（系）在生產(chǎn)上已推廣應(yīng)用，取得了良好的經(jīng)濟和社會效益。本實驗通過懸浮共培養(yǎng)法將遠源（或近源）植物的DNA導(dǎo)入作物技術(shù)，該技術(shù)在馬鈴薯上有研究報道，洪亞輝等人[22]利用這一技術(shù)將人參總DNA導(dǎo)入馬鈴薯單細胞，獲得的馬鈴薯后代塊莖中含有人參皂苷RB1，且氨基酸、蛋白質(zhì)含量大幅度提高，而其他性狀并沒有因為塊莖蛋白質(zhì)含量和質(zhì)量的提高而變化，但這一技術(shù)在其他植物還尚未應(yīng)用。本課題組將自選育的優(yōu)良甘蔗03-75品系的胚性愈傷組織直接在巴西甘蔗B8的總DNA進行懸浮培養(yǎng)，其目的是加強某些特殊性狀，特別是加強巴西甘蔗B8的固氮能力，據(jù)楊榮仲等人[23]利用15N同位素稀釋法測定在溫室盆栽條件下巴西甘蔗B8的生物固氮能力，結(jié)果顯示B8平均固氮百分率為26.91 %，而對照種桂糖11號不具固氮能力，對照種ROC16的固氮能力弱，僅為3.51 %。如何能將巴西甘蔗B8的這些優(yōu)良特性導(dǎo)入到甘蔗03-75品系中，篩選優(yōu)良的轉(zhuǎn)化植株，對甘蔗種質(zhì)材料進行創(chuàng)新，從而為更進一步選育新品種做準(zhǔn)備。通過本試驗有力的證實了將巴西甘蔗B8的總DNA通過該方法導(dǎo)入甘蔗03-75品系是可行的，轉(zhuǎn)化的植株不僅在形態(tài)上有差異，還在DNA水平上的SRAP（相關(guān)序列擴增多態(tài)性）有遺傳多態(tài)性。SRAP是一種基于PCR技術(shù)的新型的分子標(biāo)記，由美國加州大學(xué)蔬菜作物系Li與Quiros博士[21]于2001年提出的，具有簡便、穩(wěn)定、中等產(chǎn)率和容易得到選擇條帶序列的特點，在構(gòu)建分子遺傳圖譜、遺傳多樣性研究及種質(zhì)資源的鑒定、作物起源與進化關(guān)系研究以及作物目標(biāo)性狀連鎖標(biāo)記研究上都有廣泛的應(yīng)用。SRAP結(jié)果表明，甘蔗03-75品系的轉(zhuǎn)化植株不同引物的DNA擴增產(chǎn)物，顯示出受體對照甘蔗具有的DNA條帶在轉(zhuǎn)化甘蔗中大部分出現(xiàn)，總體表現(xiàn)為轉(zhuǎn)化后的甘蔗與受體對照甘蔗03-75品系具有大部分的相似性，說明轉(zhuǎn)化后甘蔗與受體對照的同源性很高，轉(zhuǎn)化后的甘蔗遺傳了受體對照甘蔗的大部分基因。另外，在轉(zhuǎn)化的甘蔗還出現(xiàn)了新的條帶，轉(zhuǎn)化甘蔗比受體對照甘蔗缺失了條帶或插入了新的條帶，兩者的基因組上存在分子水平遺傳差異。此外轉(zhuǎn)化后的甘蔗與巴西甘蔗B8擴增出一些相同大小的DNA片段，而相應(yīng)的受體對照甘蔗03-75品系沒有擴增出此片段，這從分子角度進一步證實了巴西甘蔗B8的某些DNA片段在轉(zhuǎn)化甘蔗03-75品系基因組里有部分的重組或整合，或是轉(zhuǎn)化甘蔗已轉(zhuǎn)入部分供體的性狀。

現(xiàn)階段，甘蔗優(yōu)良的種質(zhì)材料非常稀缺，遠不能滿足當(dāng)前生產(chǎn)的需要。為了拓寬優(yōu)良基礎(chǔ)材料、豐富甘蔗種質(zhì)資源，通過外源DNA 導(dǎo)入的方法引入遠緣（近緣）物種有益性狀的基因，克服遠緣雜交不親和、雜種不育等問題，為創(chuàng)新甘蔗種質(zhì)資源提供了一種非常有效、可行的途徑，這在普通的常規(guī)雜交育種上是很難實現(xiàn)的。這不僅為以后選育優(yōu)良的甘蔗新品種（品系）提供良好的育種材料，同時進一步為甘蔗分子育種奠定基礎(chǔ)并提供參考價值。

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