脂肪干細(xì)胞復(fù)合真皮脫細(xì)胞基質(zhì)修復(fù)兔關(guān)節(jié)軟骨缺損的實驗研究

舒雄，鄭蕊，杰永生，陳磊，靳少鋒，綦惠，孫磊

脂肪干細(xì)胞復(fù)合真皮脫細(xì)胞基質(zhì)修復(fù)兔關(guān)節(jié)軟骨缺損的實驗研究

舒雄，鄭蕊，杰永生，陳磊，靳少鋒，綦惠，孫磊

目的探討脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞（ADSCs）復(fù)合小牛真皮脫細(xì)胞基質(zhì)（ADM）參與修復(fù)兔膝關(guān)節(jié)軟骨缺損的可行性。

脂肪干細(xì)胞； 真皮脫細(xì)胞基質(zhì)； 支架； 關(guān)節(jié)軟骨； 組織工程

關(guān)節(jié)軟骨損傷是臨床常見病和多發(fā)病，由于關(guān)節(jié)軟骨是無血管、淋巴管及神經(jīng)的單一結(jié)締組織，營養(yǎng)來源于周圍關(guān)節(jié)滑液的滋潤，一旦損傷其再生修復(fù)能力十分有限。目前臨床治療方法主要包括軟骨下鉆孔[1]、損傷軟骨面給予微骨折刺激局部組織修復(fù)[2]、骨膜與軟骨膜移植以及軟骨移植[3]等，上述方法均有其局限性。近些年來，組織工程的技術(shù)為軟骨缺損的治療提供了新的途徑，2001 年，Zuk等[4-5]從人體脂肪抽取物中成功分離出了脂肪干細(xì)胞，它具有與骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞類似的特性，具有來源豐富、擴(kuò)增能力強(qiáng)，同時可以多向誘導(dǎo)分化，逐漸成為組織工程領(lǐng)域的研究熱點。天然支架在組織工程中起支撐引導(dǎo)干細(xì)胞增殖、分化并提供三維構(gòu)建模板的作用。異體小牛真皮脫細(xì)胞基質(zhì)（acellular dermal matrix，ADM）是一種細(xì)胞外基質(zhì)[6]，它具有細(xì)胞外基質(zhì)的共性，經(jīng)過特殊工藝脫掉表皮層，有效地去除了引起免疫排斥反應(yīng)的細(xì)胞表面抗原，植入體內(nèi)后生物相容性好，為脂肪干細(xì)胞提供良好的支架，促進(jìn)脂肪干細(xì)胞增生和分化，促進(jìn)類軟骨細(xì)胞的形成。本研究采用小牛 ADM 復(fù)合脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞（adipose-derived stem cells，ADSCs）進(jìn)行體外復(fù)合培養(yǎng)，觀察其修復(fù)兔關(guān)節(jié)軟骨缺損的效果。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 主要試劑 脂肪組織來源于 6 周齡新西蘭大白兔，抽吸部位為腹部，術(shù)后無菌保存。I 型膠原酶，胰酶、低糖 DMEM 和 FBS 購自美國Gibco 公司；抗人 CD29、CD44、CD31、CD105、CD34、CD45、CD49d、CD106、HLA-DR 抗體購自美國 BD 公司；II 型膠原小鼠抗兔單克隆抗體購自美國 Abcam 公司；免疫組化 SP 試劑盒購自福州邁新公司。

1.1.2 儀器 CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱為美國 Shellab 公司產(chǎn)品；往復(fù)式真空泵為上海益化真空設(shè)備有限公司產(chǎn)品；真空冷凍干燥機(jī)為美國 Virtis 公司產(chǎn)品；倒置相差顯微鏡為日本 Olympus 公司產(chǎn)品；流式細(xì)胞儀為美國 BD 公司產(chǎn)品；掃描電鏡為日本Hitachi 公司產(chǎn)品。

1.1.3 實驗動物 6 周齡新西蘭大白兔 24 只，體重（2.0 ± 0.5）kg，雌雄不限，由北京市創(chuàng)傷骨科研究所動物實驗中心提供，SPF 級，實驗過程中對動物的處置符合動物倫理學(xué)要求。

1.2 方法

1.2.1 ADSCs 的分離、培養(yǎng) 無菌條件下取脂肪組織，將脂肪組織在 PBS 中清洗 3 次，徹底去除紅細(xì)胞與組織碎片。加入預(yù)熱的 0.1% 的 I 型膠原酶溶液，置 37 ℃ 水浴振蕩消化 1 h。300×g 離心 5 min，去除上層脂肪細(xì)胞與膠原酶溶液。加入適量含 10% 牛血清白蛋白（BSA）的 DMEM 重懸細(xì)胞，經(jīng) 100 μm 細(xì)胞篩過濾，調(diào)整合適的細(xì)胞密度接種至細(xì)胞培養(yǎng)瓶，于 37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)[7]。48 h 后換液，去除未貼壁細(xì)胞及殘留的紅細(xì)胞。此后每 3 天換液。當(dāng)細(xì)胞達(dá)到 80%融合時，用 0.25% 的胰酶消化貼壁細(xì)胞，按 1∶2進(jìn)行傳代，倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞生長及形態(tài)變化特征。

1.2.2 ADSCs 的鑒定和多向誘導(dǎo)分化 將 P1 代ADSCs 經(jīng)胰酶消化后，調(diào)整細(xì)胞濃度為 106個/ml，與 FITC 和 PE 標(biāo)記的抗體冰上避光孵育 30 min，用含 1% BSA的 PBS 重懸細(xì)胞，流式細(xì)胞術(shù)分析其表面特異性抗原 CD29-PE、CD44-FITC、CD31-PE、CD34-PE、CD45-FITC、CD49d-PE、CD106-FITC、CD105-PE 及 HLA-DR-FITC 的表達(dá)情況。

1.2.3 小牛 ADM 的制備 選用新生小牛，活殺后，將背部毛發(fā)剪短，用取皮刀切取厚度為 1 mm的真皮層，清洗后浸入 0.5 mol/L 的乙酸中浸泡2 h，PBS 清洗后，切成 1 cm×1 cm 的正方形小塊。將小牛真皮用 0.1% 十二烷基硫化鈉（SDS）在室溫中超聲 4 h 后用 PBS 溶液洗滌 20 次，流水過夜（10 h）沖洗。低溫凍干 24 h 后備用。常規(guī) HE 染色，觀察脫細(xì)胞效果。浸入 0.5% 胰蛋白酶，37 ℃ 條件下超聲 2 h，再用蒸餾水清洗 20 次，0.1% 甲醛浸泡，交聯(lián) 1 h，流水沖洗 50 h，低溫凍干 24 h，掃描電鏡觀察膠原纖維的排列及空隙大小等物理特征，60Co 照射后備用。

1.2.4 ADSCs與 ADM 復(fù)合 將培養(yǎng)的 ADSCs消化后制成細(xì)胞懸液濃度，細(xì)胞密度調(diào)整為 2×107個/ml。向 ADM 材料表面緩慢滴加 1.5 ml 細(xì)胞懸浮液至完全覆蓋支架，放在 37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中靜置 48 h 備用。

1.2.5 實驗分組及方法 選取健康成年新西蘭大白兔 24 只，編號后隨機(jī)分 3 組，飽和硫化鈉脫去兔膝關(guān)節(jié)上下約 5 cm 兔毛；異戊巴比妥鈉3 mg/kg 耳緣靜脈麻醉。常規(guī)消毒、鋪無菌巾。沿髕韌帶內(nèi)側(cè)做一長約 5 cm 的切口，進(jìn)入關(guān)節(jié)腔后在股骨髁間窩用 4 mm 環(huán)鉆打孔關(guān)節(jié)軟骨，見創(chuàng)面少許滲血為止。A 組在孔內(nèi)外科手術(shù)縫合植入ADSCs 復(fù)合 ADM，B 組在孔內(nèi)外科手術(shù)縫合只植入 ADM，C 組缺損處不作任何處理，無菌鹽水沖洗關(guān)節(jié)腔，仔細(xì)分層縫合。術(shù)后籠內(nèi)自由飼養(yǎng)，肌注青霉素 1 周預(yù)防感染。

1.2.6 觀測指標(biāo) ①一般情況：動物模型制備后，觀察三組大白兔存活及飲食等情況。②大體觀察：于模型制備后 12 周，三組大體觀察創(chuàng)面愈合情況。③HE 染色：術(shù)后標(biāo)本經(jīng)甲醛固定、脫鈣、石蠟包埋、沿矢狀面垂直于缺損區(qū)進(jìn)行切片，蘇木精-伊紅染色 5 min，鏡下觀察。

1.2.7 II 型膠原免疫組化染色 應(yīng)用 II 型膠原單克隆抗體行免疫組織化學(xué)染色，一抗為小鼠抗兔II 型膠原單克隆抗體，二抗為辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗鼠多克隆抗體，采用 3,3-二氨基聯(lián)苯（DAB）染色。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 ADSCs 形態(tài)觀察和鑒定

原代分離培養(yǎng)新西蘭大白兔 ADSCs，貼壁24 h 后細(xì)胞呈圓形狀，48 h 后細(xì)胞呈現(xiàn)長梭形和多角形，72 h 后細(xì)胞數(shù)量明顯增加，排列密集（圖 1）。第 4 代 ADSCs 通過流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果顯示，脂肪干細(xì)胞表型呈 CD44+，CD105+，CD49d+，CD106-，CD31-，CD29+，CD34-，CD45-，HLA-DR-（圖 2）。

2.2 支架細(xì)胞相容性觀察

脫細(xì)胞、交聯(lián)后，HE 染色顯示真皮基質(zhì)中細(xì)胞幾乎無殘留，纖維結(jié)構(gòu)完整（圖 3A）。ADSCs接種 48 h 后，大量增殖的細(xì)胞呈片層貼附于支架上，細(xì)胞形態(tài)飽滿，表面可見微絨毛和分泌現(xiàn)象（圖 3B）。

2.3 大體觀察

實驗的新西蘭大白兔于手術(shù)后 12 周處死，支架復(fù)合 ADSCs 組缺損處幾乎填充完全，修復(fù)組織色澤、質(zhì)地同正常關(guān)節(jié)軟骨，表面光滑，與周圍正常軟骨組織界限模糊，結(jié)合緊密（圖 4A）。單純支架組缺損部分修復(fù)表面欠平整，凸凹不平，交界區(qū)界限明顯（圖 4B）。對照組缺損內(nèi)無軟骨修復(fù)組織，部分有少量修復(fù)，不起填充作用（圖 4C）。

圖1 ADSCs 形態(tài)學(xué)觀察（倒置相差顯微鏡×40）（A：24 h；B：48 h；C：72 h）Figure 1 Morphology observation of the hADSCs (Inverted phase contrast microscope×40) (A:24 h; B:48 h; C:72 h)

圖2 ADSCs 表面特異性蛋白檢測Figure 2 Phenotype analysis of ADSCs

圖3 掃描電鏡觀察 ADSCs 在 ADM 上黏附情況（×500）（A：脫細(xì)胞和交聯(lián)后結(jié)構(gòu)；B：接種細(xì)胞后 48 h）Figure 3 Scanning electron microscope observation of cell attachment of ADM (×500) (A:Scaffold after acellular and crosslinked structure; B:ADSCs implanted on the scaffold for 48 hours)

2.4 組織學(xué)觀察

HE 染色顯示，支架復(fù)合 ADSCs 組再生組織中支架已被吸收，細(xì)胞排列較為規(guī)律，在軟骨下可見連續(xù)的新骨形成，并與再生的軟骨整合（圖 5A）。單純支架組再生組織中支架大部分吸收，富含纖維軟骨（圖 5B）。對照組軟骨缺損處因無修復(fù)組織或修復(fù)組織太少，僅見少量的纖維組織（圖 5C）。

2.5 II 型膠原表達(dá)變化的免疫組合檢測

II 型膠原免疫組化染色檢測顯示，支架復(fù)合ADSCs 組再生組織中支架已被吸收，再生的軟骨是陽性（圖 6A）。單純支架組再生組織中支架大部分吸收，再生的軟骨是陽性，但不完整（圖 6B）。軟骨損處因無修復(fù)組織，再生軟骨表達(dá)陰性（圖 6C）。

圖4 三組術(shù)后創(chuàng)面大體觀察（A：支架復(fù)合 ADSCs 組；B：單純支架組；C：對照組）Figure 4 General observation of wounds in 3 groups after operation (A:Scaffold combine with ADSCs group; B:Scaffold group; C:Control group)

圖5 術(shù)后組織學(xué) HE 染色觀察（×10）（A：支架復(fù)合 ADSCs 組；B：單純支架組；C：對照組）Figure 5 Histology observation after operation (×10) (A:Scaffold combine with ADSCs group; B:Scaffold group; C:Control group)

圖6 術(shù)后 II 型膠原表達(dá)的 IHC 觀察（×40）（A：支架復(fù)合 ADSCs 組；B：單純支架組；C：對照組）Figure 6 Expression of type II collagen after operation (×40) (A:Scaffold combine with ADSCs group; B:Scaffold group; C:Control group)

3 討論

關(guān)節(jié)軟骨缺少血液供應(yīng)，其自身修復(fù)能力十分有限。目前軟骨損傷的治療方法雖然在短期內(nèi)可以緩解患者疼痛，但長期治療效果都不甚理想。近年來，再生醫(yī)學(xué)和組織工程技術(shù)的發(fā)展，為軟骨損失修復(fù)提供了新的思路和技術(shù)，并在世界范圍內(nèi)有了初步應(yīng)用。

誘導(dǎo)成體干細(xì)胞向軟骨分化，構(gòu)建組織工程軟骨修復(fù)是目前組織工程領(lǐng)域的研究熱點。其中骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（mesenchymal stem cells，MSCs）是研究較多的成體干細(xì)胞。但由于骨髓穿刺給患者帶來一定痛苦，而且細(xì)胞獲得量很小，因此在應(yīng)用中受到一定的限制[8]。ADSCs 與 MSCs 相比，具有以下優(yōu)勢[9-12]：①ADSCs 在培養(yǎng)時間較長時具有更強(qiáng)的基因穩(wěn)定特征；②脂肪來源更充足，并且取材方便；③衰老率低、增殖率強(qiáng)。真皮脫細(xì)胞基質(zhì)（ADM）是典型的脫細(xì)胞基質(zhì)支架的一種，有良好的生物相容性，無抗原性，通過對 ADM 支架材料的性狀改善及表面修飾可以彌補(bǔ)其性能上的缺陷，使其更適合種子細(xì)胞的生長，用于影響細(xì)胞分化、增殖、黏附、形態(tài)發(fā)生和表型表達(dá)等生物學(xué)過程。

我們在本實驗中，首先用酶消化法結(jié)合密度梯度離心分離培養(yǎng) ADSCs，我們發(fā)現(xiàn)多次 PBS 的清洗和 0.1% 的 I 膠原酶處理，可以很好地分離脂肪組織的脂肪干細(xì)胞，37 ℃ 恒溫?fù)u床，間隔 1 h，也能有效分離 ADSCs 且更完全；脂肪組織獲取量、培養(yǎng)液成分以及消化傳代等因素同樣對細(xì)胞的分離純化有影響，但最佳分離培養(yǎng)方法仍需要進(jìn)一步探討。同時，Wen 等[13]將 ADSCs 接種到兔軟骨缺損處，3個月后發(fā)現(xiàn)缺損處充滿了透明軟骨，并且 II 型膠原高度表達(dá)，說明了其能有效修復(fù)軟骨損傷，為我們將 ADSCs 作為修復(fù)兔關(guān)節(jié)軟骨缺損的種子細(xì)胞提供理論依據(jù)。本研究中我們擬不采用在支架中添加生長因子的技術(shù)路線，因為生長因子容易失活以及價格昂貴，在臨床實際應(yīng)用中限制較多。通過修飾交聯(lián)制備小牛 ADM 作為理想的細(xì)胞載體，通過復(fù)合 ADSCs 誘導(dǎo)類軟骨細(xì)胞，初步在動物實驗中證實修復(fù)關(guān)節(jié)軟骨缺損的有效性。

以上結(jié)果證明，脂肪干細(xì)胞具有分化為軟骨細(xì)胞功能性潛能，與小牛ADM 復(fù)合可以大大提高修復(fù)效率，是一種理想的供體細(xì)胞來源，為關(guān)節(jié)軟骨的細(xì)胞治療開辟新的途徑。但目前該研究還存在一定局限性，雖然在這項研究中做了一些臨床前試驗，但兔子不是直立行走的動物，膝關(guān)節(jié)的結(jié)構(gòu)和人類差異較大。復(fù)合載體對比格犬的關(guān)節(jié)軟骨損傷的修復(fù)情況需要進(jìn)一步驗證，同時，ADSCs 的進(jìn)一步分化實驗以及分子細(xì)胞學(xué)研究及其在修復(fù)中的調(diào)動機(jī)制、修復(fù)機(jī)制也有待闡明。

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Effect of adipose-derived stem cells combine with acellular dermal matrix in repair of rabbit articular cartilage defects

SHU Xiong,ZHENG Rui,JIE Yong-sheng,CHEN Lei,JIN Shao-feng,QI Hui,SUN Lei

ObjectiveTo evaluate the healing behavior of rabbits articular cartilage defects repaired with tissue engineered cartilage constructed by the calf acellular dermal matrix (ADM) seeded with rabbit adipose derived stem cells (ADSCs).MethodsRabbit ADSCs were isolated by enzyme,cultured and expanded from subcutaneous adipose tissue.FACS and multi-lineage differentiation were used to characterize the cultured stem cells.Calf epidermis was prepared by decelluarizing,cross-linking and lyophilizing to calf ADM which reached a certain number and then seeded in ADM to obtain cell scaffold complexes.24 New Zealand white rabbits were divided into A,B and C groups randomly.Then engineered cartilage was surgically sutured cartilage defect position of rabbits in the group A.ADM was surgically sutured for the group B and nothing for the group C.The rabbits were killed in the 12th week.Restored tissues were evaluated using naked eyes,histology.ResultsRabbit ADSCs were isolated and identified successfully.After modification,the surface of ADM was smooth with uniform pores.In the group A,articular cartilage defects of the rabbits were filled with chondrocyte-like tissue in which cells were positive of HE staining and type II-collagen either in expression.In the group B,the defect was filled with the fibrous tissue.No tissue was found in the group C.ConclusionThe new calf ADM scaffolds possesses a good biocompatibility with rabbit ADSCs.The complex of ADSCs and ADM after cartilage induction can be used to repair articular cartilage defects,which has the potential to substitute for the normal cartilage.

Adipose-derived stem cells; Acellular dermal matrix; Scaffolds; Articular cartilage; Tissue engineering

s:SUN Lei,Email:dr_sunlei@263.net; QI Hui,Email:kellyqhqh2002@163.com

首都衛(wèi)生發(fā)展科研專項（首發(fā) 2011-1006-01）；北京市科技新星計劃（H013610310113）

100035 北京市創(chuàng)傷骨科研究所/北京積水潭醫(yī)院

孫磊，Email：dr_sunlei@263.net；綦惠，Email：kellyqhqh2002@ 163.com

2016-12-28

10.3969/j.issn.1673-713X.2017.02.008

方法取自體新西蘭兔的脂肪組織，采用酶消化分離培養(yǎng)ADSCs 并傳代，倒置相差顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)，F(xiàn)ACS 檢測細(xì)胞表面特異性表達(dá)以鑒定細(xì)胞，行成脂和成骨誘導(dǎo)鑒定。小牛真皮通過脫細(xì)胞、交聯(lián)和凍干制備小牛 ADM，ADSCs 達(dá)到一定數(shù)量后接種于 ADM 得到細(xì)胞支架復(fù)合物。24 只新西蘭大白兔隨機(jī)分 A、B、C 共三組，A 組關(guān)節(jié)軟骨缺損處外科縫合細(xì)胞支架復(fù)合物，B 組軟骨缺損處外科縫合 ADM，C 組軟骨缺損不做任何處理。分別于術(shù)后第 12 周處死動物，修復(fù)處行大體、組織學(xué)檢測。

結(jié)果成功分離鑒定新西蘭兔的脂肪干細(xì)胞。經(jīng)重塑后真皮脫細(xì)胞基質(zhì)支架材料表面光滑、孔隙均勻。ADSCs 與 ADM復(fù)合后，缺損處類軟骨組織填充，修復(fù)區(qū)表面光滑；II 型膠原免疫組化顯示，復(fù)合支架已被吸收，再生的軟骨是陽性。

結(jié)論新型小牛 ADM 支架材料與 ADSCs 生物相容性好，ADSCs 與 ADM 復(fù)合向軟骨誘導(dǎo)后可良好地修復(fù)關(guān)節(jié)軟骨缺損，具有替代正常軟骨的潛力。

Author Affiliation：Beijing Institute of Traumatology and Orthopaedics,Beijing 100035,China